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Article de méthode

Isolement et caractérisation des fibroblastes cardiaques adultes et des myofibroblastes

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DOI :

10.3791/60909

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12 mars 2020

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1Department of Pathology, Microbiology, and Immunology, Vanderbilt University Medical Center, 2American Red Cross, National Headquarters

Dans cet article

Résumé

L’obtention d’une population pure de fibroblastes est cruciale pour étudier leur rôle dans la réparation des plaies et la fibrose. Décrit ici est une méthode détaillée pour isoler les fibroblastes et les myofibroblastes des cœurs de souris non blessés et blessés suivis par la caractérisation de leur pureté et de leur fonctionnalité par immunofluorescence, RTPCR, tri cellulaire assisté par fluorescence, et contraction du gel de collagène.

Résumé

La fibrose cardiaque en réponse aux dommages est une réponse physiologique à la cicatrisation des plaies. Des efforts ont été faits pour étudier et cibler les sous-types de fibroblastes qui atténuent la fibrose. Cependant, la recherche sur le fibroblaste a été entravée en raison de l’absence de marqueurs fibreblastaux universellement acceptables pour identifier les fibroblastes quiescents ainsi que les fibroblastes activés. Les fibroblastes sont une population de cellules hétérogènes, ce qui les rend difficiles à isoler et à caractériser. Le protocole présenté décrit trois méthodes différentes pour enrichir les fibroblastes et les myofibroblastes des cœurs de souris non blessés et blessés. L’utilisation d’un protocole standard et fiable pour isoler les fibroblastes permettra d’étudier leurs rôles dans l’homéostasie ainsi que la modulation de la fibrose.

Introduction

Les fibroblastes cardiaques, cellules d’origine mésenchymale, jouent un rôle important dans le maintien de la conduction électrique et des forces mécaniques dans le cœur en plus du maintien de l’architecture cardiaque pendant l’homéostasie1. Suite à des blessures, ces cellules sont activées, se dilatent et produisent des protéines de matrice extracellulaire (ECM)2. De nombreuses études précliniques ont révélé des fibroblastes en tant que régulateurs cellulaires critiques qui maintiennent l’intégrité structurale d’un cœur blessé3 ainsi que les cellules principales effecteur responsables de la production non contrôlée et le dépôt des protéines ECM, résultant en la formation de cicatrices raides et l’insuffisance cardiaque4. Les fibroblastes sont un groupe hétérogène de cellules, ce qui rend difficile de disséquer leur fonction réparatrice à partir de propriétés maladaptives pro-fibrotiques. Récemment, l’hétérogénéité fonctionnelle de deux sous-types fibreblastiques distincts suivant des dommages myocardiques ont été définies, indiquant la possibilité d’isoler différents sous-types de fibroblaste et d’étudier leur rôle dans la cicatrisation des plaies5.

L’obtention d’une population de fibroblastes purs est cruciale pour délimiter son rôle fonctionnel dans la réparation et la fibrose. Cependant, la présence de marqueurs fibroblastiques multiples qui reconnaissent d’autres types de cellules font qu’il est difficile d’isoler une population fibreuse sensiblement pure6. Plusieurs études élégantes ont conçu des moyens intelligents d’isoler les fibroblastes cardiaques du myocarde non blessé et blessé. La méthode la plus populaire et bien établie d’enrichir les fibroblastes est par l’adhérence sélective suivant la digestion des tissus enzymatiques7.

En outre, le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) des fibroblastes à base d’antigènes de surface cellulaire a été décrit avec succès8. Dans l’étude, suivant la digestion enzymatique, les cellules mésenchymales ont été triées comme lignée-négative (Lin : Ter119-CD45-CD31-) et gp38-positive (gp38-) des coeurs de souris. Les cellules de Gp38ont été confirmées pour être des fibroblastes basés sur leur co-expression de col1-1 et d’autres marqueurs mésenchymals. Bien que la plupart de la digestion des tissus est terminée après avoir disséqué le ventricule dans un plat Petri, une étude récente a étudié l’utilisation d’une perfusion directe d’enzyme d’aiguille du ventricule gauche pour isoler les myocytes et les non-myocytes qui incluent les fibroblastes9. Les fibroblastes ont ensuite été isolés par l’adhérence sélective dans ce cas.

