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Article de méthode

Traduire la purification de l’affinité ribosome (TRAP) pour étudier le développement de la racine d’Arabidopsis thaliana à une échelle spécifique au type cellulaire

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DOI :

10.3791/60919

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14 mai 2020

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1Department of Plant and Microbial Biology, University of Zurich, 2Biophore - UNIL, 3Laboratory of Cell and Molecular Biology, Institute of Biology, University of Neuchâtel

Dans cet article

Résumé

La traduction de la purification de l’affinité ribosome (TRAP) offre la possibilité de disséquer les programmes de développement avec un traitement minimal des organes et des tissus. Le protocole donne de l’ARN de haute qualité à partir de cellules ciblées avec un sous-unité ribosomal étiquetée protéine fluorescente verte (GFP). Les outils d’analyse en aval, tels que qRT-PCR ou ARN-seq, révèlent des profils d’expression spécifiques aux tissus et aux cellules.

Résumé

Dans cet article, nous donnons des instructions pratiques pour obtenir des données de traduction de différents types de cellules racinaires Arabidopsis thaliana par l’intermédiaire de la méthode de purification de l’affinité ribosome de traduction (TRAP) et de la préparation continue optimisée de bibliothèque à faible entrée.

En tant que matériau de départ, nous employons des lignées végétales qui expriment la protéine ribosomalE IFFOmalE RPL18 marquée par GFP d’une manière spécifique au type cellulaire par l’utilisation de promoteurs adéquats. Avant l’immunopurification et l’extraction d’ARN, le tissu est gelé, qui préserve l’intégrité des tissus et permet simultanément l’exécution d’études de série temporelle avec une résolution temporelle élevée. Notamment, les structures de mur cellulaire restent intactes, ce qui est un inconvénient majeur dans les procédures alternatives telles que les approches à base de tri cellulaire activée par fluorescence qui reposent sur le protoplasting tissulaire pour isoler les populations cellulaires distinctes. En outre, aucune fixation tissulaire n’est nécessaire comme dans les techniques basées sur la microdissection de capture laser, ce qui permet d’obtenir de l’ARN de haute qualité.

Cependant, l’échantillonnage des sous-populations de cellules et l’arn polysome-associé qui isolent limitent sévèrement les rendements d’ARN. Il est donc nécessaire d’appliquer des méthodes de préparation de bibliothèque suffisamment sensibles pour l’acquisition réussie de données par RNA-seq.

TRAP offre un outil idéal pour la recherche sur les plantes, car de nombreux processus de développement impliquent des voies de signalisation liées aux parois cellulaires et mécaniques. L’utilisation de promoteurs pour cibler des populations cellulaires spécifiques fait le pont entre le niveau d’organe et le niveau unicellulaire qui, à son tour, souffre de peu de résolution ou de coûts très élevés. Ici, nous appliquons TRAP pour étudier la communication cellule-cellule dans la formation latérale de racine.

Introduction

Poussé par l’application croissante des techniques de séquençage de nouvelle génération, la résolution spatiale en biologie du développement pourrait être augmentée. Les études contemporaines visent à disséquer les tissus vers le bas pour les types de cellules spécialisées, si ce n’est le niveau unicellulaire1,2,3,4. À cette fin, une pléthore de différentes méthodes a été conçue au cours des cinquante dernières années (voir figure 1A)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15.

De nombreux outils en science végétale ont été des adaptations de techniques qui ont été pionnières dans la recherche animale. Ce n’est pas le cas pour la méthode que nous introduisons en détail ici. En 2005, doté d’un solide fond de traduction de protéines, le Laboratoire Bailey-Serres a entrepris de concevoir des protéines ribosomales pour la purification ultérieure de l’affinité16. Ainsi, ils pourraient éviter le profilage polysome long et laborieux, qui est basé sur l’ultracentrifugation avec un gradient de saccharose et a été employé pour évaluer la traduction des ribosomes depuis les années 196017,18. La méthode a depuis été appelée purification d’affinité ribosome translationnelle (TRAP)16. Après des études réussies de traduction dans les plantes, Heiman et autres ont adapté TRAP pour les animaux19 et d’autres ont étendu son application à la levure20, Drosophila21, Xenopus22 et le poisson zèbre23,24.

Bien que la modification génétique du système modèle soit une condition préalable pour TRAP, qui limite son application aux espèces qui se prêtent à la transformation génétique, on peut simultanément exploiter cette objection pour cibler des sous-ensembles de cellules qui sont d’intérêt particulier et autrement extrêmement difficiles à isoler du tissu intact/organe25 (p. ex., les cellules dendritiques fortement ramifiées dans un cerveau de souris ou hyphes fongiques dans le tissu végétal infecté). Dans les plantes, toutes les cellules sont maintenues en place par des parois cellulaires qui forment la base du squelette hydrostatique26. Pour libérer une cellule végétale de cette matrice, les scientifiques ont soit physiquement coupé la cellule de son tissu environnant par microdissection de capture laser (LCM)27 ou effectué la digestion enzymatique des parois cellulaires28. Parmi ces dernières cellules, ce que l’on appelle les protoplastes, la population d’intérêt est étiquetée fluorescentement et peut être séparée par le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)7. LCM nécessite généralement un échantillon à fixer et intégré dans la cire, ce qui finit par détériorer la qualité de son ARN29. Les méthodes à base de FACS produisent de l’ARN de haute qualité, mais le processus de protoplasting lui-même introduit des différences dans l’expressiongénique 30 et les tissus avec des parois cellulaires secondaires modifiées et épaisses sont notoirement difficiles à traiter. En outre, de nombreux processus de développement dans les plantes sont supposés s’appuyer sur des signaux mécaniquement transmis et donc l’intégrité de la paroi cellulaire est d’une importance primordiale31. Deux méthodes, qui utilisent un raccourci pour contourner l’isolement cellulaire en opérant au niveau des nucléii, sont le tri nucléaire activé par la fluorescence (FANS) et l’isolement des noyaux marqués dans des types cellulaires spécifiques (INTACT). Comme dans TRAP, ils utilisent des promoteurs spécifiques au type de cellule pour marquer les noyaux, qui se sont ensuite enrichis par tri ou tirer vers le bas, respectivement8,15. Un défi majeur pour toutes ces approches est d’obtenir suffisamment de matériel d’ARN à partir de sous-ensembles de cellules dans un tissu. Comme TRAP ne capture qu’une fraction des ARN cellulaires, la collecte d’échantillons est un goulot d’étranglement considérable. Par conséquent, des protocoles de préparation de bibliothèque particulièrement sensibles sont nécessaires pour produire des données de haute qualité à partir de faibles quantités d’entrée.

