Fabrication de réseaux de nanotubes lipidiques multi-composants à l’aide du test de motilité de la kinésine glissante

Résumé

Ce protocole décrit un processus de fabrication de réseaux de nanotubes lipidiques en utilisant la motilité de la kinésine glissante en conjonction avec des vésicules lipidiques unilamellaires géantes.

Résumé

Les réseaux de nanotubes lipidiques (LNT) représentent un système modèle in vitro pour l’étude du transport moléculaire et de la biophysique des lipides en rapport avec les tubules lipidiques omniprésents présents dans les cellules eucaryotes. Cependant, les LNT in vivo sont des structures hautement non équilibrées qui nécessitent l’assemblage, la maintenance et la réorganisation de l’énergie chimique et des moteurs moléculaires. De plus, la composition des LNT in vivo est complexe, comprenant plusieurs espèces de lipides différentes. Les méthodes typiques d’extrusion des LNT sont à la fois chronophages et laborieuses, et nécessitent une pince optique, des microbilles et des micropipettes pour extraire de force des nanotubes de vésicules lipidiques géantes. Présenté ici est un protocole pour le test de motilité de glissement (GMA), dans lequel des réseaux LNT à grande échelle sont rapidement générés à partir de vésicules unilamellaires géantes (GUV) en utilisant la motilité de microtubule alimentée par la kinésine. En utilisant cette méthode, les réseaux LNT sont formés à partir d’un large éventail de formulations lipidiques qui imitent la complexité des LNT biologiques, ce qui les rend de plus en plus utiles pour les études in vitro de la biophysique des lipides et du transport associé à la membrane. De plus, cette méthode est capable de produire de manière fiable des réseaux LNT en peu de temps (<30 min) à l’aide d’équipements de laboratoire couramment utilisés. Les caractéristiques du réseau LNT telles que la longueur, la largeur et le partitionnement lipidique sont également accordables en modifiant la composition lipidique des GUV utilisés pour fabriquer les réseaux.

Introduction

La fabrication de réseaux de nanotubes lipidiques (LNT) présente un intérêt croissant pour l’examen in vitro des structures lipidiques non ^{équilibrées 1,2,3}. Les cellules utilisent des tubules lipidiques pour le transport diffusif des protéines⁴ et des acides nucléiques⁵ ainsi que pour la communication de cellule à cellule ^6,7. Le réticulum endoplasmique et l’appareil de Golgi sont particulièrement intéressants, car ces organites liés à la membrane sont les principaux emplacements pour la synthèse des lipides et des protéines ainsi que pour le transport de ces biomolécules intégrales dans le cytoplasme d’une cellule ^8,9. Les membranes de ces organites sont composées de plusieurs espèces lipidiques, y compris les sphingolipides, le cholestérol et les phospholipides¹⁰ qui aident finalement à définir leur fonctionnalité. Ainsi, pour répliquer et étudier plus étroitement ces organites, les LNT in vitro doivent être fabriqués à partir de vésicules avec des formulations lipidiques de plus en plus complexes¹¹.

Les vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont utilisées de manière omniprésente pour étudier le comportement de la membrane lipidique, car elles peuvent être synthétisées de manière fiable avec des formulations complexes comprenant le cholestérol, la phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyléthanolamine (PE), la phosphatidylsérine (PS) et le phosphatidylinositol (PI)^12,13. Décrit ici est une méthode pour fabriquer des LNT à partir de GUV avec différentes formulations lipidiques en utilisant le test de motilité de glissement (GMA), dans lequel les LNT sont extrudés en fonction du travail effectué par les moteurs de kinésine et les filaments de microtubules agissant sur les GUV. Dans ce système, les protéines motrices de la kinésine adsorbées à une surface propulsent des microtubules biotinylés, convertissant l’énergie chimique de l’hydrolyse de l’ATP en un travail utile (en particulier, l’extrusion de LNT à partir de vésicules biotinylées)¹¹. Le réseau LNT qui en résulte fournit une plate-forme modèle pour étudier les effets des différences dans les phases lipidiques sur les changements dans la morphologie des LNT.