Ce protocole décrit l’isolement et l’enrichissement des fibroblastes à l’aide de trois méthodes. La première est une méthode déjà établie impliquant l’adhérence sélective des fibroblastes suivant la digestion enzymatique. La deuxième méthode est utilisée principalement pour isoler les muscles lisses alpha induits par les blessures exprimant des myofibroblastes. La troisième méthode implique l’épuisement séquentiel et magnétique d’une suspension de cellules cardiaques enzyme-digérées des cellules hématopoïétiques et endothéliales. Après épuisement, les fibroblastes/myofibroblastes sont isolés en fonction de la présence de l’antigène MEFSK4 à l’aide de perles magnétiques. Récemment, MEFSK4 a été décrit comme un antigène présent sur les fibroblastes quiescents ainsi que activés, ce qui en fait un marqueur approprié pour l’identification et l’isolement de fibroblaste. Naturellement, toutes les méthodes décrites ici ont des limites uniques. Il est donc fortement recommandé de vérifier la pureté de la population cellulaire isolée par analyse de flux, immunostaining, et semi-quantitative PCR en temps réel. Cependant, ces méthodologies peuvent être élargies, et des marqueurs supplémentaires peuvent être ajoutés afin d’exclure d’autres populations contaminantes avant d’utiliser les populations de fibroblastes et de myofibroblastes pour des expériences cruciales.

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Protocole

Cette étude confirme strictement les recommandations du Guide pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Vanderbilt a approuvé le protocole (numéro de protocole : M1600076-01).

