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Article de méthode

Ingénierie de capteurs de protéines intracellulaires dans des cellules de mammifères

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DOI :

10.3791/60878

⸱

28 avril 2020

 ,  ,  , 
1Istituto Italiano di Tecnologia, 2Synthetic Biology Center, Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour l’ingénierie d’un ou plusieurs actionneurs-capteurs de protéines intracellulaires génétiquement codés. Le dispositif détecte spécifiquement les protéines cibles grâce aux anticorps intracellulaires (intracorps) et répond en activant la sortie transcriptionnelle du gène. Un cadre général est construit pour remplacer rapidement les intracorps, permettant une détection rapide de toute protéine souhaitée, sans modifier l’architecture générale.

Résumé

Les protéines peuvent fonctionner comme des biomarqueurs d’états pathologiques, tels que les maladies neurodégénératives, les infections ou les syndromes métaboliques. L’ingénierie des cellules pour détecter et répondre à ces biomarqueurs pourrait aider à comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents aux pathologies, ainsi qu’à développer de nouvelles thérapies cellulaires. Bien que plusieurs systèmes détectant les protéines extracellulaires aient été développés, il manquait un cadre modulaire pouvant être facilement remanié pour détecter différentes protéines intracellulaires.

Nous décrivons ici un protocole permettant de mettre en œuvre une plateforme génétique modulaire qui détecte les protéines intracellulaires et active une réponse cellulaire spécifique. Le dispositif fonctionne sur des anticorps intracellulaires ou de petits peptides pour détecter avec une grande spécificité la protéine d’intérêt, déclenchant l’activation transcriptionnelle des gènes de sortie, par le biais d’un module d’actionnement basé sur la protéase TEV (TEVp). La TEVp est une protéase virale qui clive sélectivement les peptides apparentés courts et est largement utilisée en biotechnologie et en biologie synthétique pour sa grande orthogonalité au site de clivage. Plus précisément, nous avons conçu des dispositifs qui reconnaissent et répondent aux biomarqueurs protéiques des infections virales et des maladies génétiques, y compris la huntingtine mutée, la sérine-protéase NS3, les protéines Tat et Nef, pour détecter les infections par la maladie de Huntington, le virus de l’hépatite C (VHC) et le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), respectivement. Il est important de noter que le système peut être adapté à la main pour obtenir le résultat fonctionnel d’entrée-sortie souhaité, tel que des lectures fluorescentes pour les biocapteurs, la stimulation de la présentation de l’antigène pour la réponse immunitaire ou l’initiation de l’apoptose pour éliminer les cellules malsaines.

Introduction

L’étude et les modulations des réponses cellulaires via des circuits génétiques modifiés contrôlables sont des objectifs majeurs en biologie synthétique 1,2,3 pour le développement d’outils prospectifs ayant des applications biologiques ou médicales pertinentes dans le cancer 4, les infections5, les maladies métaboliques6 et l’immunologie7.

La reprogrammation des fonctions cellulaires en réponse à des signaux spécifiques nécessite la conception d’interfaces intelligentes qui relient la détection des changements dynamiques extracellulaires ou intracellulaires (entrées) au traitement en aval, déclenchant des sorties spécifiques soit à des fins de diagnostic (c’est-à-dire les gènes rapporteurs), soit pour recâbler la réponse cellulaire (thérapeutiques). Les entrées détectées par le module de détection peuvent être de petits analytes8, des protéines 9,10,11 ou des microARN 11,12,13, spécifiques de l’apparition ou de la progression d’une maladie. De plus, la régulation de circuits complexes peut être réalisée par le traitement de plusieurs informations d’entrée, augmentant le contrôle étroit de l’expression des transgènes en réponse aux conditions définies 14,15,16. Par exemple, les capteurs basés sur les microARN peuvent identifier des types de cellules spécifiques, tels que les cellules cancéreuses, induisant leur clairance avec l’expression d’un gène apoptotique13. Étant donné que les microARN sont facilement implémentables dans des circuits synthétiques de manière modulaire, ils représentent une entrée largement utilisée pour les biocapteurs génétiquement codés 12,13,17. Les protéines sont également un biomarqueur valide pour les mutations génétiques, le cancer et les infections, et en effet, un certain nombre de dispositifs de détection des protéines extracellulaires ont été signalés18,19.