Depuis sa création, TRAP a été utilisé en combinaison avec des microrésions d’ADN ou, comme les coûts de séquençage ont chuté de manière significative ces dernières années, RNA-seq10,32,33. Une multitude de questions de recherche a déjà été élucidée tel qu’il a été examiné dans Sablok et coll.34. Nous sommes convaincus que d’autres rapports suivront dans les années à venir, car la technique est très polyvalente lorsqu’elle combine différents promoteurs pour cibler des types de cellules spécifiques. Finalement, cela se fera même d’une manière inductible, et peut être combiné avec sonder la réaction de la plante à de nombreux facteurs de stress biotiques et abiotiques. En outre, lorsque des lignées transgéniques stables ne sont pas disponibles, les systèmes d’expression des racines poilues ont également été utilisés avec succès pour effectuer TRAP dans la tomate et medicago35,36.

figure-introduction-1
Figure 1 : La traduction de la purification de l’affinité ribosome (TRAP) complète le portefeuille d’analyse « omics ». R. L’augmentation des niveaux de précision analytique, jusqu’à la résolution unicellulaire ou même subcellulaire peut être obtenue par une pléthore de méthodes ou de combinaisons de celui-ci. Le programme donne un aperçu des outils actuellement disponibles dans le domaine des plantes et des animaux. La collecte de tissus à la résolution cellulaire peut être obtenue par des protocoles comme LCM ou FACS, qui sont ensuite couplés à un transcriptome standard ou à une analyse de profilage/traduction polysome. TRAP et INTACT intègrent à la fois la capture des tissus et l’isolement de l’ARN car ils sont basés sur l’épitope-marquage. Cependant, INTACT n’échantillonne que les noyaux cellulaires et constitue, par conséquent, un cas particulier d’analyse de transcriptome. Une petite icône de lapin marque des méthodes nouvellement développées dans le domaine animal : Alors que SLAM-ITseq et Flura-seq s’appuient sur la ciblage métabolique des ARN naissants avec des bases d’uracil modifiées dans les cellules exprimant l’enzyme permissive, Slide-seq utilise une diapositive en verre enduit avec des codes-barres d’ADN qui fournissent des informations de position dans la gamme cellulaire. Une approche d’étiquetage de proximité est suivie dans APEX-seq pour échantillonner les ARN dans des compartiments subcellulaires spécifiques. Notamment, une résolution accrue nécessite souvent la production de matériaux transgéniques (astérisques) et ces méthodes sont donc principalement utilisées pour les espèces modèles. TRAP est particulièrement adapté pour les études scientifiques végétales impliquant la paroi cellulaire (CW) ou la signalisation mécanique ainsi que les espèces cellulaires qui sont difficiles à libérer de leur matrice CW. B. Les étapes détaillées de la procédure TRAP : Les semis exprimant des protéines ribosomal étiquetées GFP dans des types cellulaires distincts (p. ex. endodermis de racine) sont cultivés sur des plats Petri pendant sept jours et des racines récoltées par congélation rapide. Un échantillon total de contrôle de l’ARN est prélevé sur l’extrait brut homogénéisé avant de pelleter les débris par centrifugation. Des perles magnétiques anti-GFP sont ajoutées à l’extrait effacé pour effectuer l’immunoprécipitation. Après l’incubation et trois étapes de lavage, l’ARN polysome-associé (TRAP/ARN polysome) est directement obtenu par extraction de phénol-chloroforme. LCM : microdissection de capture laser, FACS/FANS : tri cellulaire/nucléaire activé par fluorescence, APEX-seq: méthode basée sur l’ascorbate peroxidase, INTACT: isolation des noyaux étiquetés dans des types cellulaires spécifiques, SLAM-ITseq: thiol (SH) alkylation liée à la séquence métabolique de l’ARN dans les tissus, Flura-seq: fluorouracil-étiqueté RNA séquençage (Créé avec Biorender.com) S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Le but de cet article est de fournir une description détaillée de la méthode TRAP, de mettre en évidence les étapes critiques et de fournir des conseils pour une méthode de préparation possible de la bibliothèque.

Une expérience TRAP générique consistera essentiellement en les étapes suivantes (voir aussi la figure 1B) : (1) Préparation du matériel végétal, y compris le clonage de la construction de ribosome-marquage, la production et la sélection transgéniques de lignées, la culture et l’encombrement des graines, la stérilisation et le placage, et l’application/traitement du stress (facultatif) et la récolte des tissus; (2) l’immunopurification, y compris l’homogénéisation des tissus et le dégagement de l’extrait brut, le lavage et l’immunopurification des perles, et les étapes de lavage; (3) Évaluation de la qualité de l’ARN; et (4) la préparation de la bibliothèque.