1. Dissection cardiaque

  1. Préparation de la solution
    1. Tampon KHB
      1. À l’aide d’une barre de remuer, dissoudre lentement 9,4 g de poudre tampon Krebs-Henseleit (KHB) dans 900 ml d’eau DDI.
        REMARQUE : Le tampon se précipitera si on agite trop rapidement ou trop longtemps. Le tampon KHB doit être froid pendant l’isolement fibroblastique.
      2. Ajouter 2,9 mM CaCl2 et 24 mM NaHCO3. Ajuster le pH à 7,2 à 7,3 et diluer à un volume de 1 L avec dH2O.
      3. À l’aide d’un filtre stérile (0,22 m), conserver jusqu’à 4 oC pendant une durée pouvant aller jusqu’à 4 semaines. Conserver sur la glace ou à 4 oC pour une durée d’isolement.
    2. Cocktail de digestion Collagenase
      1. Préparer le cocktail de digestion le jour de l’isolement du fibroblaste. Déterminer le volume approprié de cocktail de digestion en fonction du nombre de cœurs; 5 ml de cocktail par 1 coeur.
      2. Préparer le mélange de collagène (voir Tableau des matériaux) et DNase I selon les instructions du fabricant.
      3. Pour 20 ml de cocktail de digestion total, ajoutez 17,5 L de DNase I, 180 L de 1 M HEPES, et 500 L de collagène à un tube conical vide de 50 ml.
      4. Ajoutez un volume suffisant de la solution Hank’s Balanced Salt (HBSS) avec Ca2 et Mg2md pour obtenir un volume total de 20 ml.
    3. Tampon de lyse des globules rouges (RBC)
      1. Déterminer le volume total nécessaire en fonction du nombre de cœurs (5 ml/cœur). Diluer le tampon de stock 10x RBC lysis à 1x à l’aide de dH2O.
    4. Multimédia : 10% de FBS dans DMEM F-12
      1. Ajoutez 10% de FBS à DMEM-F12 avec L-glutamine et HEPES. Ajouter 10 U/mL pénicilline/streptomycine, 2,5 g/mL antifongique, et 2,5 g/mL mycoplasma prophylactique (voir Tableau des matériaux). Conserver à 4 oC.
  2. Dissection de coeur
    1. Préparer une plaque de 6 puits sur glace avec 2 ml de KHB froid par puits pour ranger les cœurs pendant la dissection. Utilisez des ciseaux et des forceps chirurgicaux autoclaved.
    2. Euthanasiez les souris à 12 semaines ou plus par surdosage d’isoflurane, et suivez avec la dislocation cervicale.
    3. Alternativement, pour l’isolement de fibroblaste activé, induisent l’infarctus du myocarde dans les souris de 12 semaines par la ligature coronaire d’artère10. Euthanasiez les souris 8 à 10 jours après une blessure.
    4. Vaporiser le corps avec 70% d’éthanol et d’orient de sorte que le côté ventral est face à l’expérimentateur. Épinglez ou retenez des appendices pour prévenir les interférences.
    5. Coupez la peau abdominale et le muscle ouvert, mais évitez de percer le foie. Couper verticalement vers le sternum, et ouvrir soigneusement le thorax tout en évitant le perçage du cœur. Continuez à couper à travers la cage thoracique pour exposer le cœur.
    6. À l’aide de forceps, soulevez doucement le cœur de la poitrine, coupant tout poumon ou excès de tissu attaché à l’extérieur du cœur. Retirer le ventricule et placer dans un puits de 6 assiettes de puits avec KHB froid. Continuez à disséquer les cœurs de cette manière jusqu’à ce que tous les échantillons aient été isolés.
  3. Dissociation enzymatique du cœur
    1. À l’aide de forceps, serrez et agitez à plusieurs reprises le cœur dans KHB pour enlever l’excès de sang. Transférer le cœur dans une plaque stérile propre de 10 cm2. À l’aide d’une seule lame de bord, hacher rapidement le cœur en petits morceaux.
    2. Ajouter 1 ml de cocktail de digestion de collagène et continuer à hacher jusqu’à ce que les morceaux soient assez petits pour être transférés avec une micropipette de 1 ml. Transférer les morceaux dans un tube conique de 50 ml avec une micropipette de 1 mL. Laver la plaque 2x avec 2 ml de cocktail de digestion de collagène.
      REMARQUE : Couper une partie de la pointe de la pipette peut aider à recueillir de plus gros morceaux de cœur qui pourraient autrement se coincer dans la pointe de la pipette.
    3. Incubate tube conique à 37 oC pendant 30 minutes avec bascule ou agitation. Tube sécurisé au besoin. Résuspendez 10x avec une pipet de 5 ml jusqu’à ce que le contenu soit homogène, et incubate le tube conical à 37 oC pendant 15 minutes avec rotation ou agitation.
    4. Résuspendez 10x avec une pipet de 10 ml jusqu’à consistance homogène. Primez une passoire cellulaire de 40 m en mouillant le filtre avec un tampon KHB de 1 à 2 ml au-dessus d’un nouveau tube conique de 50 ml. Ajouter 25 ml de tampon KHB à la suspension de digestion, à la résuspendance et filtrer à travers une passoire cellulaire de 40 m. Modifier le filtre au besoin.
      REMARQUE : Lorsque la filtration ralentit, le tube légèrement tapotant ou l’utilisation d’une micropipette de 1 ml pour tirer la suspension du dessous du filtre peut aider la suspension cellulaire à passer à travers une passoire cellulaire partiellement bloquée de 40 m.
    5. Centrifugeuse à 400 x g et 4 oC pendant 10 min. Retirez le supernatant et réutilisez la granule dans un tampon de 1x RBC lysis (5 ml/cœur). Incuber pendant 2 min à température ambiante (RT).
    6. Centrifugeuse à 400 x g et RT pendant 10 min. Enlever le supernatant puis laver en résumant des granulés dans 1 ml de tampon KHB.
    7. Ajouter 9 ml de tampon KHB et filtrer à travers la passoire cellulaire apprêtée de 40 m dans un nouveau tube conique de 50 ml. Centrifugeuse à 400 x g et RT pendant 10 min.
    8. Retirez le supernatant, la résuspendance dans 1 ml de multimédia ou de PBS, et déterminez le numéro de cellule. Les fibroblastes peuvent être isolés par les trois méthodes différentes décrites ci-dessous.

