Article de méthode

Génération d’Oligodendrocytes et de médium conditionné par oligodendrocyte s’est conditionné pour les expériences de co-culture

DOI :

10.3791/60912

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9 février 2020

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1Sorbonne Université, Inserm, CNRS, UMR7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, 2Assistance Publique-Hôpitaux de Paris, GH Pitié Salpêtrière, 3Ecole Supérieure des Techniques de Biologie Appliquée

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous affichons une méthode efficace pour la purification des oligodendrocytes et la production de milieu conditionné par oligodendrocyte s’il peut être utilisé pour des expériences de co-culture.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans le système nerveux central, les oligodendrocytes sont bien connus pour leur rôle dans la myélinisation des axones, qui accélère la propagation des potentiels d’action par conduction saltatoire. En outre, un nombre croissant de rapports suggèrent que les oligodendrocytes interagissent avec les neurones au-delà de la myélinisation, notamment par la sécrétion de facteurs solubles. Ici, nous présentons un protocole détaillé permettant la purification des cellules de lignée oligodendroglial des cultures gliales de cellules contenant également des astrocytes et des cellules microgliales. La méthode repose sur des secousses de nuit à 37 oC, ce qui permet le détachement sélectif des cellules oligodendroglial et des cellules microgliales sus-jacentes, et l’élimination des microglies par adhérence différentielle. Nous décrivons ensuite la culture des oligodendrocytes et la production du milieu oligodendrocyte-conditionné (OCM). Nous fournissons également la cinétique du traitement d’OCM ou des oligodendrocytes s’ajoutent aux neurones hippocampiques purifiés dans des expériences de co-culture, étudiant des interactions oligodendrocyte-neuron.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les oligodendrocytes (OL) sont des cellules gliales du système nerveux central (SNC) qui génèrent de la myéline enveloppant autour des axones. Les OL proviennent de cellules précurseurs oligodendrocytes (OPC) qui prolifèrent dans les zones ventriculaires du SNC embryonnaire, puis migrent et se différencient en OL sœurs entièrement matures (c.-à-d. cellules formant la myéline)1. Les CPVP sont abondants au début du développement, mais persistent également dans le cerveau adulte où ils représentent la population principale de cellules proliérantes2. Un seul OL ensheathes plusieurs axones dans des sections non-excitables (c.-à-d., internodes), et le bord de chaque boucle de myéline se fixe à l’axone formant le domaine paranoïaque qui est crucial pour les propriétés isolantes de la myéline1,3. Entre les paranoïdes se trouvent de petites lacunes non myélinistielles appelées les nœuds de Ranvier. Ces nœuds sont riches en canaux de sodium à rayons de tension (Nav), permettant la régénération et la propagation rapide des potentiels d’action par conduction saltatoire4. Cette interaction étroite permet également le soutien de l’énergie axonale par l’apprisesage neuronal du lactate des LO5,6.

La maturation des cellules de lignée oligodendroglial et le processus de myélinisation sont étroitement réglementés par leurs interactions avec les neurones7. En effet, les OL et les CPVP, également appelés cellules NG2, expriment un éventail de récepteurs pour les neurotransmetteurs, et peuvent recevoir l’entrée des neurones excitateurs et inhibiteurs, leur permettant de sentir l’activité neuronale qui peut déclencher leur prolifération et/ou différenciation en cellules myélinisantes2. À leur tour, les CPVP/OL sécrètent des microvésicules et des protéines dans l’espace extracellulaire qui seul ou synergiquement médiateur fonctions neuromodulative et neuroprotectrice8,9,10,11,12. Cependant, les mécanismes moléculaires contrôlant les multiples modes d’interactions entre les cellules de lignée oligodendroglial et les neurones n’ont pas encore été entièrement déchiffrés.

De plus, dans plusieurs conditions pathologiques du SNC, les OL sont principalement affectés, perturbant ainsi leur interaction avec les neurones. Par exemple, dans la sclérose en plaques (SEP), le dysfonctionnement neurologique est causé par la démyélinisation focale dans le SNC, secondaire à la perte de LD qui peut mener aux dommages axonaux et à l’accumulation connexe d’incapacité. La remyélinisation peut avoir lieu, bien qu’insuffisamment dans la plupart des cas13. Les progrès de la dernière décennie, dus au développement d’immunothérapies, ont réduit le taux de rechute, mais la promotion de la remyélinisation demeure à ce jour un besoin non satisfait. En tant que tel, une meilleure compréhension du rôle, des fonctions et des influences des CLO est particulièrement intéressante pour le développement de nouvelles thérapies pour un large éventail de maladies du SNC.