La racine Arabidopsis a été un système modèle pour étudier le développement des plantes depuis son introduction comme une plante modèle37,38. Ici, l’application de TRAP est présentée dans le contexte du développement latéral des racines végétales. Dans les plantes, l’accumulation de l’ensemble du système racinaire repose sur l’exécution de ce programme et est donc très importante pour la survie de l’organisme39. Dans Arabidopsis, les racines latérales proviennent de tissu péricycle qui réside à côté des vaisseaux xylèmes et est donc appelé pericycle pôle xylème (XPP; voir figure 2C)40. Certaines cellules XPP, qui sont situées profondément à l’intérieur de la racine, acquièrent une identité cellulaire fondatrice et, sur un déclencheur hormonal local, commencent à proliférer en gonfleant et en divisant anticlinally41. Cependant, en raison de la présence d’une matrice rigide de mur cellulaire, ce processus exerce le stress mécanique sur les tissus environnants. En particulier, l’endoderme overlying est affecté, car il est dans la voie de l’axe de croissance latérale des racines42,43,44. En effet, le primordium nouvellement formé devra se développer à travers la cellule endodermis overlying (figure 2C2) tandis que les cellules cortex et épiderme sont juste repoussées pour que le primordium émerge enfin45,46. Des travaux récents dans notre laboratoire ont montré que l’endoderme contribue activement à la prolifération du péricycle. Le blocage ciblé de la signalisation hormonale endodermique est suffisant pour inhiber même la toute première division dans les cellules XPP47. Par conséquent, la communication péricycle-endodermis constitue un point de contrôle très précoce pour le développement latéral des racines dans Arabidopsis. On ne sait cependant pas comment cette traque est effectuée. Pour percer ce mystère, nous avons choisi l’approche TRAP-seq pour cibler XPP et les cellules endodermiques. Pour enrichir pour les cellules dans le programme de racine latérale, nous avons imité le déclencheur hormonal en appliquant exogènement un analogue auxin (acide à laphthalèneacécéétique, NAA)48, qui en même temps a permis de résoudre temporellement la phase initiale de la formation latérale de racine.

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Protocole

1. Clonage de la production et de la sélection transgéniques transgéniques

  1. Clonez le promoteur de choix dans le vecteur d’entrée approprié. Utilisez une méthode de clonage à base de recombinaison(Tableau des matériaux) et recombiner les promoteurs dans pDONRP4-P1r. Clone RPL18 (avec étiquette d’affinité ou protéine fluorescente de choix) en utilisant le clonage à base de recombinaison dans pDONRP1-P249.
  2. Combinez le vecteur d’entrée contenant RPL18 avec le vecteur d’entrée contenant le promoteur dans une réaction de recombinaison de deux fragments dans le vecteur de destination approprié avec la cassette de sélection rouge EXPRES50 pour faciliter la sélection directe des graines transgéniques.
  3. Vérifiez le vecteur recombiné par le séquençage et transformez-le en agrobactéries appropriées et compétentes. Trempette de fleurs Plantes Arabidopsis et après 3-4 semaines de récolte et de sélectionner les graines de T151.
  4. Utilisez la microscopie pour identifier les lignes bien exprimantes et vérifier les modèles d’expression en fonction de l’activité du promoteur signalé dans plusieurs lignes indépendantes. Sélectionnez des lignes montrant un modèle d’expression représentatif avec une seule insertion D’ADN T. Cela pourrait aider à minimiser le silence et sera avantageux pour les croix génétiques.
  5. Sélectionnez la progéniture T3 qui est homozygous pour le gène marqueur.

2. Propagation et stérilisation

  1. Cell type-spécifique TRAP isole l’ARN d’un nombre limité de cellules cibles par racine. Pour générer le matériau de départ nécessaire, propager des lignes homozygotes. À cette fin, utilisez des conditions de croissance standard en mettant l’accent sur le contrôle de la croissance fongique.
    REMARQUE : Si des lignes d’insertion simples ne peuvent pas être obtenues, cultivez des lots dans de grandes populations sur quelques générations pour éviter le silence transgénérationnel induit par le T-ADN.
  2. Stériliser de grandes quantités de graines d’Arabidopsis avec une série de gaz de chlore et un tour de 70% EtOH.
    1. Étendre les graines uniformément sur des plats Petri de 12 cm x 12 cm carrés (moins de 0,3 ml de graines/assiette) et les empiler dans un desiccateur ou un autre récipient approprié. Évitez la formation d’amas ou de tas car les graines doivent être accessibles au gaz. Effectuer la stérilisation du gaz pendant la nuit avec des volumes d’eau de Javel et de HCl comme indiqué52: 100 ml d’eau de Javel (13%) avec 6 mL de conc. HCl dans un desiccator de 60 L. Defumigate pendant au moins 1 h avant de recueillir les graines dans un récipient stérile.
      CAUTION: 37% HCl est très corrosif et nécessite une manipulation soigneuse. Le gaz de chlore est toxique, utilisez une hotte à fumée.
    2. Prenez 0,1 mL de graines sèches stérilisées au gaz par assiette et mélangez-les avec une solution de stérilisation (70 % EtOH, 0,01 % tween) à température ambiante. Incuber pendant 20 min, décantEr EtOH et laver les graines 3-4 fois avec stérile H2O.
    3. Transférer les graines trempées dans des tubes de 50 ml et diluer avec une mélo stérile de 0,1 % pour obtenir 1 ml de boue de graines imbibées par plaque (0,1 mL graine/1 mL de boue).
      REMARQUE : En raison d’événements d’intégration transgène, les lignées végétales peuvent être sensibles à différentes techniques de stérilisation; en particulier le temps d’incubation EtOH s’est avéré critique. Dans nos mains, les étapes de stérilisation double ont été nécessaires pour éviter la contamination fongique pendant les expériences. Ceci est particulièrement important lors de l’exécution des séries chronolocuteurs que la contamination d’un point de temps unique entrave l’expérience entière. Il se pourrait bien que la double stérilisation ne soit pas toujours nécessaire, selon les conditions de croissance locales.

