Une méthode de dépistage pour l’identification des médicaments favorisant l’hétérochromatine à l’aide de Drosophila

Résumé

Drosophila est un modèle expérimental largement utilisé adapté aux médicaments de dépistage avec des applications potentielles pour la thérapie contre le cancer. Ici, nous décrivons l’utilisation des phénotypes variés de couleur d’oeil de Drosophila comme méthode pour le criblage des composés de petites molécules qui favorisent la formation d’hétérochromatine.

Résumé

Drosophila est un excellent organisme modèle qui peut être utilisé pour dépister les composés qui pourraient être utiles pour la thérapie contre le cancer. La méthode décrite ici est une méthode in vivo rentable pour identifier les composés heterochromatin-promotion en utilisant Drosophila. La souche DX1 de la Drosophila, ayant un phénotype de couleur œil varié qui reflète les étendues de la formation d’hétérochromatine, fournissant ainsi un outil pour un écran de drogue hétérochromatine-promotion. Dans cette méthode de criblage, la variété des yeux est quantifiée en fonction de la surface de la pigmentation rouge occupant des parties de l’œil et est notée sur une échelle de 1 à 5. La méthode de dépistage est simple et sensible et permet de tester les composés in vivo. Le dépistage des drogues utilisant cette méthode fournit un moyen rapide et peu coûteux pour identifier les médicaments hétérochromatine-promotion qui pourraient avoir des effets bénéfiques dans la thérapeutique de cancer. L’identification des composés qui favorisent la formation de l’hétérochromatine pourrait également mener à la découverte des mécanismes épigénétiques du développement du cancer.

Introduction

L’hétérochromatine est une forme condensée de l’ADN qui joue un rôle central dans l’expression des gènes, dans la régulation de la ségrégation chromosomique pendant la division cellulaire, et dans la protection contre l’instabilité du génome¹. L’hétérochromatine a été considérée comme un régulateur de la répression génétique et pour protéger l’intégrité des chromosomes pendant la mitose cellulaire^2,3. Il est associé à la di- et tri-méthylation de l’histone H3 lysine 9 (H3K9me) lors de l’engagement de lignée^4,5. En outre, le recrutement de protéines hétérochromatines 1 (HP1) protéines de chromodomaine est également considéré comme associé à l’hétérochromatine et la répression épigénétique de l’expression génique⁶. Ces protéines sont des composants essentiels et des marqueurs de formation d’hétérochromatine.

Puisque l’instabilité génomique permet aux cellules d’acquérir des altérations génétiques qui favorisent la carcinogenèse, l’hétérochromatine est de plus en plus reconnue dans le développement du cancer et peut être ciblée pour le traitement du cancer^7,8. À l’heure actuelle, il n’existe aucun médicament bien établi pour aider la formation d’hétérochromatine. Ici, nous présentons une méthode simple et rapide mais efficace pour le criblage des composés à petites molécules qui favorisent la formation d’hétérochromatine. Le dépistage se fait en traitant Drosophila avec une bibliothèque de médicaments à petites molécules. Cette méthode tire parti d’un phénotype de couleur œil panaché dans la souche DX1Drosophila qui est influencée par les niveaux d’hétérochromatine. Les mouches DX1 contiennent un tableau tandem de sept transgènes P[lac-w], qui ont l’expression/dépression variée selon l’hétérochromatinisation, par conséquent, l’étendue de la variété dans la couleur des yeux reflètent le niveau d’hétérochromatine. Plus précisément, l’augmentation de l’hétérochromatine pourrait être détectée par la proportion croissante de couleur des yeux panachées (oeil blanc). Au contraire, la diminution de l’hétérochromatine serait détectée par la proportion croissante de l’expression transgénique P[lac-w] (œil rouge)^9,10,11,12.

Par conséquent, nous profitons de ce système transgène Drosophila qui produit un phénotype de couleur œil panachée puisque son expression est directement corrélée à la quantité d’hétérochromatine présente. Lors de la découverte de composés qui sont soupçonnés de favoriser la formation d’hétérochromatine, nous pouvons confirmer ce soupçon en utilisant d’autres méthodes telles que la tache occidentale. Ces substances hétérochromatine-promotion peuvent être développées plus loin pour des essais cliniques chez les patients à l’avenir.

Protocole

1. Préparation de la bibliothèque de médicaments

1. Identifier et préparer une pharmacie à dépister à l’aide d’un solvant approprié à une concentration désirée (p. ex., 10 mM dans DMSO).
   REMARQUE : Un exemple spécifique pour une bibliothèque de médicaments est le Set III d’oncologie du Programme thérapeutique du développement (DTP) du National Cancer Institute (NCI). Les composés de cet ensemble sont fournis sous la forme de 20 l à 10 mM en DMSO à 100 % dans deux plaques à fond U PP de 96 puits et stockées à -20 oC. Les cartes NCI Plate, et les données chimiques de base de chaque médicament pourraient être trouvées sur les sites Web suivants:
   Numéro de plaque NCI 4740
   Numéro de plaque NCI 4741