Ici, nous décrivons les méthodes de purification et de culture des OL. Cela permet un examen précis des mécanismes intrinsèques régulant leur développement et leur biologie. En outre, ces cultures d’OL fortement enrichies permettent la production de milieu conditionné par oligodendrocyte (OCM), qui peut être ajouté aux cultures de neurones purifiés pour avoir un aperçu de l’impact des facteurs sécrétés par les OL sur la physiologie neuronale et la connectivité. En outre, nous décrivons comment mettre en œuvre un système de co-culture in vitro où les oligodendrocytes purifiés et les neurones sont combinés ensemble, permettant d’aborder les mécanismes de régulation (re)myélinisation.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le soin et l’utilisation des rats dans cette expérience sont conformes aux politiques et directives institutionnelles (DIRECTIVE 86/609/CEE de l’UPMC, de l’INSERM et du Conseil communautaire européen). Le protocole suivant est établi pour une portée standard de 12 chiots.

1. Préparation des flacons (5 min)

REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes la veille de la dissection dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles.

  1. Enrober les flacons de 150 cm2 (T150) d’un bouchon de filtre (1 flacon pour 2 chiots) à l’aide de 5 ml de polyéthylèneinmine (PEI, 100 mg/L, voir protocole dans le fichier supplémentaire 1).
  2. Conserver les flacons à 4 oC pendant la nuit.
  3. Rincer les flacons enduits 3 fois avec de l’eau distillée stérile le jour de la dissection.

2. Préparation des médias (10 min)

REMARQUE : Effectuez les étapes dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles.

  1. Préparer 500 ml de milieu de culture, composé du milieu eagle modifié de Dulbecco (DMEM) complété de 10 % de sérum fœtal de veau (FCS) et de pénicilline-streptomycine (100 UI/mL).
  2. Préparer 20,6 ml du milieu de digestion enzymatique dans un tube de 50 ml, composé de 20 ml de DMEM, de 200 l de DNase (50 g/mL), de 200 oL de papaïne (30 U/mL) et de 200 l de L-cystéine (0,24 mg/mL).
  3. Filtrer-stériliser le support à l’aide d’un filtre de 0,22 m.
  4. Gardez le support dans le capot à débit laminaire à température ambiante (RT) jusqu’à la dissection.

3. Préparation à la dissection (10 min)

REMARQUE : Effectuez les étapes dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles.

  1. Préparer 100 ml de salin tamponné par le phosphate sans calcium et magnésium (PBS; 1x). Filtrer-stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 m.
  2. Préparer 50 ml de solution 1x PBS glacée complétée par 750 ll de 45 % de glucose. Filtrer-stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 m.
  3. Remplissez un plat Petri de 100 mm avec 1x PBS pour les instruments de nettoyage et trois plats Petri de 60 mm avec du PBS-glucose glacé pour la récolte des tissus. Mettre les boîtes de Pétri sur la glace jusqu’à la dissection.

4. Dissection

REMARQUE : La dissection est effectuée à partir de chiots mâles et femelles de rat Wistar au jour postnatal (P) 2.

  1. Afin de fournir un environnement stérile, assurez-vous de nettoyer le banc avec 100% d’éthanol. Stériliser tous les outils chirurgicaux avec 100% d’éthanol.
  2. Vaporiser délicatement le cou du chiot avec 70% d’éthanol.
  3. Utilisez de gros ciseaux chirurgicaux pour décapiter l’animal et placez la tête dans un plat Petri de 100 mm contenant du PBS-glucose glacé.
  4. Utilisez des forceps incurvés pour maintenir la tête de l’animal au niveau des yeux. Utilisez de petits ciseaux chirurgicaux pour faire une petite incision à la base du crâne et couper le crâne en suivant la ligne médiane du cerveau.
  5. Utilisez des forceps pour décoller délicatement les deux parties du crâne de la ligne médiane.
  6. Utilisez une petite cuillère chirurgicale pour enlever le cerveau de la cavité de la tête. Placez le cerveau dans un plat Petri de 60 mm contenant du PBS-glucose glacé sur la glace.
  7. En regardant sous un stéréomicroscope, utiliser des forceps fins pour enlever le cervelet, le tronc cérébral et les ampoules olfactives des hémisphères cérébraux.
  8. Utilisez des forceps fins pour séparer les deux hémisphères cérébraux. Utilisez des pinces fines pour décoller les méninges. Mettre les cortices cérébraux dans un plat de 60 mm-petri sur la glace.
    REMARQUE : Le PBS glacé est essentiel pour corriger l’élimination des méninges.

