Nous détaillons une méthode simple pour produire des films à time-lapse haute résolution d’essaims pseudomonas aeruginosa qui répondent à la bactériophage (phage) et au stress antibiotique à l’aide d’un scanner de documents à plat. Cette procédure est une méthode rapide et simple pour surveiller la dynamique des essaims et peut être adaptée pour étudier la motilité et la croissance d’autres espèces bactériennes.
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Article de méthode
Imagerie en accéléré des essaims bactériens et de la réponse collective au stress
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’essaimage est une forme de motilité de surface observée chez de nombreuses espèces bactériennes, y compris Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coli. Ici, des populations denses de bactéries se déplacent sur de grandes distances dans les communautés caractéristiques en forme de tendril au cours des heures. L’essaimage est sensible à plusieurs facteurs, y compris l’humidité moyenne, l’humidité et la teneur en éléments nutritifs. En outre, la réponse collective au stress, qui est observée dans P. aeruginosa qui sont stressés par les antibiotiques ou le bactériophage (phage), repousse les essaims de s’approcher de la zone contenant le stress. Les méthodes décrites ici traitent de la façon de contrôler les facteurs critiques qui affectent l’essaimage. Nous introduisons une méthode simple pour surveiller la dynamique des essaims et la réponse collective au stress à haute résolution temporelle à l’aide d’un scanner de documents à plat, et décrivons comment compiler et effectuer une analyse quantitative des essaims. Cette méthode simple et rentable fournit une quantification précise et bien contrôlée des essaimages et peut être étendue à d’autres types d’essais de croissance à base de plaques et d’espèces bactériennes.
Introduction
L’essaimage est une forme collective de motilité bactérienne coordonnée qui augmente la résistance aux antibiotiques et la production de facteurs de virulence dans l’hôte1,2,3. Ce comportement multicellulaire se produit sur les surfaces semi-solides qui ressemblent à celles des couches muqueuses couvrant les membranes épithéliales dans les poumons4,5. Les biosurfacteurs sont généralement produits par des populations grouillantes pour surmonter la tension de surface sur les surfaces et la production de ceux-ci est régl....
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Protocole
1. Préparation des plaques d’agar grouillantes pour p. aeruginosa Swarming Time-lapse Imaging
- Préparer 1 L de 5x M8 média minimum dans une bouteille en verre en ajoutant 64 g de Na2HPO47H2O, 15 g de KH2PO4, et 2,5 g de NaCl dans 500 mL d’eau double distillée (ddH2O). Ajuster le volume final à 1 L avec ddH2O. Autoclave supplémentaire pour stériliser et stocker les supports liquides à température ambiante.
- Préparer 100 ml de MgSO4 mgSO 4 (sulfate de magnésium) dans une bouteille en verre en ajoutant 24,6 g de MgSO4à 7H2O dans 50 mL d....
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Résultats
Les étapes pour cultiver P. aeruginosa,stressent les cellules, et imagent les plaques d’agar grouillantes sont représentées dans la figure 1. Nous avons inoculé une seule colonie de souche P. aeruginosa UCBPP-PA14 de type sauvage à partir d’une plaque de LB-agar dans 2 ml de bouillon LB pendant la nuit à 37 oC et repérée à 5 ll au centre de la plaque d’agar qui grouille. L’imagerie en time-lapse de cette plaque révèle la croissance initiale sous la forme d’une colonie au centre, puis la.......