De nombreux circuits qui détectent les protéines extracellulaires reposent sur l’utilisation de récepteurs modifiés, qui attachent un facteur de transcription (TF) à la membrane, fusionné à un site de clivage sensible au TEVp (TCS). Un avantage majeur de la TEVp est la spécificité du clivage et l’absence d’interférence avec le traitement des protéines endogènes. Dans ces systèmes, la TEVp est fusionnée à un deuxième peptide qui interagit avec le récepteur modifié lors de la liaison des molécules extracellulaires. Ainsi, les entrées externes induisent un clivage médié par TEVp et une libération de TF. Les systèmes qui fonctionnent avec ce mécanisme sont Tango/TEVp18, induit par la lumière20 et Modular Extracellular Sensor Architecture (MESA)19. Malgré les progrès réalisés dans la détection des protéines extracellulaires, la technologie de détection des protéines intracellulaires de manière modulaire n’a jamais été réalisée auparavant, avec la limitation de passer par de nombreuses itérations de construction et de test pour des dispositifs uniques répondant à une protéine spécifique.

Notre système est la première plateforme de détection de protéines intracellulaires21. La modularité est garantie par l’utilisation d’intracorps qui définissent la spécificité à la cible, tandis que la reprogrammation cellulaire est médiée par TEVp. Plus précisément, un intracorps est lié à une membrane et fusionné à l’extrémité C-terminale à une protéine fluorescente mKate, à un TCS et à un TF (protéine de fusion 1) ; le deuxième intracorps est fusionné au TEVp et situé dans le cytosol (protéine de fusion 2) (Figure 1).

Ainsi, l’interaction entre deux intracorps et la protéine cible se produit dans le cytoplasme et conduit au clivage des TCS par TEVp, entraînant la translocation du TF dans le noyau pour activer la sortie fonctionnelle. Le dispositif de détection et d’actionnement a été testé avec succès pour quatre protéines spécifiques de la maladie intracellulaire : la protéase sérine NS3 exprimée par le virus du VHC22, les protéines Tat et Nef de l’infection par le VIH23,24 et la huntingtine mutée (HTT) de la maladie de Huntington25. L’expression de sortie comprend les rapporteurs fluorescents, le gène apoptotique (hBax)26 et les immunomodulateurs (XCL-1)27. Nous démontrons que le système peut également altérer le fonctionnement pathologique de ses cibles. Par exemple, le dispositif sensible à Nef interfère avec la propagation de l’infection virale en séquestrant la protéine cible et en inversant la modulation négative du récepteur HLA-I sur les cellules T infectées24. La plate-forme de détection-actionnement décrite est la première de ce type pour la détection de protéines intracellulaires et peut potentiellement être mise en œuvre pour détecter l’expression anormale de protéines, les modifications post-traductionnelles ou épigénétiques, à des fins diagnostiques et thérapeutiques20.