3. Plating

  1. Préparer ces étapes à l’avance. Verser 1/2 plaques de MS (pH 5,8) avec 1% d’agar dans les quantités nécessaires à l’expérience (20-30 par échantillon/point de temps). Couper 1 mL de pointes de pipette pour agrandir le diamètre de la pointe à environ 3-4 mm avec une lame de rasoir. Autoclave les conseils. Créez un porte-modèle pour placage de trois rangées de graines par assiette avec des couvercles carrés de plats Petri. Préparer un capot à débit lamineur pour fournir un environnement de travail stérile et étiqueter les plaques à traiter.
    REMARQUE : Si de nombreuses plaques sont traitées en même temps, les étiquettes colorées peuvent accélérer l’étiquetage.
  2. Placez les plaques d’agar vides dans le support du modèle et distribuez 1 ml de graines imbibées uniformément sur trois rangées. Placer les plaques traitées dans des piles dans le flux laminaire jusqu’à ce que les graines soient sèches (c.-à-d., coller à la surface de l’agar). Ne laissez pas les plaques plus longtemps car l’agar se dessèchera aussi.
  3. Une fois que les graines sont suffisamment sèches, fermez les couvercles et scellez chaque assiette avec du ruban adhésif micropore. Stratifier les graines pendant deux jours à 4 oC dans l’obscurité et ensuite les placer dans une chambre de croissance.

4. Traitement tissulaire (facultatif)

REMARQUE : Dans ce protocole, nous décrivons le traitement exogène des racines d’Arabidopsis avec la variante synthétique d’auxin NAA. Selon la question expérimentale à portée de main, cette pièce doit être ajustée ou peut être omise entièrement.

  1. Préparer des bandes de papier de soie de 1,5 à 2 cm de hauteur et de 10 cm de longueur. Les temps d’incubation prolongés exigent que le tissu soit autoclavé avant l’utilisation.
  2. Retirez le ruban micropore de toutes les plaques qui doivent subir le traitement hormonal. Diluer 1 mL de 10 mM NAA (dissous dans DMSO) dans 1 L de solution liquide, autoclaved 1/2 MS (pH 5.8) et tremper le papier tissulaire dans la solution (10 M NAA).
  3. Utilisez des pincettes pour appliquer une bande de papier de soie sur chaque rangée de racines. Utilisez délicatement les doigts pour enlever les bulles d’air. Videz l’excès de liquide de la plaque, fermez le couvercle et étiquetez la plaque avec le temps. Pour des temps d’incubation prolongés, remettez les plaques dans la chambre de croissance.

5. Récolte

  1. Récupérez les plaques pour chaque point/traitement biologique de réplique/temps. Recueillir de l’azote liquide dans un récipient de Dewar propre et des tubes d’étiquette (15 ou 50 ml) pour les différents échantillons de tissus. Préparer un support en polystyrène.
    CAUTION : Familiarisez-vous avec les procédures de manipulation de l’azote liquide (aération, engelures, tubes potentiellement explosifs).
  2. Ouvrez la plaque et retirez le papier de soie avec des forceps, en prenant soin de ne pas détacher les racines de la surface de l’agar. À l’aide d’une lame chirurgicale, coupez une fois par rangée le long de la jonction de pousse-racine dans un seul coup déterminé. Nettoyez les lames entre les échantillons et échangez fréquemment pour garantir la netteté.
  3. À l’égard des pincettes, faites glisser le long des racines de chaque rangée pour les recueillir en trois paquets. Saisissez les racines et videz-les dans un tube de 50 ml rempli d’azote liquide pour geler.
    REMARQUE : N’essayez pas d’assembler les racines en structures denses (comme les boules) car elles sont difficiles à moudre à l’étape suivante.
  4. Procédez avec toutes les plaques qui constituent un échantillon (dans l’ordre des temps d’incubation) et versez l’excès d’azote liquide. Utilisez le couvercle du tube pour empêcher les racines de se renverser. Fermez ensuite le couvercle et collectez tous les tubes du vaisseau Dewar. Conservez le tissu racinaire à -80 oC.

6. Immunopurification

REMARQUE : Cette étape vise à obtenir un TRAP/ARN polysome de haute qualité. Par conséquent, suivez strictement les conseils de bonnes pratiques pour la manipulation de l’ARN. Effectuez toutes les étapes de cette section dans un banc stérile et nettoyez tout l’équipement et le labware avec une solution de suppression de RNase(Tableau des matériaux). Portez-les des gants et modifiez-les immédiatement lorsqu’ils sont contaminés par de l’échantillon, de la glace ou d’autres sources qui n’ont pas été nettoyées. Étant donné qu’il s’agit d’un aspect crucial, une section sur la réutilisation de l’équipement ainsi que des conseils d’élimination des déchets sont incluses.