En bref, les protéines motrices de la kinésine sont introduites dans une chambre d’écoulement dans une solution contenant de la caséine, ce qui permet l’adsorption des moteurs sur la surface vitrée de la chambre. Ensuite, les microtubules biotinylés dans une solution contenant de l’ATP circulent à travers la chambre et sont autorisés à se lier aux moteurs de kinésine et à commencer la motilité. Une solution de streptavidine est ensuite introduite dans la chambre et laissée se lier de manière non covalente aux microtubules. Enfin, les GUV contenant un lipide biotinylé sont introduits dans la chambre et se lient aux microtubules recouverts de streptavidine, puis extrudent les LNT pour former des réseaux à grande échelle pendant 15 à 30 minutes. Cette méthode produit de grands réseaux LNT ramifiés en utilisant des équipements de laboratoire standard et des réactifs à faible coût¹¹.

Protocole

1. Préparation de solutions de microtubules mères

ATTENTION : Des lunettes de sécurité, des gants et une blouse de laboratoire doivent toujours être portés tout au long du protocole.

1. Préparer 5x tampon BRB80 : ajouter 24,19 g de PIPES (pipérazine-N,N′-bis[acide 2-éthanesulfonique]) et 0,38 g d’EGTA (éthylène glycol-bis[β-aminoéthyléther]-N,N,N′,N′-tétraacétique) dans une bouteille en verre de 1 L. Ajouter 1 mL de 1 M MgCl₂ et ajuster le pH à 6,9 avec KOH. Ajouter de l’eau désionisée pour porter la solution à un volume final de 500 mL.
2. Préparer un stock de 100 mM de solution de GTP : peser 52 mg de GTP et suspendre dans 1 mL d’eau distillée. Répartir la solution de 100 mM en aliquotes de 20 μL et conserver à -20 °C.
3. Préparer la solution GPEM : mélanger 200 μL de 5x BRB80, 10 μL de solution GTP de 100 mM, 100 μL de glycérol à 100% et 600 μL d’eau désionisée. Répartir la solution GPEM dans des aliquotes de 100 μL et conserver à -20 °C.
4. Préparer une solution de microtubules en reconstituant des flacons de tubuline lyophilisée disponible dans le commerce (un flacon de biotinylée, marquée par fluorescence et non marquée) dans une solution de GPEM froide (4 °C) à une concentration en stock de 5 mg/mL.
5. Effectuer la polymérisation des microtubules en mélangeant 4 μL de tubuline biotinylée, 4 μL de tubuline marquée par fluorescence et 24 μL de tubuline non marquée (le tout à des concentrations de 5 mg/mL) pour créer un rapport de 1:1:6 à un volume final de 32 mL. Gardez-le sur la glace. Diviser le mélange de tubuline en aliquotes de 2 μL et conserver à -80 °C jusqu’à ce que nécessaire.
   REMARQUE : Une polymérisation efficace exige que la concentration de tubuline soit égale ou supérieure à la concentration critique (5 mg/mL)¹⁴. Ici, la sélection du rapport de tubuline est optimisée pour une concentration suffisante de tubuline biotinylée pour lier efficacement la streptavidine et les GUV, ainsi qu’une concentration suffisante de tubuline fluorescente pour la caractérisation microscopique.