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Protocole

1. Principes de conception pour la construction et l’essai du dispositif capteur-actionneur

  1. Sélectionnez une protéine qui vous intéresse.
    REMARQUE : Nous avons conçu un système pour les protéines situées dans le cytoplasme ou faisant la navette entre le cytoplasme et d’autres compartiments.
  2. Sélectionnez deux intracorps liant des épitopes différents de la protéine cible. Dans notre étude, nous avons sélectionné des protéines pour lesquelles les intracorps étaient déjà développés et testés 28,29,30,31. Lorsque les intracorps ne sont pas disponibles, ils doivent être nouvellement développés.
    REMARQUE : Une alternative aux intracorps peut être d’autres molécules qui interagissent avec la protéine d’intérêt. Par exemple, le dispositif de détection Nef comprend un intracorps (sdAb19) et le domaine SH3 d’une protéine tyrosinekinase 32 de p59fyn.
  3. Concevoir in silico les plasmides avec des séquences d’ADN codant pour les protéines de fusion.
    REMARQUE : Les logiciels de conception de plasmides sont disponibles gratuitement ou peuvent être achetés.
    1. Générez des séquences qui incluent les modules suivants : marqueur membranaire, marqueur fluorescent (par exemple, mKate), intracorps, TCS et TF pour la protéine de fusion 1, et intracorps et TEVp pour la protéine de fusion 2.
      REMARQUE : La construction d’une nouvelle architecture basée sur l’interaction de plusieurs composants nécessite une attention particulière aux paramètres susceptibles de maximiser l’activation du signal lorsque la protéine cible est détectée. Plus précisément, nous nous sommes concentrés sur l’activité TEVp et la flexibilité des protéines chimériques pour faciliter l’interaction protéine-protéine (Tableau 1). Toutes ces fonctionnalités sont précisées dans les points suivants.
    2. Insérez un domaine de liaison glycine-sérine (LD) flexible entre le TCS intracorporel et/ou le TEVp-intracorps. La LD peut être de longueur variable (0, 10 ou 15 acides aminés-AA).
    3. Protéine de fusion 1 : Concevoir des variantes qui incluent le TCS de haute affinité (S) ou le TCS de faible affinité (L) pour réguler l’activité de clivage de TEVp. L’expression de cette construction est portée par un promoteur constitutif. Inclure le facteur de transcription GAL4VP16 à l’extrémité C-terminale du TCS pour permettre la translocation vers le noyau lors du clivage TEVp.
      REMARQUE : Nous avons utilisé le promoteur hEF1a, mais d’autres promoteurs constitutifs peuvent être choisis.
    4. Protéine de fusion 2 : Utiliser un promoteur constitutif (hEF1a) ou inductible par la doxyclycine (pTET) pour régler la transcription de TEVp. Utilisez un domaine de dégradation (DD) régulé par le bouclier de petites molécules pour moduler la stabilité des protéines.
      REMARQUE : D’autres systèmes inductibles qui ajustent l’expression des protéines peuvent potentiellement être choisis.
    5. Sortie : Placez un gène rapporteur en aval du promoteur UAS qui répond à GAL4VP16 facteur de transcription. Choisissez la sortie en fonction de l’application de l’appareil (c’est-à-dire protéine fluorescente, cytokine, etc.).
  4. Effectuez le clonage avec la stratégie de votre choix. Ici, nous avons construit des plasmides avec des technologies de golden gate ou de passerelle.
  5. Testez les différentes configurations du dispositif dans les lignées cellulaires souhaitées par transfection transitoire. Co-transfecter les cellules avec les plasmides obtenus pour les protéines de fusion 1 et 2 et le gène rapporteur fluorescent, tel que UAS-EYFP. La protéine de fusion 1 comprend une protéine fluorescente rouge (mkate) utilisée comme marqueur de transfection.
    REMARQUE : Commencez par des lignées cellulaires simples à transfecter telles que des cellules HEK293FT pour tester les dispositifs.
    1. Transfection dans HEK293FT cellules. Ensemencez 2 x 105 cellules dans une plaque de 24 puits avec 500 μL de DMEM. Transfectez des cellules avec 300 ng d’ADN total à l’aide d’un réactif de transfection, vortex le mélange et incubez à RT pendant 20 minutes.
      1. Placez les cellules dans un incubateur à 37 °C/5 % de CO2 . Ajouter le milieu de culture frais 24 h après la transfection.
    2. Transfection dans les cellules Jurkat. Utilisez 3 x 105 cellules dans 500 μL de milieu de culture cellulaire RPMI pour une plaque à 24 puits. Effectuez l’électroporation en suivant les instructions du fabricant. Utilisez 2 à 4 μg d’ADN total pour chaque échantillon. Ajouter 500 μL de milieu de culture cellulaire frais 24 h après la transfection.
      1. Pendant l’électroporation, placez les cellules et le mélange d’ADN sur de la glace. Ensuite, placez les cellules dans l’incubateur à 37 °C/5 % de CO2 .
        REMARQUE : Différentes lignées cellulaires et méthodes de transfection peuvent être choisies en fonction de l’application spécifique du dispositif.
  6. Acquérir des images microscopes pour obtenir une compréhension qualitative de la fonctionnalité de l’appareil. Confirmer la localisation membranaire de la protéine de fusion 1 en détectant le signal fluorescent (mkate) à proximité de la membrane cellulaire. Visualiser la sortie fluorescente (EYFP) en présence ou en absence (contrôle négatif-NC) de la protéine cible.
    1. Utilisez le système d’imagerie cellulaire équipé de cubes lumineux Tx Red et GFP pour détecter les protéines fluorescentes mKate et EYFP. Utilisez l’objectif 10x ou 20x.
      REMARQUE : Utilisez des cellules non transfectées pour vous assurer qu’il n’y a pas d’autofluorescence.
  7. Analysez la transfection par cytométrie en flux (FACS).
    REMARQUE : Voir le Protocole 2 pour la préparation des échantillons.
    1. Évaluez les dispositifs en présence de la protéine cible. Créer une matrice expérimentale qui combine des variantes des protéines de fusion 1 et 2, modulant la TEVp avec (i) le promoteur constitutif de hEf1a, (ii) le promoteur TET inductible par la doxycycline et (iii) le bouclier pour la stabilité de la protéine. Ajouter la doxycycline et le bouclier à des concentrations (0-1000 nM).
    2. Effectuer une analyse FACS pour comparer l’induction du repliement de l’EYFP entre des échantillons avec ou sans protéine d’intérêt.
      REMARQUE : L’induction de pliage la plus élevée correspond à la plus grande sensibilité d’entrée en mode ON (présence de la protéine cible) par rapport au mode OFF (absence de la protéine cible).
  8. Testez le fonctionnement de l’appareil par rapport aux applications souhaitées.
    1. Exécutez une analyse FACS pour mesurer les niveaux de protéines de sortie ou d’apoptose, ou d’autres tests pertinents.
    2. Effectuez une analyse RT PCR si la partie de sortie du dispositif régule les niveaux d’expression des gènes cibles. Calculez le 2-ddCT par rapport au gène de l’entretien ménager (GAPDH ou équivalent) et comparez le changement de pli de l’expression de la sortie en modes ON et OFF.