  1. Préparation de tampon
    1. Préparer des solutions de stock en fonction du tableau 1 et de l’autoclave (A) ou de la stérilisation du filtre( ). Sauf indication contraire, le solvant est de l’eau sans RNase.
    2. Dissoudre et aliquot dithiothreitol (TNT), fluorure phénylméthylsulfonyl (PMSF), cycloheximide (CHX) et chloramphéniicol (CAM) dans leurs solvants respectifs comme indiqué dans le tableau 1 et les stocker à -20 oC. Tous les autres stocks peuvent rester à température ambiante.
    3. Pré-mélanger les stocks - avec les ingrédients 1-4 pour le tampon de lavage (WB) et 1-6 pour le tampon d’extraction polysome (PEB) - pour éviter le mélange de tampon long avant chaque extraction. Ainsi, n’ajoutez que l’eau et les ingrédients congelés (7-10) le jour de l’extraction. Maintenir les stocks pré-mixtes et l’eau sans RNase à 4 oC.
      REMARQUE : La concentration de TNT est de 1/5 de la concentration rapportée de Zanetti et coll. 2005, car l’interaction nanobody avec le GFP est sensible aux concentrations élevées de TNT.
IngrédientsConcentration de stockAjouter le volume en mL pour 50 ml de BMAjouter le volume en mL pour 50 ml de PEB
1Tris, pH 9Un2 M55
2KclUn2 M55
3EGTA (EN anglais)Un0,5 M2.52.5
4MgCl2 Un1 M1.751.75
5PteUn20% (v/v)02.5
6mélange de détergentUn02.5
Tween 2020% (v/v)
Triton-X 10020% (v/v)
Brij-3520% (w/v)
Igepal (Igepal)20% (v/v)
7Tnt₳0,5 M0.10.1
8FSM₳0,1 M (isopropanol)0.50.5
9Cycloheximide₳25 mg/mL (EtOH)0.10.1
10Chloramphénicol₳50 mg/mL (EtOH)0.050.05

Tableau 1 : Conseils de composition et de mélange tampons. Les ingrédients dont les concentrations de stock données sont mélangées dans les montants donnés donnent 50 ml de BM ou de PEB. Tris: tris-(hydroxymethyl)-aminomethane, EGTA: éthylène glycol-bis (-aminoethyl ether)-N,N,N',N',N',N',N'-tetra-acétic acid, PTE: Polyoxyethylene-(10)-tridecyl ether, A: autoclave, ': filtre-sterilize; Remplissez jusqu’à 50 ml d’eau sans RNase.