2. Préparation de vésicules unilamellaires géantes (GUV)

1. Préparation du film d’agarose
   REMARQUE : Ce protocole est adapté de Greene et ^al.15.
   1. Préparer une solution à 1 % p/v en mélangeant 1 g d’agarose dans 100 mL d’eau désionisée dans une fiole d’Erlenmeyer de 250 mL. Utilisez un four à micro-ondes standard pour chauffer la solution d’agarose pendant 1 à 2 min.
      REMARQUE: La solution deviendra translucide une fois que l’agarose est complètement dissoute. Laisser refroidir la solution à 65–75 °C avant utilisation.
   2. Utilisez une pointe de pipette coupée de 1 000 μL pour pipeter 300 à 400 μL de solution d’agarose sur un couvercle en verre de 25 mm x 25 mm. Tout en tenant le bord du couvercle avec des doigts gantés, utilisez une autre pointe de pipette de 1 000 μL pour répartir uniformément l’agarose fondue sur le couvercle.
      REMARQUE: Le maintien de l’agarose à 65–75 °C permettra un étalement efficace sur la surface du couvercle.
   3. Sécher les couvercles recouverts d’agarose dans un incubateur à 37 °C pendant au moins 2 h, moment auquel l’agarose deviendra transparente. Stockez les couvercles en plaçant la surface enduite d’agarose vers le haut sur une surface propre telle que du papier non pelucheux ou un film à base de cire à température ambiante (RT).
2. Formulation lipidique
   1. Récupérez les lipides dissous dans le chloroforme dans un congélateur à -20 °C et placez-les dans une hotte chimique jusqu’à ce qu’ils atteignent RT.
   2. Calculer le volume de lipides de chaque lipide composant nécessaire à la formulation en utilisant la formule suivante:
      
      Où: V_lipide est le volume de lipide à utiliser, mol % est le pourcentage molaire de la composante lipidique, n est le nombre total de moles de lipide utilisées dans la formulation, et M est la concentration de lipide dans les unités molaires.
      NOTE: Par exemple, si vous utilisez une formulation contenant 45 mol% de 1,2-dioléoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) avec une concentration en solution mère de 12,72 mM et 1 micromole de lipides totaux dans la formulation, le volume de stock de DOPC utilisé dans la formulation serait:
      
   3. Mélanger les lipides ensemble au rapport calculé dans un flacon en verre dans la hotte chimique.
   4. Pipeter 30 μL de solution lipidique sur les couvercles enduits d’agarose sur une plaque chauffante préchauffée qui est placée au-dessus du point de fusion du composant lipidique saturé de la formulation (par exemple, plaque chauffante à 50 °C pour un lipide avec T_m de 40 °C).
   5. Étaler la solution sur le film d’agarose dans un mouvement circulaire en utilisant le long bord d’une aiguille de 18 G jusqu’à ce que le chloroforme se soit évaporé et qu’une couche uniforme de lipides se soit formée. Tenez le bord du couvercle avec les doigts gantés tout en effectuant cette étape.
      REMARQUE: Il faut veiller à ne pas endommager la couche d’agarose avec l’aiguille.
   6. Placez le couvercle avec la couche d’agarose et le film lipidique dans une boîte de Petri recouverte de papier d’aluminium, côté film orienté vers le haut et placez la boîte de Petri dans un dessiccateur sous vide pendant au moins 2 h pour éliminer le solvant résiduel.
3. Entre-temps, préparer une solution de saccharose de 560 mM en mélangeant 1,92 g de saccharose avec 10 mL d’eau désionisée.
   REMARQUE: La concentration de la solution de saccharose dépend de l’osmolarité du tampon dans lequel les GUV sont dilués. En règle générale, l’osmolarité de la solution de saccharose ne doit pas dépasser de plus de 10 % le tampon dans lequel les GUV seront dilués, en particulier le tampon de motilité (voir étape 3.11).
4. Formation de GUV
   1. Collez une chambre adhésive sur le couvercle recouvert du film lipidique en appuyant doucement sur la chambre adhésive sur le couvercle recouvert de lipides avec le film lipidique tourné vers le haut, en veillant à ce qu’un joint étanche soit formé.
   2. Ajouter 400 μL de solution de saccharose de 560 mM (préparée à l’étape 2.3) à la chambre.
   3. Placez le couvercle dans la chambre d’humidité et fermez le couvercle.
   4. Placez la chambre d’humidité sur une plaque chauffante préchauffée située au-dessus du point de fusion du composant lipidique saturé de la formulation.
   5. Laisser les vésicules se former pendant ≥1 h avant la récupération.
      REMARQUE: La formation de vésicules peut être vérifiée par microscopie à fluorescence avec une lentille d’objectif d’air 40x.