2. Préparation de l’échantillon pour l’analyse par cytométrie en flux

  1. Effectuer une analyse quantitative de dispositifs protéiques avec cytomètre en flux (FACS) 48 h après la transfection.
    1. Aspirez le média DMEM et lavez HEK293FT cellules avec 300 μL de PBS. Ajouter 100 μL de trypsine et laisser dans l’incubateur à 37 °C/5 % de CO2 pendant 2 à 4 minutes.
      REMARQUE : Les cellules Jurkat n’ont pas besoin de trypsine.
    2. Ajouter 400 μL de média DMEM sans rouge de phénol et remettre les cellules en suspension pour éviter la formation de grumeaux. Transfert dans des tubes FACS.
    3. Utilisez un cytomètre en flux équipé de lasers 405, 488 et 561 nm.
    4. Collectez 30 000 à 100 000 événements sélectionnés dans la population de cellules vivantes à l’aide des paramètres de cytomètre suivants : laser 488 nm et filtre passe-bande 530/30 nm pour EYFP/EGFP, laser 561 nm et filtre 610/20 nm pour mKate, et laser 405 nm, filtre 450/50 pour EBFP.
      REMARQUE : Pour configurer le cytomètre en flux, incluez des cellules non transfectées et des cellules transfectées avec des protéines fluorescentes simples.
    5. Effectuez l’analyse des échantillons collectés à l’aide du logiciel de votre choix (par exemple, le logiciel DIVA, Flowjo ou la méthode TASBE33).