2. Isolement des fibroblastes de la suspension à cellule unique

  1. Isolement du fibroblaste : placage différentiel(figure 1)
    1. Préparer une plaque de 6 puits en ajoutant 2 ml de multimédia par puits et en faisant tourbillonner la plaque pour couvrir le fond du puits.
    2. Résuspendent les cellules dans 1 ml de médias par cœur. Plaque 1 ml de suspension cellulaire par puits de telle sorte qu’un cœur (théoriquement) est plaqué par puits. Par exemple, six cœurs seraient résiliés dans 6 ml de support, puis plaqués en six puits avec 1 ml de suspension cellulaire par puits.
    3. Plaque tourbillonnante pour répartir uniformément les cellules. Ajouter un support supplémentaire de 1 à 2 ml par puits pour un volume total allant jusqu’à 5 ml par puits, et incuber à 37 oC pour 4 h.
    4. Les fibroblastes seront séparés par adhérence sélective après 4 h. Enlever les cellules non attachées et mortes en enlevant les médias. Laver les cellules attachées avec 2 ml de PBS et ajouter 2 à 4 ml de multimédia de fibroblaste stérile par puits. Incuber à 37 oC jusqu’à confluent. Changez de média tous les 2 à 4 jours.
  2. Isolation fibroblaste : FACS utilisant un modèle de souris de journaliste GFP (figure 1)
    1. Tampon FACS
      1. Préparer 15 ml de sérum bovin fœtal (FBS) à 15 ml de sérum bovin fœtal (FBS) en dPBS sans Ca2 et Mg2. Conserver sur glace ou à 4oC.
    2. Solution de bloqueur FC
      1. Préparer le bloqueur FC de 0,5 L (CD16/CD32 anti-souris purifié) en 25 L de FACS (1:50 dilution). 25 L de solution de bloqueur FC est nécessaire par échantillon. Conserver sur glace ou à 4 oC.
    3. Préparation de l’échantillon et coloration d’anticorps
      REMARQUE : Les dilutions d’anticorps peuvent être préparées à l’avance, mais cela peut risquer une exposition à la lumière ou à la température.
      1. Préparer 7AAD ou Ghost teindre violet 510 qui est 2x la dilution requise dans le tampon FACS. Voir le tableau 1 pour les anticorps et les dilutions.
      2. Résuspendez 500 000 cellules fraîchement isolées dans une solution de blocage de 25 L de FC pour empêcher la liaison non spécifique de la région d’anticorps FC à un récepteur FC. Incubate pendant 5 min à RT.
      3. Ajoutez 7AAD ou Ghost teindre violet 510 anticorps au volume final de 25 L de suspension cellulaire. Incuber pendant 30-60 min sur la glace dans l’obscurité.
      4. Laver en resuspending dans 1 ml de tampon FACS. Centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min à 4 oC.
      5. Pellet de résuspendance dans le volume recommandé d’échantillon de cytométrie d’écoulement de tampon DE FACS (300 l) et transfert au tube de cytométrie d’écoulement.
    4. Tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)
      REMARQUE : Les souris de journaliste de GFP-SMA ont été une contribution du Dr Ivo Kalajzic11. Cette souris exprime GFP sous le promoteur alpha lisse de cellules musculaires lisses. Le SMA a été utilisé comme marqueur de fibroblastes activés (myofibroblastes)12.
      1. Pour l’isolement du fibroblaste activé (SMA exprimant le myofibroblast), induire l’infarctus du myocarde chez les souris GFP-SMA âgées de 12 semaines par ligature coronaire. Sacrifiez les souris 8 à 10 jours après une blessure.
      2. Suite à la suspension à cellule unique des cœurs de souris blessées, trier les fibroblastes de ve del’ASMA pour les protéines fluorescentes vertes (GFP). Utilisez des fibroblastes non blessés non contaminés pour définir le signal d’arrière-plan dans le canal GFP après la compensation.
      3. Porte pour les cellules GFPve en gating pour 7AAD-ve/GFP-ve cellules ou Ghost dye violet 510-ve/GFP've cellules et trier GFP exprimant myofibroblastes 'SMA've. Recueillir les cellules dans les médias de fibroblaste.
  3. Isolement du fibroblaste : isolement magnétique à base de perles des fibroblastes(figure 1)
    1. Tampon d’équilibre
      REMARQUE : Préparez toujours un tampon frais pour les isolements.