3. Préparation des stocks et des réactifs des essais de motilité

1. Préparation du stock de caséine
   1. Ajouter 3 g de caséine sèche dans un tube de centrifugeuse conique de 50 mL, puis ajouter 30 mL de 1x BRB80 et faire pivoter jusqu’à ce que la solution devienne visqueuse. Centrifuger le tube à 15 000 x g pendant 30 min.
   2. Transférer le surnageant dans un autre tube de centrifugeuse conique de 50 mL et jeter la pastille. Filtrer la solution à travers un filtre à seringue de 1 μm, en recueillant la solution dans un flacon conique de 50 mL. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,2 μm, en recueillant la solution dans un flacon conique de 50 mL.
   3. Déterminer la concentration en protéines en mesurant l’absorbance à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis et d’une cuvette à quartz.
   4. Calculer la concentration de caséine en mg/mL à l’aide de la formule suivante :
      
   5. Diluer la solution à 20 mg/mL dans 1x BRB80, diviser en aliquotes de 100 μL et conserver à -20 °C.
2. Préparer la solution mère de glucose oxydase (2 mg/mL) en mélangeant 2 mg de glucose oxydase avec 1 mL de 1x BRB80. Diviser en aliquotes de 100 μL et conserver à -20 °C.
3. Préparer la solution mère de catalase (0,8 mg/mL) en mélangeant 0,8 mg de catalase avec 1 mL de 1x BRB80. Diviser en aliquotes de 100 μL et conserver à -20 °C.
4. Préparer 2 M de solution de glucose en suspendant 0,3 g de D-glucose dans 1 mL d’eau désionisée. Diviser en aliquotes de 100 μL et conserver à -20 °C.
5. Préparer un stock de TNT de 100 mM en suspendant 0,015 g de TNT dans 1 mL d’eau désionisée. Diviser en aliquotes de 100 μL et conserver à -20 °C.
6. Préparer 100 mM de Mg-ATP en suspendant 0,055 g d’ATP disodique dans une solution de 1 mL de 100 mM_MgCl2. Diviser en aliquotes de 100 μL et conserver à -20 °C.
7. Préparer une solution de Mg-AMP-PNP de 100 mM en suspendant 0,055 g d’AMP-PNP dans une solution de 1 mL de 100 mM de_MgCl2, puis répartir en aliquotes de 100 μL et conserver à -20 °C.
8. Préparer 100 mM de solution de Trolox en ajoutant 25,03 mg de Trolox à 1 mL de méthanol et conserver à -20 °C.
9. Préparer 10 mg/mL de solution de streptavidine en ajoutant 1 mg de streptavidine à 100 μL de BRB80, puis diviser en aliquotes de 2 μL et conserver à -80ۛ °C.
10. Préparer BRB90CAT en mélangeant 200 μL de 5x BRB80, 20 μL de solution de caséine, 10 μL de solution de MgATP, 10 μL de Trolox, 5 μL de solution de paclitaxel et 765 μL d’eau DI. Conserver à 4 °C.
11. Préparer la solution de motilité en mélangeant 192 μL de BRB80CAT, 2 μL de solution de D-glucose, 2 μL de solution de glucose oxydase, 2 μL de solution de TNT et 2 μL de solution de catalase. Conserver à 4 °C.
12. Préparer une solution de kinésine de 1 μM en diluant la solution mère de kinésine dans du BRB80CAT (p. ex., 2 μL de solution de kinésine de 50 mM dans 98 μL de BRB80CAT) et conserver à 4 °C.
13. Préparer une solution de microtubules de 10 μg/mL en diluant 10 μL de microtubules stabilisés dans 90 μL de BRB80CAT à température ambiante. Magasinez chez RT.
14. Préparer une solution de streptavidine à 10 μg/mL en ajoutant 0,1 μL de solution de streptavidine à 10 mg/mL dans 99,9 μL de solution de motilité. Conserver à 4 °C.
15. Préparer une solution de GUV 12x en diluant 5 μL de bouillon DEV dans 55 μL de solution de motilité. Conserver à 4 °C.
16. Polymérisation de la tubuline en microtubules
    1. Prélever une aliquote de tubuline de 2 μL préalablement préparée dans le congélateur à -80 °C (préparée à l’étape 1.5) et la placer dans un bain-marie à 37 °C pendant 30 min.
    2. Préparer une solution de paclitaxel de 2 mM en ajoutant 1,71 mg de paclitaxel dans 1 mL de DMSO anhydre, diviser en aliquotes de 10 μL et conserver à -20 °C.
    3. Préparer fraîchement le BRB80T en mélangeant 99,5 μL de 1x BRB80 avec 0,5 μL de paclitaxel de 2 mM.  Chauffer 100 μL de BRB80T à 37 °C au bain-marie.
    4. Après 30 min, ajouter les 100 μL de BRB80T à l’aliquote de tubuline pour stabiliser les microtubules. Magasinez chez RT.