3. Caractérisation du dispositif capteur-actionneur HCV

  1. Sélectionnez les intracorps pour détecter la protéine NS3. scFv35 et scFv162 se lient à deux épitopes différents et ont donc été choisis.
  2. Concevoir et tester des variantes du dispositif sensible à la NS3 en suivant le raisonnement décrit à l’étape 1.3 (p. ex., protéine de fusion 1 : marqueur membranaire, mKate, fragment de chaîne unique intracorps scFv35, LD0, TCS-L et TF GAL4VP16 ; Protéine de fusion 2 : fragment de chaîne unique intracorps scFv162, LD0 et TEVp ; Sortie : UAS-EYFP ou UAS-hBax (apoptose) ; NS3 (voir tableau 2)).
  3. Testez les constructions dans HEK293FT cellules.
    REMARQUE : Pour chaque expérience, définissez un contrôle négatif qui correspond à la quantification de l’administration du dispositif et de la sortie en l’absence de la protéine d’intérêt.
    1. Tester les dispositifs pour la TEVp sous un promoteur constitutif en présence ou en absence de NS3. Effectuez la transfection de la protéine de fusion 1 (étape 1.3.3), de la protéine de fusion 2 (étape 1.3.4) et de l’étape de sortie EYFP (1.3.5) dans HEK293FT cellules comme décrit à l’étape 1.5.1. Analyser les échantillons 48 h après la transfection en mesurant le rapporteur fluorescent (EYFP) par cytométrie en flux (Protocole 2).
    2. Évaluer l’interaction intracorps-NS3 par colocalisation de mKate et BFP à l’aide de la protéine de fusion BFP-NS3. Transfect de cellules avec la protéine de fusion 1 qui inclut mKate, et avec un BFP-NS3. 48 h après la transfection, observer les cellules au microscope confocal (objectif 63x) pour tester la co-localisation des protéines fluorescentes.
      REMARQUE : Utilisez un BFP (non fusionné à NS3) comme contrôle négatif. Dans cette condition, BFP doit présenter une localisation cellulaire diffuse et ne doit pas co-localiser avec la mKate liée à la membrane.
    3. Tester les dispositifs pour la TEVp sous le promoteur pTET en présence ou en l’absence de NS3. Comparez EYFP en absence et présence de NS3. Cellules co-transfectées avec la protéine de fusion 1 (étape 1.3.3), la protéine de fusion 2 (étape 1.3.4) et la sortie EYFP (étape 1.3.5) en utilisant le protocole décrit à l’étape 1.5.1. Les transfections sont effectuées en présence ou en l’absence de NS3. Analyser les échantillons 48 h après la transfection en mesurant le rapporteur fluorescent (EYFP) par cytométrie en flux (Protocole 2).
  4. Destruction de cellules d’essai pilotée par le dispositif NS3.
    1. Remplacez la sortie d’EYFP par le gène apoptotique hBax.
    2. Répétez l’étape 3.3.3. Prélever les cellules 48 h après la transfection et les laver au PBS avant de commencer le test.
    3. Effectuer un dosage de l’apoptose avec l’annexine V conjuguée au bleu du Pacifique. Cellules tachatives avec marqueur apoptotique Annexine V (conjuguée à 2,5 μL de bleu du Pacifique) diluées dans un tampon de liaison (rapport de volume de 1:20) pendant 10 min à température ambiante.
    4. Analysez les cellules par cytométrie en flux. Calculez le niveau d’apoptose au sein de la population en nombre de cellules positives pour le bleu Pacifique (Annexine V).

4. Caractérisation d’un dispositif de capteur-actionneur de VIH sensible à Nef

  1. Sélectionnez les intracorps qui se lient à Nef. Les sdAb19 et SH3 intracorps à domaine unique ont été choisis car ils se lient à des épitopes différents.
    REMARQUE : SH3 n’est pas un intracorps, mais un domaine de la protéine tyrosine kinase p59fyn qui interagit physiologiquement avec Nef.
  2. Concevoir et tester des variantes d’un dispositif sensible à Nef selon le raisonnement décrit à l’étape 1.3 (p. ex., protéine de fusion 1 : étiquette membranaire, mKate, sdAb19, LD0, TCS-L et GAL4-VP16 ; Protéine de fusion 2 : SH3, LD0 et TEVp ; Sortie : UAS-EYFP ; Nef (voir tableau 3)).
  3. Testez les appareils dans les cellules T HEK293FT et Jurkat.
    REMARQUE : Pour chaque expérience, nous définissons un contrôle négatif qui est la livraison du dispositif et la quantification de la sortie en l’absence de la protéine d’intérêt
    1. Transfection de HEK293FT : Suivez la procédure décrite à l’étape 1.5.1 en présence ou en absence de Nef.
    2. Transfection des lymphocytes T Jurkat : Suivre la procédure décrite à l’étape 1.5.2 en présence ou en absence de Nef.
    3. 48h après la transfection, analyser les échantillons avec un cytomètre en flux comme décrit dans le protocole 2.
  4. Infecter les cellules Jurkat avec des souches de LAI du VIH pour la détection du VIH.
    1. Préparez des stocks viraux au moins 48 h avant l’expérience. Utiliser le virus obtenu par transfection de cellules HEK-293T avec des clones moléculaires infectieux (programme de réactifs du NIH sur le sida) et des réactifs commerciaux en suivant les instructions du fabricant. Concentrer le virus après 40 h par ultracentrifugation pendant 1 h, 64 074 x g, 4 °C sur 20 % de saccharose pour éviter les protéines exemptes de particules virales. Titre des stocks viraux avec VIH-1 p24 ELISA.
    2. Infectez les cellules avec des souches de VIH-1 avec 500 ng d’inoculum p24. 40 h après l’infection, quantifier le pourcentage de cellules infectées en détectant la protéine virale p24 avec l’anticorps conjugué KC57-FITC et en effectuant une analyse par cytométrie en flux.
    3. Colorez les cellules avec les anticorps conjugués AlexaFluor 647 clone W6/32 contre HLA-A, B, C. Fixez les cellules et analysez-les sur un cytomètre en flux. Médiée par Nef : modulation négative de HLA-I dans les cellules T de Jurkat en présence ou en absence du dispositif de capteur de protéines.