      1. Préparer 0,5% BSA et 2 mM EDTA dans PBS. Dégazer le tampon en remuant la solution tout en attachant un aspirateur au couvercle du récipient.
        REMARQUE : L’agitation élimine l’excès de gaz de la solution qui est ensuite enlevée par le vide de telle sorte que les bulles ne obstruent pas la colonne de séparation lors de l’utilisation.
    2. Étiquetage magnétique : CD45et cellules hématopoïétiques
      1. Centrifuge cellules isolées des cœurs de souris à 500 x g pendant 5 min, puis enlever le supernatant.
      2. Résuspendez la pastille de cellules en tampon d’équilibre de 1 ml. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
      3. Centrifuge la suspension cellulaire comme ci-dessus et résuspendez la pastille cellulaire dans un tampon d’équilibre de 90 l par 1 x 107 cellules totales. Ajouter 10 L de CD45et perles magnétiques par 1 x 107 cellules totales. Bien mélanger et incuber pendant au moins 15 minutes à 4 oC.
      4. Laver les cellules en ajoutant un tampon d’équilibre de 2 ml par 1 x 107 cellules totales, puis la centrifugeuse à 500 x g pendant 10 min à 4 oC.
      5. Enlever le supernatant, compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et résuspender jusqu’à 1 x 107 cellules totales dans 2 ml de tampon d’équilibre. Si plus de 107 cellules sont présentes, échelle le tampon linéairement. Passer les cellules à travers un filtre de 40 m pour empêcher les agrégations cellulaires d’obstruer la matrice de la colonne de séparation.
    3. Séparation magnétique : CD45et cellules hématopoïétiques
      1. Placez la colonne de séparation dans le champ magnétique d’un séparateur approprié et colonne d’équilibre avec au moins 3 ml de PBS.
      2. Recueillir les cellules non étiquetées dans le flowthrough (FT), et laver la colonne 3x avec 3 ml de tampon d’équilibre. Recueillir les lavages avec FT. Retirer la colonne du séparateur. Placez la colonne sur un tube conique de 15 ml.
      3. Débrinez les cellules CD45étiquetées magnétiquement en pipe de 5 ml de tampon d’équilibre sur la colonne et en plongeant fermement les cellules avec un piston fourni avec la colonne.
      4. Centrifuge eluent ainsi que FT/ lavage fractions à 500 x g. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
    4. Étiquetage et séparation magnétiques : CD31et cellules endothéliales
      1. Protocole de répétition pour l’étiquetage et la séparation de CD45et magnétiques (sections 2.3.2-2.3.3), sauf utiliser des perles magnétiques CD31pour incuber avec le FT et laver les parties du CD45et l’isolement.
    5. Étiquetage et séparation magnétiques : MEFSK4et fibroblastes
      1. Protocole de répétition pour l’étiquetage magnétique CD45à l’aide de l’anticorps MEFSK4 anti-alimentation-APC au lieu de perles magnétiques. Centrifuge les portions FT et Wash du CD31- isolement à 500 g pendant 5 min, puis retirer supernatant. Résuspendez la pastille cellulaire dans 1 ml de tampon d’équilibre, et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
      2. Ajouter 10 L d’anticorps anti-alimentation-APC MEFSK4 par 1 x 107 cellules. Incuber pendant au moins 15 minutes à 4 oC.
      3. Laver les cellules liées aux anticorps MEFSK4 en ajoutant 5 ml de tampon d’équilibre par 1 x 107 cellules totales, puis la centrifugeuse à 500 x g pendant 5 min.
      4. Retirez le supernatant et la résuspendance dans les perles anti-APC, en utilisant le même volume d’anticorps anti-alimentation-APC MEFSK4 utilisé. Incuber sur la glace pendant 15 min à 4 oC.
      5. Centrifugeuse à 500 x g pendant 10 min. Enlever le supernatant, la résuspendance dans 2 ml de tampon d’équilibre par 1 x 107 cellules totales, et procéder à la séparation magnétique comme décrit précédemment (section 2.3.3). Les fibroblastes MEFSK4+vede séparation magnétique /CD45 -ve/CD31-ve peuvent être utilisés pour des analyses de pureté et d’autres applications en aval.-ve-ve