4. Test de motilité de glisse (GMA)

1. Préparer une chambre d’écoulement en apposant deux bandes de ruban adhésif double face séparées de 5 mm sur une lame de verre. Répétez ce processus jusqu’à ce que trois couches de ruban adhésif composent chaque bande.
2. Placez un couvercle sur le dessus du ruban adhésif, puis appuyez doucement sur l’interface couvercle/ruban adhésif à l’aide d’une pince ou d’un stylo pour assurer une adhérence suffisante.
   REMARQUE: Le canal doit avoir une largeur de 5 mm par une longueur de 25 mm et une hauteur de 300 mm.
3. Pipette 30 μL de solution de kinésine de 1 mm (préparée à l’étape 3.12) dans la cellule d’écoulement et laisser incuber pendant 5 min.
   REMARQUE: La caséine forme une bicouche à la surface de la glissière de couverture / verre et facilite la fixation de la queue de kinésine à la surface.
4. Pipette 30 μL de solution de microtubules de 10 μg/mL (préparée à l’étape 3.13) dans la cellule d’écoulement, à l’aide d’une lingette de laboratoire pressée doucement contre l’extrémité opposée du canal d’écoulement pour faciliter l’échange de solution. Incuber pendant 5 min.
5. Laver la cellule d’écoulement 1x–3x avec 1x solution de motilité à RT (préparée à l’étape 3.11).
   REMARQUE: La microscopie à fluorescence utilisant un objectif d’air 40x peut être utilisée à ce stade pour confirmer la fixation et la motilité des microtubules. Les microtubules apparaissent sous forme de filaments fluorescents (des dizaines de microns de longueur) se déplaçant (glissant) sur la surface à ~0,5 μm/s (Figure 1).
6. Pipeter 30 μL de solution de streptavidine de 10 μg/mL (préparée à l’étape 3.14) dans la cellule d’écoulement à l’aide d’une lingette de laboratoire pressée doucement contre l’extrémité opposée du canal d’écoulement pour faciliter l’échange de la solution. Incuber pendant 10 min.
7. Verser 30 μL de solution 12x GUV (préparée à l’étape 3.15) dans le flux à l’aide d’une lingette de laboratoire pressée doucement contre l’extrémité opposée du canal d’écoulement pour faciliter l’échange de solution. Incuber pendant 30 min.
8. Ajouter 2 μL de solution AMP-PNP de 100 mM (préparée à l’étape 3.7) pour arrêter la motilité, puis sceller la chambre avec du scellant.