  1. Homogénéisation/broyage tissulaire
    1. Refroidir la centrifugeuse et placer les homogénéisateurs et les tubes de centrifugeuse sur la glace. Dégel des aliquots de la TNT, du FSM, du CHX et de la CAM. Mélanger PEB et WB à partir des solutions de stock dans des tubes de 50 ml selon les exigences de la journée (d’échantillons) et refroidir sur la glace.
      REMARQUE : Ajouter pmSF seulement peu de temps avant utilisation, car la demi-vie du PMSF dans l’eau n’est que de 30 min.
    2. Préparer beaucoup d’azote liquide dans un vaisseau Dewar et récupérer des échantillons de tissus dans un stockage de -80 oC. Portez des gants de coton sous les gants de laboratoire standard pour éviter les brûlures causées par les mortiers froids. Verser l’azote liquide dans les mortiers et les pilons jusqu’à ce qu’ils soient assez froids pour permettre le broyage. Il est recommandé de concevoir un système pour distinguer les mortiers (étiqueter ou garder dans un certain ordre).
    3. Échantillon vide de tissu dans un mortier et moudre soigneusement jusqu’à ce que tout le matériel soit une poudre blanche. Si nécessaire, ajouter de l’azote liquide pour garder le tissu congelé ou pour faciliter un meilleur broyage.
    4. Ajouter 5 ml de PEB à l’échantillon et mélanger rapidement avec la poudre avant que le tampon ne gèle. Pendant que cet échantillon dégèle (mélange de temps en temps) traiter un autre échantillon.
    5. Dès que le mélange peut être transféré, videz la boue dans un homogénéisant en verre et gardez sur la glace. Avec 2 ml de PEB supplémentaires, rincez le mortier et pilon et ajoutez-le à l’échantillon dans l’homogénéisateur.
      REMARQUE : Évitez un échantillon complètement liquide car cela permet la dégradation de l’ARN.
    6. Broyer la boue manuellement jusqu’à ce que l’extrait soit homogène. Nous recommandons un minimum de 4 à 5 plongeons.
      REMARQUE : Il peut s’agit peut-être d’un temps d’attente supplémentaire pour permettre au dégel de la boue. Le traitement des homogénéisateurs exige une certaine diligence. N’appliquez pas la force brute et méfiez-vous des forces d’aspiration. Si elle n’est pas prise en compte, cela entraînera des déversements, une contamination ou la destruction de l’homogénéisateur.
    7. Verser l’extrait de racine brute dans un tube de centrifugeuse de 50 ml (garder sur la glace).
      REMARQUE : Habituellement, plusieurs échantillons peuvent être broyé avant le transfert. Une manipulation parallèle du broyage, du transfert et de l’homogénéisation est nécessaire. Essayez de travailler rapidement, mais ne vous précipitez pas; rester calme. Conservez toujours des échantillons homogénéisés sur la glace.
  2. Collecte totale d’échantillons d’ARN
    1. Transférer 200 aliquots de l’échantillon brut dans un tube de microcentrifuge propre (étiqueté et refroidi sur la glace à l’avance).
    2. Procédez à l’extraction de l’ARN comme détaillé pour les échantillons TRAP dans les points 7.1 et 7.2. Faites ces étapes pendant que les échantillons sont éclaircissants dans la centrifugeuse.
    3. Effectuer un traitement DNase avec l’ARN total réutilisé pour éliminer la contamination de l’ADN et nettoyer la réaction à l’aide d’un kit commercial (Tableau des matériaux).
      REMARQUE : Les extractions totales d’ARN produisent habituellement des concentrations élevées et les échantillons doivent être dilués considérablement. Nous recommandons de mesurer la concentration après dilution par le protocole sensible Qubit.
  3. Dégagement de l’extrait brut
    1. Prenez le seau à glace avec des échantillons de 6,2,7 et centrifugez-les pendant 15 min à 16 000 x g et 4 oC.
      REMARQUE : Pour équilibrer la centrifugeuse, associez les échantillons en conséquence. Dans le cas où cela n’est pas tout à fait possible, ajustez un échantillon en ajoutant PEB.
    2. Verser le supernatant dans un tube de centrifugeuse frais (refroidi sur la glace à l’avance) et répéter la centrifugation (15 min à 16 000 x g et 4 oC). Ce transfert peut être effectué rapidement à côté de la centrifugeuse.
    3. Pendant que l’extrait brut est clair, lancez le lavage des perles GFP pour l’étape 6.6.
      REMARQUE : Gardez ce seau à glace pour basculer sur le shaker, mais ne remettez pas dans le banc stérile car il pourrait être contaminé.
  4. Lavage de perles
    1. Les perles magnétiques de GFP d’Aliquot (#samples x 60 lil, tableau des matériaux) dans un tube de 1,5 mL. Placez-vous sur le support magnétique. Une fois que les perles se sont accumulées, retirez le supernatant.
    2. Ajouter 1 ml de BM froide, réutilisez les perles et récupérez-les à nouveau. Jetez le tampon de lavage et répétez une fois de plus avec 1 ml de BM.
    3. En fin de compte, réutilisez les perles dans la BANQUE de LaVe au volume initial utilisé à l’étape 6.5.1.
  5. Immunopurification (PI)
    1. Immédiatement après la centrifugation, verser le supernatant autorisé dans des tubes étiquetés de 15 ml et ajouter 60 l de perles lavées par échantillon.
    2. Placez tous les échantillons horizontalement dans le seau à glace et mettez-le sur un shaker. Laisser le mélange incuber pendant 2 h afin de lier les polysomes étiquetés GFP aux perles.
    3. Recueillir les perles sur le support magnétique pour 15 tubes mL (sur la glace) et ajouter PMSF au PEB restant. Jetez le supernatant. Verser environ 5 ml de PEB aux perles et les réutiliser en inclinant. Secouez les échantillons pendant 15 min dans la même configuration que dans la section 6.6.2.
    4. Répétez les lavages avec WB à un total de 3 lavages (1 x PEB, 2 x WB). Avant chaque échange de tampons, ajoutez PMSF.
    5. Recueillir les perles dans 1 ml de WB et les transférer dans un tube de 1,5 mL. Enfin, recueillir les perles une fois de plus sur le support magnétique et enlever tout le liquide. Fermez le tube et restez sur la glace jusqu’à ce que tous les échantillons soient traités.
    6. Transportez les échantillons vers une hotte à fumée pour l’extraction de l’ARN.
  6. Élimination des déchets et reconditionnement des fournitures de laboratoire.
    1. Si elle est effectuée selon de bonnes pratiques de laboratoire (voir l’article 2.2.1), la procédure de stérilisation donne une solution NaCl aqueuse. Laissez le gaz de chlore, ainsi que le HCl résiduel et l’eau de Javel, pour décommaner dans le capot de fumée.
    2. Élimination de PEB et de la BM : Comme CHX se décompose à un pH élevé, collectez tous les liquides et apportez à pH -gt;9. Éliminer les déchets liquides dans les déchets chimiques halogènes. Tous les solides (tissus, pipettes sérologiques, gants, etc.) doivent être éliminés comme déchets chimiques.
    3. Recueillir séparément les liquides contenant du phénol, ainsi que les matières contaminées au phénol (bouts, tubes et gants).
    4. Mortiers, pileaux et homogénéisateurs (éponges et brosses) avec du savon et rincez à fond. Par la suite, faites cuire le matériau à l’adresse suivante : 220 oC pendant la nuit. Envelopper dans du papier d’aluminium avant le traitement ou placer dans un contenant couvert résistant à la chaleur.
    5. Badigeonner les tubes de centrifugeuse propre avec du détergent, puis les déthylpyrocarbonate (DEPC) traiter dans le capot de fumée. À cette fin, ajouter du DEPC liquide à l’eau déionisée (1 ml de DEPC à 1 L de H2O) et mélanger par secousses. Placez les tubes de centrifugeuse sur un plateau autoclavable qui attrape l’eau DEPC renversée. Verser la suspension dans les tubes et laisser reposer pendant 3 h ou toute la nuit. DEPC se décompose dans le processus d’autoclaving subséquent.
      CAUTION: DEPC est très toxique.