3. Analyse de pureté et de fonctionnalité de la population fibroblastique isolée

  1. Analyse de la pureté de la population de FACS : analyse des cellules de la SMA-GFP(figure 2)
    1. Résuspendez des cellules fraîchement isolées dans la solution de blocage de 25 L de Fc pour empêcher la liaison non spécifique des anticorps. Incubate pendant 5 min à RT.
    2. Facultatif : ajouter 25 L de 7AAD ou Ghost teindre violet 510 à la suspension cellulaire. Incuber pendant 30-60 min sur la glace dans l’obscurité.
    3. Laver en resuspending dans 1 ml de tampon FACS. Centrifugeuse à 500 x g pour 5 min.
    4. Resuspendez des granulés dans 50 L de tampon FACS. Ajouter directement les anticorps CD31-PE, CD45-APC et AN2/NG2 directement à la suspension cellulaire. Incuber pendant 15 min sur la glace(tableau 1).
    5. Laver en resus en attendant dans un tampon FACS de 1 mL. Centrifugeuse à 400 x g pour 5 min.
    6. Ajouter l’anticorps anti-rat d’âne AlexaFluor 405 aux cellules étiquetées avec l’anticorps primaire non soumis. Incuber pendant 30 min sur la glace.
    7. Laver en resuspending dans 1 ml de tampon FACS. Centrifugeuse à 400 x g pour 5 min.
    8. Resuspendez les granulés dans le volume recommandé d’échantillon de cytométrie d’écoulement de tampon DE FACS (300 ll) et transfert à un tube de cytométrie de débit étiqueté pour l’analyse de flux.
      REMARQUE : L’analyse de FACS pour caractériser l’expression de l’antigène MEFSK4 sur les fibroblastes isolés est décrite dans la section 3.3.
  2. Analyse de pureté du fibroblaste : immunofluorescence(figure 3A)
    1. Graine 30 000 fibroblastes primaires (P0-P1) par puits sur les couvertures placées dans une plaque de puits de 24 et une culture jusqu’à 80 % confluent. Ou concentrez lescellules TRIées CD45+ et CD31 (30 000 cellules par puits) sur un coverlip par cytospin à 400 x g (méthode utilisée pour déposer des cellules directement et uniformément sur un coverlip dans une plaque de 24 puits).
    2. Fixer les cellules à l’acétone froide pendant 15 min. Laver 3x fois avec PBS.
    3. Bloc glisse dans le sérum de chèvre à 10 %. Glisse incubées avec anticorps primaires pendant la nuit (tableau 2).
    4. Laver les diapositives 3x dans PBS. Incuber les anticorps secondaires pour 2 h (tableau 2).
    5. Contre-place glisse, et monter avec une goutte de DAPI dans les supports de montage lent-fade.
  3. Analyse de la pureté de la population FACS : sondage MEFSK4(figure 3B)
    1. Résuspendez des cellules fraîchement isolées dans la solution de blocage de 25 L de FC pour empêcher la liaison non spécifique des anticorps. Incubate pendant 5 min à RT.
    2. Facultatif : ajouter 25 L de 7AAD ou Ghost teindre violet 510 à la suspension cellulaire. Incuber pendant 30-60 min sur la glace dans l’obscurité.
    3. Laver en resuspending dans 1 ml de tampon FACS. Centrifugeuse à 500 x g pour 5 min.
    4. Resuspendez des granulés dans 50 L de tampon FACS. Ajouter l’anticorps MEFSK4 directement à la suspension cellulaire. Incuber pendant 15 min sur la glace (tableau 1).
    5. Laver en resuspending dans 1 ml de tampon FACS. Centrifugeuse à 400 x g pour 5 min.
    6. Ajouter le rat IgG-APC aux cellules (tableau 1). Incuber pendant 30 min sur la glace.
    7. Laver en resuspending dans 1 ml de tampon FACS. Centrifugeuse à 400 x g pour 5 min.