5. Caractérisation du réseau LNT

1. Transférez la chambre d’écoulement dans un microscope inversé pour l’imagerie.
2. Choisissez le jeu de filtres approprié en fonction des longueurs d’onde des lipides fluorescents ou de la tubuline utilisés. Par exemple, lorsque vous utilisez des lipides marqués Texas Red, utilisez un filtre d’excitation de 560 nm / 25 nm et un filtre d’émission de 607 nm / 36 nm.
3. Utilisez un objectif d’huile 100x pour vous concentrer sur la surface du couvercle.
4. Imagez les réseaux LNT à l’aide de la microscopie à fluorescence.
   REMARQUE: Les LNT sont des structures linéaires extrudées à partir des plus grandes vésicules. Les LNT sont beaucoup plus petits que les GUV et ont des signaux de fluorescence plus faibles. Ainsi, l’exposition et le contraste doivent être ajustés en fonction des LNT d’image. Ces ajustements conduisent également à une surexposition des GUV, et il est donc recommandé que la lamellélarité et la séparation de phase dans les GUV soient caractérisées indépendamment.
5. Concentrez le microscope sur un réseau d’intérêt et prenez une image standard ou carrelée.
6. Ajustez les filtres de temps d’exposition et de densité neutre pour imager les LNT et minimiser l’exposition saturée des GUV. Acquérez des images à la fois dans les canaux rouges et verts.
   REMARQUE: Ici, le canal rouge permet la visualisation des lipides Texas-Red, tandis que le canal vert permet la visualisation des microtubules (par exemple, les lipides Oregon Green et les colorants HiLyte488).
7. Créez une image composite en superposant les couches rouge et verte (Figure 1).
8. Caractérisation des réseaux LNT en mesurant la longueur LNT
   1. Ouvrez les images acquises à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images tel que ImageJ.
   2. Calibrez l’échelle du microscope à l’aide de la fonction d’échelle définie, remplissez les pixels au facteur de conversion mm, puis cliquez sur OK.
      REMARQUE: Le facteur de conversion dépend du microscope, de l’objectif et de l’appareil photo, et il peut être obtenu à l’aide d’une lame d’étalonnage du microscope. Il est généralement exprimé en pixels/mm.
   3. Utilisez l’outil Ligne multipoint pour mesurer la longueur des nanotubes à partir du GUV parent. Maintenez la touche Ctrl + M enfoncée pour mesurer la longueur.
   4. Continuez à mesurer les longueurs des tubes individuels en suivant les étapes ci-dessus. L’outil de traitement d’image enregistrera chaque nouvelle mesure dans la fenêtre de résultats.
   5. Maintenez ctrl + D après avoir tracé chaque ligne pour garder une trace des tubes qui ont été mesurés.
9. Mesure de l’épaisseur LNT (Figure 2)
   1. Ouvrez l’image dans ImageJ et sélectionnez la fonction Seuil sous l’onglet Image .
   2. Cliquez sur Appliquer pour appliquer le seuil.
   3. Dessinez un rectangle de longueur connue sur le tube souhaité (les pixels noirs ont une valeur de 0 et les pixels rouges ont une valeur de 255).
   4. Mesurez la densité intégrée de la zone.
   5. Divisez la densité par la longueur (en pixels) du LNT pour obtenir l’épaisseur (en pixels).
      REMARQUE: Les mesures d’épaisseur ne peuvent être comparées entre les images que lorsque les paramètres d’imagerie et le seuil sont définis de manière identique.
10. Détermination du partitionnement lipidique dans les nœuds des LNT (Figure 3)
    1. Ouvrez l’image dans ImageJ.
    2. Utilisez l’outil Ligne pour tracer une ligne sur le nœud souhaité.
    3. Mesurez l’intensité des nœuds dans les canaux Vert de l’Oregon et Rouge du Texas.
    4. Déplacez la ligne vers le LNT et mesurez l’intensité du LNT dans les canaux Oregon Green et Texas Red.

Résultats

Les réseaux LNT (Figure 4) ont été fabriqués à l’aide du protocole décrit, qui utilise le travail effectué par le transport de kinésine de microtubules pour extruder des LNT à partir de GUV. En bref, les GUV ont été préparés à l’aide d’une réhydratation en gel d’agarose à l’aide d’une solution de saccharose, et les microtubules ont été polymérisés dans une solution GPEM et stabilisés dans BRB80T. Ensuite, des moteurs à kinésine ont été introduits dans une cellule d’écoulement formant une cou...