7. Extraction d’ARN et QC

  1. Extraction d’ARN
    1. Refroidir la centrifugeuse de table à 4 oC.
    2. Ajouter 1 ml de réactif à base de phénol acide-guanidinium(tableau des matériaux)à chaque échantillon, inverser pour résinpender les perles ou la boue totale d’ARN et incuber pendant 5 min sur la glace. Ne vortex!
    3. Ajouter 200 L de chloroforme et incuber pendant 3 minutes sur la glace. Puis complètement vortex les échantillons.
    4. Pour faciliter la séparation de phase, centrifugeuse au maximum. vitesse pendant 10-15 min, 4 oC.
    5. Étiqueter les tubes à faible rétention de 1,5 mL(tableau des matériaux) et l’aliquot 650 'L d’isopropanol dans chacun.
    6. Prenez soigneusement la phase aqueuse supérieure (environ 650 ll) et transférez-les aux tubes préparés avec de l’isopropanol. Évitez de toucher la phase organique rose.
    7. Précipitez l’ARN pendant la nuit à -20 oC.
      REMARQUE : Il est recommandé de stocker les échantillons dans l’isopropanol à -20 oC ou -80 oC et de ne se solubiliser dans l’eau que si nécessaire. L’ARN aqueux se dégrade même à -80 oC lorsqu’il est stocké pendant des semaines/mois.
  2. Précipitations d’ARN
    1. Refroidir la centrifugeuse de table à 4 oC.
    2. Préparer un EtOH frais à 80 % avec de l’eau sans RNase et refroidir à -20 oC (5 min à -80 oC aider à accélérer le processus).
    3. Centrifugez les échantillons à vitesse maximale (environ 13 000 x g)pendant 30 min et jetez le supernatant. La pastille ne sera pas visible, si soigneusement pipette comme si elle était là. Ajouter 1 ml de froid 80% EtOH et inverser le tube une ou deux fois.
    4. Centrifugeuse à nouveau pendant 30 min à vitesse maximale et répéter le lavage à un total de deux lavages.
    5. Faire tourner pendant 2 min et retirer tous les EtOH résiduels avec une pointe de 10 L. Laisser sécher la pastille de 3 à 5 minutes (pas plus) à température ambiante et de la résuspendance dans 20 L d’eau sans RNase.
    6. Gardez les échantillons sur la glace et effectuez un contrôle de la qualité dès que possible. Procédez au stockage des échantillons à -80 oC. Évitez les cycles de gel-dégel.
  3. Contrôle de la qualité àl’aide d’équipements dédiés (Tableau des matériaux)selon les recommandations du fabricant.

8. Préparation de la bibliothèque

  1. Synthèse et amplification cDNA avec le kit d’ARN SMARTer v4 Ultra Low Input
    1. Calculer la dilution de chaque échantillon pour avoir 1,5 ng d’ARN TRAP ou d’ARN total dans un volume de 4,75 lL. Effectuer toutes les réactions dans les tubes PCR et diluer des échantillons avec des aliquots frais d’eau sans RNase.
    2. Effectuez toutes les étapes selon les recommandations du fabricant avec 1/2 les volumes de réaction. Amplifier l’ADN avec 12-13 cycles PCR.
    3. Nettoyez le PCR en ajoutant 0,5 L de tampon de lyse de 10x et 25 L de perles SPRI(Tableau des matériaux). Si de nombreux échantillons sont traités tampon de lyse et perles peuvent être pré-mélangés. Assurez-vous que les perles sont uniformément dispersées avant le tuyautage.
    4. Procédez au protocole en volume de réaction intégral (17 l de tampon d’elution). Ne laissez pas sécher les perles pendant plus de 3 minutes. Les échantillons surchargés peuvent potentiellement être sauvés par des temps d’incubation prolongés.
    5. Mesurer les concentrations d’échantillons avec la trousse d’ADN Qubit HS.
      REMARQUE : Le kit V4 SMARTer peut tolérer jusqu’à 200 pg entrée. Nous avons obtenu des bibliothèques dans les cas où les valeurs Qubit n’ont pas pu être déterminées (en dessous de 250 pg, limite de détection) avec un PCR de 16 cycles. Toutefois, le matériel d’entrée limité pourrait également donner lieu à des bibliothèques moins complexes.
  2. Fragmentation et adaptateur ligation PCR avec le Nextera XT DNA Library Preparation Kit
    1. Diluer l’ADNC avec de l’eau sans RNase pour obtenir une concentration de 200 pg/l et pipette 1,25 l dans un tube PCR.
    2. Effectuez toutes les étapes selon le fabricant avec 1/4 les volumes de réaction. Amplifier l’ADNC avec 12 cycles PCR et des adaptateurs compatibles pour les échantillons qui appartiennent à une piscine de séquençage. Avec les kits Index d’Illumina, les kits A et D peuvent être multiplexés.
    3. Pour le nettoyage PCR ajouter 12,5 L de tampon de résuspension et 22,5 L de perles SPRI (rapport 0,9x). Elute l’échantillon avec 22 L de tampon d’elution.
      REMARQUE : QC et la mise en commun ont été effectuées par la société de séquençage(Tableau des matériaux) et donc aucune normalisation basée sur la perle n’était nécessaire. La réaction de fragmentation enzymatique (tagmentation) est très sensible à l’entrée matérielle car chaque enzyme ne coupe qu’une seule fois. Par conséquent, ne dépassez pas la recommandation de concentration.

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Résultats

Pour l’évaluation de la qualité, la procédure susmentionné devrait être examinée à plusieurs étapes intermédiaires : validation du modèle d’expression dans planta, contrôle de la qualité de l’ARN polysomique isolé ainsi que des bibliothèques finales. qRT-PCR utilisant des gènes marqueurs connus peuvent, en outre, être exécutés pour confirmer la réponse à l’état de traitement ou pour affiner les conditions expérimentales.