5. Dissociation tissulaire

REMARQUE : Effectuez les étapes dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles.

  1. Utilisez un scalpel pointu pour hacher finement les cortices cérébraux. Transférer le tissu haché dans un tube de 50 ml contenant un milieu de digestion enzymatique.
  2. Incuber pendant 30 min dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO2.
  3. Utilisez une micropipette p1000 pour enlever doucement le milieu de digestion enzymatique tout en vous assurant que le tissu cortical reste au fond du tube de 50 ml.
  4. Utilisez une micropipette p1000 pour ajouter 1 ml de DMEM-10% FCS et triturate doucement le tissu.
  5. Utilisez un filtre de 70 m et un piston d’une seringue de 1 ml pour filtrer le tissu cortical dans un tube de 50 ml.
    REMARQUE: On peut rincer le tissu résiduel sur la paroi du tube intérieur à plusieurs reprises avec DMEM-10% FCS.
  6. Remplissez le tube de 50 ml avec DMEM-10%FCS. Centrifugeuse à 423 x g pendant 5 min à RT. Retirez soigneusement le supernatant et resuspendez le granule de cellules avec 2 mL de DMEM-10%FCS.
  7. Triturate doucement le granule de cellules avec une micropipette p1000, puis avec une micropipette p200. Diluer la suspension cellulaire avec le volume approprié de DMEM-10%FCS.
    REMARQUE : Deux cerveaux, un T150 et 5 ml de DMEM-10 %FCS.
  8. Plaque 5 ml de la suspension cellulaire sur un T150 à une densité de 1 x 105 cellules/cm2. Ajouter 20 ml de DMEM-10%FCS chaud à chaque T150. Incuber dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO2.
  9. Renouveler la moitié du milieu de culture après 6 jours in vitro (DIV) avec dMEM-10%FCS chaud.

6. Préparation de secousses

  1. Effectuer la préparation de secousses le jour avant de secouer dans une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles.
  2. Renouveler la moitié du milieu de culture en ajoutant un milieu de culture frais et chaud dans le flacon et incuber à 37 oC sous 5 % co2.

7. Secouer

  1. Enrober trois plats Petri de 100 mm avec pei. Conservez-les à 4 oC pendant la nuit.
  2. Couvrir le bouchon de flacons de film de paraffine et mettre les flacons dans un sac en plastique. Secouer les flacons contenant des cellules gliales pendant la nuit à 250 tr/min à 37 oC.
    REMARQUE : Les premières secousses sont effectuées à 8 DIV et on peut effectuer jusqu’à trois secousses différentes (voir la figure 1 pour le moment).

8. Récolte et culture des cellules de lignée d’OL

REMARQUE : Ces étapes doivent être exécutées dans une hotte à flux laminaire dans des conditions stériles.