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Résultats

Architecture modulaire pour la détection de protéines intracellulaires
Comme le montre la figure 1, le dispositif est composé de : 1) intracorps 1 connecté au marqueur fluorescent membranaire (mKate) et au site de clivage TEVp (TCS), suivi d’un activateur de transcription GAL4VP16 (TF) ; 2) intracorps 2 fusionné à la protéase TEV (TEVp), libre dans le cytosol ; 3) un promoteur synthétique réactif à GAL4VP16, pilotant l’expression d’un gène rapporteur. La modularité est ga...

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Discussion

Jusqu’à récemment, l’interrogation de cellules en fonction de l’environnement intracellulaire était effectuée avec des systèmes développés de novo pour des cibles spécifiques. Le présent protocole décrit un exemple de l’approche la plus récente d’ingénierie cellulaire pour la détection et l’actionnement des protéines dans un seul dispositif, qui peut être rapidement adapté aux nouveaux biomarqueurs souhaités.

Ce système pionnier détecte les protéines intracell...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par l’Istituto Italiano di Tecnologia.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AlexaFluor 647 souris anti-humain HLA-A, B, C clone d’anticorps W6/32Biolegend311414Anticorps
Annexine VLifeTechnologiesA35122Marqueur d’apoptose
AttracteneQiagen301005Réactif de transfection
BD Falcon Round-Bottom TubesBD Biosciences352053Tubes FACS
DoxycyclineClonetech-Culture cellulaire : Médicaments
Milieu Eagle modifié de DulbeccoCellgro10-013-CMCulture cellulaire :
Système d’imagerie cellulaire Evosde vieEVOS M5000; Clones moléculaires infectieux
Logiciel FACSDiva8BD Biosciences659523Logiciel FACS
Fast SYBR Green Master MixThermoFisher Scientific4385612réaction qPCR
FBS (Sérum de Bovin Fœtal)AtlantaBIO S11050Culture cellulaire : Medium
Gateway SystemLifeTechnologies-Constructionplasmidique
Golden Gate SystèmeinterneConstruction plasmidique
HEK 293FTInvitrogenR70007Culture cellulaire : Cellules
Système de clonage par perfusionClonetech638920Construction plasmidique
Réactif JetPRIMEPolyplus transfection114-15Réactif de transcfection
Jurkat CellsATCCTIB-152Culture cellulaire : Cellules
L-GlutamineSigma-AldrichG7513-100MLCulture cellulaire :
Lipofectamine LTX moyenne avec réactif PlusThermo Fisher Scientific15338030Réactif de transfection
LSR Fortessa cytomètre en flux (405, 488 et 561&thinsp ; lasers nm)Cytomètre en flux649225BD Biosciences
MicroAmp Plaque de réaction optique rapide à 96 puits (0,1&thinsp ; mL)ThermoFisher Scientific4346907réaction qPCR
Système de transfection au néonLife TechnologiesMPK10025Réactif de transfection
Acides aminés non essentielsHyCloneSH3023801Culture cellulaire : Milieu
Opti-MEM I sérum réduitdevie 31985070Milieu de transfection
Pénicilline/StreptomycineSigma-AldrichP4458-100MLCulture cellulaire : Medium
QuantiTect Kit de transcription inverseQiagen205313Rev Kit de transcriptase
RNeasy Mini KitQiagen74106Kit d’extraction d’ARN
RPMI-1640ATCCATCC 30­ ; 2001Culture cellulaire :
BouclierClonetech632189Culture cellulaire : Médicaments Billes
SpheroTech RCP-30-5-ASpherotechRCP-30- 5A-2Configuration de compensation
StepOnePlus 7500 Machine rapideApplied Biosystems4351106réaction qPCR
moyen Technologie Systèmes d’imagerie Technologies moyen

Références

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