    8. Pellet de résuspendance dans le volume recommandé d’échantillon de cytométrie d’écoulement de tampon DE FACS (300 l) et transfert au tube de cytométrie d’écoulement pour l’analyse de flux.
  4. Analyse de pureté fibroblaste : rtPCR semi-quantitatif en temps réel(figure 3C)
    1. Isolement de l’ARN et PCR semi-quantitatif en temps réel
    2. Suite à l’enrichissement des fibroblastes, isolez l’ARN à l’aide d’un kit d’isolation de l’ARN (voir Tableau des matériaux). Suivez les instructions du fabricant.
    3. Complétez la synthèse de l’ADN du premier brin à l’aide d’un kit de synthèse de l’ADN (voir tableau des matériaux),suivant les instructions du fabricant.
    4. Effectuer semiquantitative en temps réel PCR5.
  5. Analyse de fonctionnalité fibroblaste : analyse de la contractilité du gel de collagène (figure 4)
    1. Solution collagène
      1. Préparer 20 mM HEPES et 44 mM NaHCO3 en DMEM. Ajouter 1,67 mg de collagène de rat de type 1 par 1 ml de DMEM avec HEPES et NaHCO3.
    2. DMEM complété par TGFMD
      1. Préparer 10% FBS en DMEM complété par des antibiotiques et anti-fongiques. Ajouter TGFMD à une concentration finale de 1 ng/mL.
    3. Mélange de cellules/collagènes et placage
      1. Préparer la suspension cellulaire (P3-P5) et déterminer le volume requis pour obtenir 3,3 x 105 cellules.
      2. Ajouter le volume de suspension avec 3,3 x 105 cellules à une solution de collagène suffisante pour obtenir un volume total de 1 ml.
        REMARQUE : La concentration de type 1 de collagène de rat devrait maintenant être de 1,5 mg/mL.
      3. Dans une assiette de 48 puits, graine 300 L de mélange de collagène cellulaire par puits (1 x 105 cellules/puits). Incuber à 37 oC pendant 15-20 min jusqu’à ce que gélifié.
      4. Utilisez une aiguille de 30 G pour séparer le gel des murs du puits. Ajoutez 600 L de TGF ET FBS complété DMEM à chaque puits. Plaques d’image sur un scanner réfléchissant à 24 h et 48 h.
        REMARQUE : Toutes les expériences d’immunofluorescence ont été réalisées sur une machine de cytométrie de débit équipée de trois lasers (405 nm, 488 nm, et 640 nm). Les données ont été acquises à l’aide d’un logiciel d’acquisition de données de flux(Tableau des matériaux). D’autres analyses de données ont été effectuées à l’aide d’un logiciel d’analyse des données de flux. AlexaFluor 405 et Ghost Dye Violet 510 étaient excités par le laser 405 nm et recueillis à l’aide d’un filtre 450/50 BP et 525/50 BP, respectivement. GFP et PE ont été excités par le laser 488 nm et recueillis à l’aide des filtres BP 530/30 et 575/26 BP, respectivement. APC ou AlexaFluor 647 a été excité par le laser 640 nm et recueilli à l’aide d’un filtre BP 670/14. Toutes les expériences de tri cellulaire ont été réalisées sur une machine de cytométrie de débit(Tableau des matériaux) équipée de quatre lasers (405 nm, 488 nm, 561 nm et 640 nm). 7-AAD était excité à l’aide du laser 561 nm et recueilli avec un filtre BP 670/14. GFP et Ghost Dye Violet 510 ont été collectés à l’aide des mêmes combinaisons laser/filtre que décrits ci-dessus. Toutes les expériences de tri ont utilisé une buse de 100 um avec une configuration de pression de 17 psi pour une viabilité accrue en aval des cellules cibles.