Discussion

Les réseaux LNT sont un outil utile pour les études in vitro des propriétés membranaires et du transport de biomolécules telles que les protéines transmembranaires. De plus, l’utilisation de formulations lipidiques complexes pour fabriquer des réseaux de LNT permet des études plus pertinentes sur le plan biologique. D’autres études de fabrication ont utilisé soit 1) des formulations lipidiques simples et des vésicules multilamellaires, soit 2) des techniques de motilité plus lourdes pour fabriquer des réseaux à partir de...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Objectif à immersion dans l’huile à ouverture numérique 100x/1.4 Olympus		1-U2B836	Objectif à huile Olympus UPlanSApo 100x/1.40 corrigé à l’infini, filetage RMS Distance de travail 0,12 mm
3,0 Filtre ND	Filtre à densité neutre	Olympus
AMP-PNP	Sigma-Aldrich	A2647	(&beta ;,&gamma ;-imidoadenosine 5&prime ;-triphosphate)
ATP	Sigma-Aldrich	A7699	Adénosine 5'-triphosphate disodium sel hydraté BioXtra
Brightline Pinkel DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A000 set de filtres	Semrock	LED-DA/FI/TR/Cy5/Cy7-5X-A-000	BrightLine Pinkel, optimisé pour DAPI, FITC, TRITC, Cy5 & Cy7 et autres fluorophores similaires, éclairés par des sources lumineuses à base de LED
Caséine	Sigma-Aldrich	22090	Hydrolysat de caséine pour la microbiologie
Catalase	Sigma-Aldrich	C9322	Catalase du foie bovin
Chloroforme	Sigma-Aldrich	288306	Chloroforme anhydre contient 0,5 à 1,0 % d’éthanol comme stabilisant
Cholestérol	Avanti	700000P	cholestérol (laine ovine, >98 %) (poudre)
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G7021	D-(+)-Glucose en poudre, BioReagent, adapté à la culture cellulaire, adapté à la culture cellulaire d’insectes, adapté à la culture cellulaire végétale, &ge ; 99.5 %
DOPC	Avanti	850375C	1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (sous forme de chloroforme)
DOPE-Biotine	Avanti	870282C	1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyle) (sel de sodium)
DPPC	Avanti	850355P	1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (poudre)
DPPE-Biotine	Avanti	870285P	1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-(biotinyle) (sel de sodium)
DTT	Sigma-Aldrich	43816	DL-Dithiothreitol solution 1 M
EGTA	Sigma-Aldrich	E4378	EGTA, Acide égtazique, Acide éthylène-bis(oxyéthylènenitrilo)tétraacétique, Éther de glycol Acide diamine tétraacétique
Glucose Oxydase	Sigma-Aldrich	G6125	Glucose oxydase d’Aspergillus niger Type II, &ge ; 10 000 unités/g solide (sans oxygène ajouté)
Glycérol	Fisher	G33	Glycérol (certifié ACS), Fisher Chemical
GTP	Sigma-Aldrich	G8877	Guanosine 5&prime ;-triphosphate sel de sodium hydraté
IX-81 Microscope Olympus	Olympus	N/A	IX81 Microscope inversé d’Olympus
KOH	Sigma-Aldrich	1050121000	Potassium Hydroxyde
Chlorure	de magnésium Sigma-Aldrich	M1028	1.00 M solution de chlorure de magnésium
Orca Flash 4.0 Appareil photo numérique	Hamamatsu	C13440-20CU	ORCA-Flash 4.0 V3 Appareil photo numérique CMOS
Oregon Green-DHPE	Invitrogen	O12650	Oregon Green 488 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine
Paclitaxel	ThermoFisher	P3456	Paclitaxel (équivalent taxol) - pour une utilisation en recherche uniquement
PIPES	Sigma-Aldrich	P6757	Acide 1,4-Pipérazinediéténésulfonique, Pipérazine-1,4-bis(acide 2-éthanesulfonique), Pipérazine-N,N&prime ;-bis(Acide 2-éthanesulfonique)
Texas Red-DHPE	Invitrogen	T1395MP	Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Sel de triéthylammonium
Trolox	Sigma-Aldrich	238813	(± ;)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchromane-2-carboxylique
Tubuline, Biotine	Cytosquelette	T333P	Protéine de tubuline (biotine) Cerveau porcin
Tubuline, Hy-Lite 488	Cytosquelette	TL488M	Protéine de tubuline (fluorescent HiLyte 488) Cerveau porcin
Tubuline,	Cytosquelette	T240	Protéine de tubuline Cerveau porcin