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Discussion

Vérification du modèle de localisation RPL18
Crucial pour éviter une mauvaise interprétation des données de toute expérience TRAP est le modèle d’expression approprié du sous-unité ribosomal marqué. Par conséquent, l’incorporation de GFP comme une étiquette d’épitope à RPL18 permet très élégamment la vérification du modèle d’expression désiré et consécutivement, retirer la fraction polysome du même tissu. Des approches plus invasives pour assurer des modèles de promoteurs appropriés sont suivies par J...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Jean-Claude Walser du Centre de diversité génétique de Zurich pour les conseils d’experts cruciaux dans la première phase de ce projet. Les travaux du laboratoire Vermeer ont été soutenus par une subvention de la Chaire SNF (PP00P3_157524) et une subvention d’équipement R’EQUIP (316030-164086) de la Fondation nationale suisse des sciences (SNSF) décernée à JEMV.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Stérilisation
Javel, 13 %Sigma71696
bécherVWR214-1172/74/75
dessiccateur avec plaque en porcelaine (DURAN)Sigma/MerckZ317454-1EA/Z317594-1EA
EtOH, p.a.Honeywell02860-1L
HCl, 37 %Roth4625.1
Tween 20SigmaP9416
Croissance des plaques + récolte
MS sels, mélange de sels de base, y compris tampon MESDuchefaM0254
gélose pour culture cellulaireApplichem/PanreacA2111.1000
DMSOSigmaD4540
forceptsRubis Suisse5-SA modèle
KOHFluka60370
ruban microporeux/chirurgical3M1530-0
NAADuchefaN0903
boîtes de Pétri 120x120 mmGreiner bio-one688102
scalpelMouchoirs VWR/Swann-Morton233-5454
, neutres, bicouchestout fournisseur de votre choix
Immunoprecipitation
GFP-beads : gtma-100 GFP-Trap_MAChromotekpar ex. gtma-100
Brij-35SigmaP1254-500G
tubes à centrifuger (conformément à centrifugeuse)Beckman Coulter357001
ChloramphénicolApplichemC0378-25G
gants en cotonVWR113-7355
Cycloheximide, HPLC gradeSigma01810-1G
DEPCVWRE174pourrait avoir de longs délais de livraison
DTTFluka43815
EGTASigma3054.3
DUALL 23KONTES GLASS CO (via VWR)SCERSP885450-0023 (set)SCERSP885451-0023 pilon seul - SCERSP885452-0023 cylindre uniquement ; longs délais de livraison
Igepal CA-360SigmaI3021-100ml
KClSigma60130
MgCl2 hexahydratRoth2189.2
mortier et pilonVWR470148-960 & 470019-978
PMSFRoche10 837 091 001
Polyoxyéthylène-(10)-tridécyléther/PTESigmaP2393-500G
RNeau sans naseRothT143.3
RNAZapThermo FisherAM9780/AM9782pour le nettoyage des surfaces
Tris, >99,3 % RothAE15.3
Triton X-100FlukaT8787-250ml
Tween 20SigmaP9416-100ml
fort
2-Propanol, p.a.Sigma33539-1L-GL-R
Chloroforme, grade HPLCScharlauCL02181000
EtOH, p.a.Honeywell02860-1L
Tubes de microcentrifugation à faible rétention, 1,5 mlEppendorf/SigmaZ666548-250EALoBind
Kit DNase sans RNaseQiagen79254
RNeasy MiniElute Cleanup KitQiagen74204
Réactif TRIzolThermoFisher/Ambion15596018
Préparation de la bibliothèque
15/50 mL Séparateur magnétique de tubeAbraxisPN 472250
Perles AMPureBeckman CoulterA63881
Kit d’index AIlluminaFC-131-2001
Kit d’index DIlluminaFC-131-2004
aimants néodymeAmazon/autre6 x 1,5 mm portée : N42 (NdFeB)
Nextera XT kitIlluminaFC-131-1024/1096https://emea.support.illumina.com/
bandelettes PCRThermoScientificAB-0266
SMARTer v4 kitTakara Bioscience634892https://www.takarabio.com/
BioanalyseurAgilent2100 BioanalyseurÉquipement spécialisé pour le contrôle de la qualité de l’ARN/ADN
TapestationAgilent4200 Tapestation Instrumentspécialisé pour le contrôle de la qualité de l’ARN/ADN
Analyseur de fragmentsAgilent5400 Système d’analyse de fragmentsÉquipement spécialisé pour le contrôle de la qualité de l’ARN/ADN (haut débit)
LabChipPerkinElmerLabChip GX Touch Analyseur d’acide nucléiqueÉquipement spécialisé pour le contrôle de la qualité de l’ARN/ADN (haut débit)
Fluorimètre Qubit 4ThermoFisherQ33239équipement spécialisé pour la détermination de la concentration d’ARN/
ADNqRT-PCR
GATA23Microsynthfwd : AGTGAGAATGAA
AGAAGAGAAGGG ;
rev : GTGGCTGCGAAT
AATATGAATACC
GH3.3Microsynthfwd : CAAACCAATCCT
CCAAATGAC ;
rev : ACTTATCCGCAA
CCCGACT
LBD29Microsynthfwd : TCTCCAACA
GGTTGTGAAT ;
rev : AAGGAGCCTTAG
TAGTGTCTCCA
UBC21Microsynthfwd : TGCGACTCAGGG
AATCTTCT ;
rev : TCATCCTTTCTT
AGGCATAGCG
SsoAdvanced Universal SYBR GreenBio-Rad#172-5270
iScript Adv cDNA KitBio-Rad#172-5038
miscellaneous
Falcon tubes 15 ml, CellstarGreiner bio-one188261
Falcon tubes 50 ml, CellstarGreiner bio-one210261
pointes filtrantes 1 mlAxygenTF-1000-R-S pointes filtrantes
10 µ ; lAxygenTF-10-R-S pointes filtrantes
100 & micro ; lAxygenTF-100-R-S pointes filtrantes
20 & micro ; lAxygenTF-20-R-S filtres pointes
200 & micro ; lAxygenTF-200-R-S
microtubes à centrifuger 1,5 mlSARSTEDT72.690.001
Iodure de propidiumSigmaP4170-100MG
société de séquençageNovogeneen.novogene.com
Homogénéisateurs

Références

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M thode TRAPprot ine ribosomale RPL18isolation de l ARN polysomalpr paration de biblioth ques faible quantit d entr eint grit de la paroi cellulaireformation des racines lat ralesbilles magn tiques GFP
Traduire la purification de l’affinité ribosome (TRAP) pour étudier le développement de la racine d’Arabidopsis thaliana à une échelle spécifique au type cellulaire
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