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Discussion
Ce protocole met l’accent sur la réduction de la variabilité des plaques d’agar grouillantes et la fourniture d’une méthode simple et peu coûteuse pour acquérir des images en time-lapse de P. aeruginosa grouillant et répondant au stress. Cette procédure peut être étendue à l’image d’autres systèmes bactériens en adaptant la composition des médias et les conditions de croissance. Pour P. aeruginosa, bien que M9 ou FAB milieu minimal peut être utilisé pour induire essaimage16,.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
J.-L.B., A.S., et N.M.H-K. écrit et révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont conçu les expériences. J.-L.B. a effectué les expériences et l’analyse. Ce travail a été soutenu par le prix des NIH K22AI112816 et la subvention R21AI139968 aux A.S. et à l’Université de Californie. N.M.H-K. a reçu l’appui des bourses Lundbeck R220-2016-860 et R251-2017-1070. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la décision de soumettre l’œuvre à la publication. Nous n’avons pas d’intérêts contradictoires à déclarer.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Gélose réactifs | |||
| gélose Bacto, déshydratée | BD Difco | 214010 | Pour plaque de gélose LB et plaque de gélose d’essaimage |
| Casamino | acides aminés BD Difco | 223050 | Pour milieu d’essaimage |
| D-Glucose | Fisher Chemical | D16500 | Dextrose. Pour les milieux d’essaimage, |
| fosfomycine, sel disodique | Tokyo Chemical Industry | F0889 | Concentration de la matière : 200 mg/mL. Dissous dans ddH2O |
| Sulfate de gentamycine | Sigma-Aldrich | G1914 | Concentration stock : 3 mg/mL. Dissous dans le ddH2O |
| Sulfate de kanamycine | Sigma-Aldrich | 60615 | Concentration mère : 100 mg/mL. Dissous dans du ddH2O |
| LB-Miller | BD Difco | 244620 | Pour le bouillon LB et les plaques de gélose LB |
| Sulfate de magnésium heptahydraté | Sigma-Aldrich | 230391 | Pour les milieux essaimage |
| Phosphate de potassium monobasique | Sigma-Aldrich | P0662 | Pour 5x milieux M8 |
| Chlorure de sodium | Sigma-Aldrich | S9888 | Pour 5x milieux M8 |
| Phosphate de sodium dibasique heptahydraté | Fisher Chemical | S373 | Pour 5x milieux M8 |
| souches | |||
| Pseudomonas aeruginosa | Siryaporn lab | AFS27E.118 | PA14 souche |
| DMS3vir | O’Toole lab | DMS3vir20 | Bactériophage |
| < strong>Supplies | |||
| Papier de verre en oxyde d’aluminium | 3M | 150 Fine | Pour couvercles noirs |
| Tissu noir | Joann | PRD7089 | Tissu noir |
| Peinture en aérosol noire | Krylon | 5592 Noir mat | Pour couvercles noirs |
| Erlenmeyer flask | Kimax | 26500 | 250 mL |
| Bouteilles de stockage en verre | Pyrex | 13951L | 250 mL, 500 mL, 1 000 mL |
| Attaches zippées de 8 pouces | Gardner Bender | E173770 | Pour fixer des boîtes de Pétri en tissu noir mat |
| (100 mm x 15 mm) | Plaques de | polystyrène Fisher FB0875712 100 mm x 15 mm | |
| Bâtonnets en bois | Fisher | 23-400-102 | Pour le stries et l’inoculation de bactéries |
| Équipement | |||
| Marché de l’autoclave | Forge Industries | STM-E | Pour la stérilisation des réactifs |
| Pipette de 25 mL | USA Scientific, Inc. | 1072-5410 | À pipeter 20 mL pour plaques de gélose en essaim |
| Déshumidificateur | Frigidaire | FAD704DWD 70 pintes | Pour maintenir l’humidité relative de la pièce à environ 45 |
| %ImageJ | NIH | v1.52a | Logiciel pour l’analyse d’images |
| Incubateur | VWR | 89032-092 | Pour la croissance des bactéries à 37 ° ; C |
| Bain-marie Isotemp | Fisher | 15-462-21Q | Pour fluide de refroidissement à 55 ° ; C |
| Hotte à flux laminaire | The Baker Company | SG603A | Pour le séchage des plaques |
| Pipette P-20 | Gilson | F123601 | Spotting sur plaques d’agglomération |
| Contrôleur de pipette | BrandTech | accu-jet | To pipette 20 mL pour l’essaimage des plaques d’agar |
| Roller Drum | New Brunswick | TC-7 | Pour la croissance des bactéries à 100 tr/min |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V370 | Scanner photo pour plaques d’imagerie |
| Logiciel d’automatisation de scanner | RoboTask Lite | v7.0.1.932 | Pour l’imagerie interne de 30 min |
| Logiciel d’acquisition d’images Epson | v9.9.2.5US | Logiciel pour plaques d’imagerie |
Références
- Butler, M. T., Wang, Q., Harshey, R. M. Cell density and mobility protect swarming bacteria against antibiotics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3776-3781 (2010).
- Lai, S., Tremblay, J., Déziel, E.
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Réimpressions et autorisations