  1. Le lendemain de la secousse, préparer Bottenstein-Sato (BS) moyen selon le tableau 1.
  2. Rincer les plats Petri enrobés 3 fois avec de l’eau distillée stérile.
  3. Récolte des flacons supernatant contenant principalement des cellules de lignée d’OL mais aussi quelques cellules microgliales et l’aplatons sur des plats Petri non enrobés de 100 mm.
    REMARQUE : Cette étape permet d’enlever les cellules microgliales par l’adhérence rapide différentielle sur la surface du plat.
  4. Incuber les plats Petri pendant 15 min dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO2.
  5. Remplir chaque flacon T150 de 25 ml de milieu de culture chaud fraîchement préparé et couver dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % de CO2 jusqu’à la deuxième secousse.
  6. Transférer le supernatant des plats Petri dans de nouveaux plats Petri non enrobés de 100 mm pour permettre l’adhérence des cellules microgliales résiduelles.
  7. Incuber les plats Petri pendant 15 min dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO2.
  8. Retirez le supernatant, qui contient des cellules de lignée OL non adhérentes, et transférez-le en tubes de 50 ml (supernatant de 2 plats Petri pour un tube de 50 ml). Jeter les plats Petri plaqués de microglies.
  9. Centrifugeuse le supernatant pendant 5 min à 423 x g. Retirez soigneusement le supernatant et resuspendre le granule de cellules avec 1 ml de milieu BS. Mettre toutes les pastilles dans un tube commun de 50 ml et ajuster le volume à 10 ml avec le milieu BS.
  10. Déterminer la densité cellulaire en comptant les cellules au microscope.
    REMARQUE : Il faut obtenir une densité cellulaire comprise entre 3 x 105/mL et 5 x 105/mL.
  11. Ajouter 20 ml de BS si la densité cellulaire est supérieure ou égale à 4 x 105/mL pour obtenir un volume final de 30 ml, ou ajouter seulement 10 ml de BS si la densité cellulaire est inférieure à 4 x 105/mL pour obtenir un volume final de 20 ml.
  12. Assiette deux ou trois plats Petri pré-enduits de 100 mm avec 10 ml de suspension cellulaire. Incuber dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO2.
  13. Effacer les débris de la vaisselle Petri en rafraîchissant tous les BS moyen 2 h plus tard.
    REMARQUE : Examiner la culture au microscope avant et après le déblaiement pour vérifier la densité cellulaire et l’efficacité de l’enlèvement des débris.
  14. Incuber pendant 2 jours en milieu BS dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO2.
    REMARQUE : Examinez la culture au microscope. La confluence devrait être de 70% à 80%.

9. Production d’OCM

REMARQUE : Effectuez ces étapes dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles.

  1. Préparer nb-B27low medium selon le tableau 2.
  2. Renouveler le milieu de culture avec 10 ml de milieu chaud NB-B27low. Incuber pendant 2 jours dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO2.
  3. Récoltez l’OCM, c’est-à-- c’est-à-d. le supernatant contenant des facteurs sécrétés par les OL. Filtrer-stériliser OCM à l’aide d’un filtre de 0,22 m.
    REMARQUE : Conserver l’OCM à 4 oC pendant un maximum de 2 mois.

10. Ajout d’OCM

REMARQUE : Les étapes doivent être effectuées dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles. L’OCM peut être ajouté aux cultures purifiées de neurones hippocampiques préparées selon le protocole suivant14,et obtenues en ajoutant, 24 h après l’isolement, l’uridine des agents antimitotiques et 5- fluorodeoxyuridine (5 M) pour 36 h.

  1. À 3 DIV, retirez tous les milieux de culture neuronale contenant des agents anti-mitotiques et ajoutez 500 L d’OCM chaud frais.
  2. Renouveler la moitié du milieu tous les 3 jours avec nb-B27 chaud fraîchement préparé.
    REMARQUE: De telles cultures peuvent être maintenues jusqu’à 21 DIV.

11. Ajout de l’OL à la culture des neurones hippocampiques purifiés

REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes dans une hotte à débit laminaire dans des conditions stériles. Les OL peuvent être ajoutés aux cultures hippocampales purifiées obtenues de la même manière que décrite ci-dessus.

  1. Préparer le milieu de la co-culture selon le tableau 3.
  2. Récupérez la culture des OL à 70% à 80% de confluence. Rincer à 2 ml de 1x PBS chaud.
  3. Pour détacher les cellules, ajouter 2 ml de trypsine de 0,25 % à un plat Petri de 100 mm.
  4. Incuber 5 min dans un incubateur humidifié à 37 oC sous 5 % CO2.
  5. Ajouter 2 mL de DMEM-10% FCS pour bloquer la réaction enzymatique. Récoltez le supernatant contenant des cellules de lignée d’OL.
  6. Centrifugeuse à 423 x g pendant 5 min à RT. Retirez soigneusement le supernatant et suspendez le granule cellulaire dans un milieu de co-culture chaud pour obtenir une concentration de 1,25 x 105 cellules/mL.
  7. Ajouter l’OL à la culture des neurones hippocampes purifiés en supprimant 200 L du milieu de culture neuronale et en ajoutant 200 ll de suspension cellulaire par puits (2,5 x 104 cellules/puits) d’une plaque de 24 puits.
  8. Rafraîchir la moitié du milieu de co-culture tous les 2-3 jours.
    REMARQUE : Les co-cultures peuvent être maintenues jusqu’à 24 DIV.