2. Écran pour les médicaments favorisant l’hétérochromatine utilisant Drosophila

1. Drosophila Drosophila Stratégie d’élevage(figure 1A)
   1. Jour 1: Cross three w¹¹¹⁸/Y; DX1/CyO mouches mâles et trois mouches vierges ou plus w¹¹¹⁸ femelles dans un flacon alimentaire de 25 mm x 95 mm avec 9 ml de médias alimentaires Drosophila standard (recette Bloomington). Configurez trois flacons de réplique pour chaque médicament et un contrôle pour l’écran.
      REMARQUE: DX1 mouches ont été gentiment fournis par James Birchler (Université du Missouri)^9,13.
   2. Jour 2 et Jour 3 : Permettre aux mouches de pondre des œufs pendant 2 jours à température ambiante (22 oC).
   3. Jour 4 : Utilisez une courte rafale de gaz CO₂ pour anesthésier les mouches parentes et éliminer les mouches du parent dans une « morgue à mouches » (une bouteille contenant 70 % d’alcool).
2. Nourrir les médicaments à Drosophila pour le dépistage.
   1. Diluer chaque composé de drogue du stock d’origine (20 l à 10 mM en DMSO à 100 % dans des plaques à fond U PP 96-well) à une concentration finale de 10 M avec 33% DMSO dans l’eau. Utilisez 33% DMSO dans l’eau sans aucun médicament comme le contrôle.
      REMARQUE : Certains médicaments sont mal solubles dans l’eau et ont été dissous dans DMSO. 100% DMSO est toxique pour les mouches. 33% est tolérable.
   2. Jour 4 : Pipette 60 l d’une solution médicamenteuse de 10 M ou contrôle sur le dessus de la nourriture à mouche. À ce stade, assurez-vous que les mouches parentes ont été enlevées et il ya des œufs de mouche et rampant larves de première étoile sur la nourriture.
   3. Jour 6 : Répétez le tuyauterie de 60 l de la même solution de drogue de 10 M à la fiole de nourriture.
      REMARQUE : Étant donné que les médicaments ont été ajoutés à la nourriture à la mouche, les aliments de surface supérieure contiennent près de 10 m de concentration et les aliments de fond ne pouvaient pas être entièrement pénétrés. Toutes les mouches pondent des œufs sur le dessus de la nourriture et mangent les aliments de surface supérieure.
3. Observez et marquez des changements de couleur des yeux.
   1. Deux jours après l’émergence des mouches F1 (environ le jour 14), examinez les mouches. Utilisez une courte rafale de CO₂ pour anesthésier les mouches F1 et retirer les mouches de leur fiole sur un tampon de dissection poreux avec du CO₂ en sirotant sous un papier filtre.
   2. Inspectez les mouches sur ce tampon sous un microscope à dissection. Examiner l’ensemble de la mouche et identifier tousw¹¹¹⁸/Y; DX1/MD heterozygous mâles par leur manque du phénotype dominant cyO aile bouclée.
   3. Marquez la couleur des yeux de chacun des w¹¹¹⁸/Y; DX1/MD heterozygous mâle vole sur une échelle de 1 à 5(figure 1B). Le pourcentage de couleur des yeux blancs a été évalué comme suit :
      1. la surface totale de surface totale des yeux dispersés rouges
      2. 6% - 25% taches rouges surface totale des yeux
      3. 26% - 50% taches rouges surface totale des yeux
      4. 51% - 75% taches rouges surface totale des yeux
      5. -gt;75% taches rouges œil surface totale
      REMARQUE : Alternativement, homogénéiser les têtes de mouche dans le méthanol à 100 % et utiliser un spectromètre pour mesurer la pigmentation oculaire à 450 nm d’OD. Sélectionnez seulement les mâles parce que PEV est plus prononcé chez les mâles DX1. Marquez plus de 10 mâles dans chaque flacon.
   4. Calculez l’indice de couleur moyen de tous les mâles de chaque flacon marqué. Effectuer des triplicates pour chaque composé (figure 1C).
      REMARQUE : Puisque la couleur des yeux varie selon l’âge, il s’agit d’une étape sensible au temps. La couleur des yeux doit être calculée au même âge - 2 jours. Habituellement , 10 mouches doivent être notées dans chaque flacon.
   5. Pour confirmer que les composés favorisent en effet la formation d’hétérochromatine, utilisez une technique différente comme le ballonnement occidental pour valider (figure 1G).

Résultats

Ce protocole a été utilisé avec succès pour dépister les composés qui favorisent la formation d’hétérochromatine à Drosophila, qui est un système in vivo efficace et peu coûteux pour le développement de médicaments (figure 1). Nous avons examiné une bibliothèque de médicaments à petites molécules, Oncology Set III, qui est composé de 97 médicaments autorisés par la FDA en oncologie, en utilisant la souche DX1 de Drosophila melanogaster (figure ...

Discussion

L’hétérochromatine est une forme condensée d’ADN qui joue un rôle central dans la régulation de l’expression des gènes. Il est de plus en plus reconnu dans le cancer et peut servir de cible potentielle pour la thérapie contre le cancer^15,16,17,18. Les composés à petites molécules sont couramment utilisés dans le développement de médicaments en raison des avantages dans la fabrication, la préser...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Drosophila		DX1 souche	DX1 mouches ont été aimablement fournies par James Birchler (Université du Missouri)
Drosophila médias alimentaires	UCSD fly kitchen
Méthotrexate	NCI bibliothèque de médicaments
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma	D2650
Ethyl alcool	Sigma	E7023-500ML