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Résultats

Système de gating de flux démontrant l’isolement de myofibroblast utilisant des souris de journaliste de 'SMA-GFP
Les cœurs indemnes n’ont montré aucune GFP détectable- cellules dans le modèle de souris journaliste de 'SMA-GFP ; par conséquent, ils ont été utilisés pour établir une porte pour le signal de fond du canal GFP post-compensation(figure 2). Les cellulesde la SMA ont été triées en fonction de la présence de l’expression GFP du ventricule ga...

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Discussion

Les fibroblastes sont un groupe hétérogène de cellules, identifiée par divers ensembles de marqueurs. Les marqueurs protéiques qui ont été utilisés pour identifier les fibroblastes sont le récepteur du domaine de la discoïtine 2 (DDR2), la fibronectine, la vimentine, le collagène I et III, et Thy115,16,17,18,19,20. Alors que ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs veulent remercier le Dr Ivo Kalajzic pour les souris de la SMA-GFP. La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par l’Institut national des sciences médicales générales des National Institutes of Health (NIH) sous le numéro de prix R01GM118300 (S.S.), National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering of the NIH sous le numéro de prix R21EB019509 (P.P.Y.), et la subvention de développement scientifique de l’American Heart Association sous le numéro de prix 17SDG33630187 (S.S.). Des analyses de cytométrie de débit ont été effectuées au VUMC Flow Cytometry Shared Resource, qui est soutenu par le Vanderbilt Ingram Cancer Center (P30 CA68485) et le Vanderbilt Digestive Disease Research Center (DK058404).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
/forts
acétone
antifongique (amphotéricine B-solubilisée ; Fungizone)Sigma AldrichA9528
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma9048-46-8
Chlorure
citrate, tampon
de collagénase (Liberase Blendzyme 3 TH)Roche Applied Science
DAPI
DDI water
Eau
DMEM-F12 avec technologies L-Glutamine et HEPESLife11330057
Dnase I(20U/mL)BioRad7326828
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (dPBS) sans Ca2+ et Mg2+Gibco13190-144
70 % Ethanol
FC Blocker (Purifié anti-souris CD16/CD32)Tonbo Biosciences70-0161
Sérum de veau fœtal (FBS)Life technologies16000044
10 % de sérum
de chèvre Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS) avec Ca2+ et Mg2+Corning21-023-CV
1M HEPESCorning25-060-Ci
Krebs-Henseleit Buffer poudreSigmaK3753
Prophylaxie des mycoplasmes (Plasmocin)Invivogenant-mpp
Pénicilline/StreptomycineThermo Fisher Scientific15140122
1x Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)
10x Tampon de lyse des globules rougesMiltenyi130-094-183
Milieude montage à décoloration lente
Azoture de sodium
TGF&beta ;
Coloration bleue trypan (0,4 %)Gibco15250-061
Type 1 Collagène
anticorps
7AAD (stock : 1 mg/mL de solution dans du DMSO)Sondes moléculairesA1310dilution = 1:1000 ; RRID =
CD45-APCBD Bioscience559864dilution = 1:200 ; RRID = AB_398672
CD31-PEBD Bioscience553373dilution = 1:200 ; RRID = AB_394819
CD31BD Biosciences553370dilution = 1:250 ; RRID = AB_394816
CD45BD Biosciences553076dilution = 1:250 ; RRID = AB_394606
COL 1&alpha ; 1DM Bioproduits203002dilution = 1:1000 ; RRID =
Ghost dye violet 510 (Formulation : 1 uL/test dans le DMSO)Tonbo Biosciences13-0870dilution = 1:1000 ; RRID =
Chèvre anti-souris Sondes moléculaires Alexa Fluor 488A11029dilution = 1:200 ; RRID = AB_138404
Chèvre anti-lapin-Cy3Southern Biotech4050-02dilution = 1:200 ; RRID = AB_2795952
Chèvre anti-lapin-FITCJackson Immunoresearch Laboratories711-165-152dilution = 1:200 ; RRID = AB_2307443
Chèvre anti-rat Alexa Fluor 488Sondes moléculairesA11006dilution = 1:200 ; RRID = AB_2534074
Chèvre anti-rat Alexa Fluor 647Thermo-FisherA21247dilution = 1:200 ; RRID = AB_141778
PeriostinSanta CruzSC67233dilution = 1:100 ; RRID = AB_2166650
VimentinSigma AldrichV2258dilution = 1:200 ; RRID = AB_261856
&alpha ;-actine musculaire lisse (&alpha ;SMA)Sigma AldrichA2547dilution = 1:1000 ; RRID = AB_476701
Fibroblast specific protein 1 (FSP1)Millipore 07-227407-2274dilution = 1:100 ; RRID = AB_10807552
CD45 Perles magnétiquesMiltenyi Biotec130-052-301
CD31 Perles magnétiquesMiltenyi Biotec130-087-418
Anti-cellules nourricières-APC (MEFSK4)Miltenyi Biotec130-102-900dilution = 1:100 ; RRID = AB_2660619
billes anti-APCMiltenyi Biotec130-090-855
Rat IgG-APCMiltenyi Biotec130-103-034dilution = 1:100 ; RRID = AB_2661598
Âne anti-rat Alexa Fluor405Abcamab175670dilution = 1:100
anti-AN2/NG2Miltenyi Biotec130-097-455dilution = 1:11 ; RRID = AB_2651235
Autres matériaux
 ; m FiltreThermo Scientific723-2520
10 cm2 Plat de culture cellulaireCorning430167
10 mL PipetteFisherbrand13-678-11E
40 µ ; m Crépine à cellulesFisherbrand22363547
5 mLPipette Fisherbrand13-678-11D
50 mL Tube coniqueFalcon352070
Plaque 6 puitsCorning3506
Tubes de cytométrie en fluxFalcon352058
Forceps
Rocker
Lame à bord uniquePAL62-0177
Ciseaux chirurgicaux
GFP-&alpha ;SMA Souris
Séparateur MACS Champ
MACS
Séparation Colonne Couvre-lames Qaigen
Rneasy Mini KitQaigen74104
Ambion RNAqueous Micro Total IsolationAmbionAM1931
BioRad iScript cDNA Syntehsis KitBioRad1708891
48-well Plate
30G Needle
3 Laser Flow Cytometry Machine (BD LSRFortessa)BD Biosciences
4 Laser Flow Appareil de cytométrie (BD FACSAria III)BD Biosciences
(BD FACSDiva Software v8.0a)BD Biosciences
(FlowJo Software)BD Biosciences
de calcium, DI Bicarbonate de sodium0.22 µrapporteuresmagnétique Kit Logiciel d’acquisition de données de flux Logiciel d’analyse de données de flux

Références

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