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Résultats

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Dans ce protocole, les cellules de lignée d’OL sont purifiées des cultures gliales en secouant des astrocytes et des microglies. L’examen de pureté et phénotypique des cultures d’OL peut être évalué par immunostaining avec des marqueurs glial15. L’analyse de l’expression de différents marqueurs a indiqué que les cultures d’OL étaient pour la plupart des pré-OL avec 90 % - 4 % des cellulesO4, 85 % et 7 % decellules NG2, et 4,7 % - 2,1 % des

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour obtenir des cultures cellulaires oligodendroglial hautement enrichies de cellules de lignée de glial, adapté d’une méthode précédemment éditée16, et la production suivante du milieu OL-conditionné. Cette technique de secousse n’est pas coûteuse, peut être répétée trois fois et est optimale pour obtenir une grande quantité d’OL purifiés, comme les cellules cultivées dans Bottenstein-Sato (BS) milieu contenant PDGF prolifèrent. Les cellules gliales so...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aucun des auteurs n’a d’intérêts contradictoires ou contradictoires.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tient à remercier Rémi Ronzano pour ses sages conseils en édition manuscrite. Ces travaux ont été financés par l’ICM, l’INSERM, la subvention de la fondation ARSEP à NSF et le prix Bouvet-Labruyère.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
5-fluorodésoxyuridineSigmaF0503
B27 supplémentThermoFisher17504044
D-(+)-Glucosesolution SigmaG8769
DNase (désoxyribonucléase I)WorthingtonLS002139
Dulbecco’s Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
Ethanol 100 % Sigma32221-M
Éthanol 70 %VWR Chemicals83801.360
Sérum de veau fœtalThermoFisher10082147
L-cystéineSigmaC7352
ThermoFisher neurobasal21103049
PapainWorthingtonLS003126
Pénicilline-StreptomycineThermoFisher15140122
Saline tamponnée au phosphate sans calcium ni magnésiumThermoFisherA1285601
Polyéthylénimine(PEI)SigmaP3143
Tétraborate décahydratéSigmaB9876
TrypsineSigmaSigma
UridineSigmaU3750
Bottenstein-Sato (BS) media
apo-Transferrin humanSigmaT1147
BSA (Bovine Serum Albumin)SigmaA4161
Dulbecco’s Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
InsulinSigmaI5500
PDGFPeprotechAF-100-13A
Pénicilline-StreptomycineThermoFisher15140122
ProgestéroneSigmaP8783
Dichlorhydrate de putrescineSigmaP5780
Sélénite de sodiumSigmaS5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-sel sodique de thyronine)SigmaT6397
T4 ( L-Thyroxine)SigmaT1775
Milieu de co-culture
Apo-Transferrin humainSigmaT1147
B27 supplementThermoFisher17504044
BiotinSigmaB4639
BSA (Bovine Serum Albumin)SigmaA4161
CéruloplasmineSigma239799
Dulbecco’s Modified Eagle MediumThermoFisher31966021
HydrocortisoneSigmaH4001
InsulineSigmaI5500
N-Acétyl-L-cystéineSigmaA8199
NeurobasalThermoFisher21103049
Pénicilline-StreptomycineThermoFisher15140122
ProgestéroneSigmaP8783
PutrescinSigmaP5780
Recombinant Humain CNTFSigma450-13
Sélénite de sodiumSigmaS5261
T3 (3,3',5-Triiodo-L-sel sodique de thyronine)SigmaT6397
Vitamine B12SigmaV6629
Tools
0.22 µ ; m filtreSartorius514-7010
Seringue de 1 mLTerumo1611127
100 mm Boîte de PétriDutscher193100
Tube de 15 mLCorning Life Science734-1867
Tube de 50 mLCorning Life Science734-1869
Boîte de Pétri de 60 mmDutscher067003
70 & micro; m filterMiltenyi Biotec130-095-823
Microscope binoculaireOlympusSZX7
Pince courbeOutils pour les sciences fines11152-10
Pince poursciences fines Outils pour les sciences 91150-20
Grands ciseaux chirurgicauxOutils pour les sciences fines14008-14
ScalpelSwann-morton233-5528
ShakerInfors HT
Petits ciseaux chirurgicauxFine Science Tools91460-11
Petite cuillère chirurgicaleBar Naor LtdBN2706
T150 cm2 flacon avec bouchon filtrantDutscher190151
Animal
P2 Wistar ratJanvierRjHAn :WI
les

Références

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