Article de méthode

Assemblage dirigé des protéines elastin-like en structures supramoléculaires définies et encapsulation de fret in Vitro

DOI :

10.3791/60935

⸱

8 avril 2020

 ,  ,  ,  , 
1Center for Biological Systems Analysis, University of Freiburg, 2Faculty of Biology, University of Freiburg, 3Freiburg Institute for Advanced Studies (FRIAS), University of Freiburg, 4BIOSS Centre for Biological Signalling Studies, University of Freiburg, 5IMTEK Department of Microsystems Engineering, University of Freiburg, 6Cluster of Excellence livMatS at FIT - Freiburg Center for Interactive Materials and Bioinspired Technologies, University of Freiburg

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

À l’interface des solvants organiques et aqueux, les protéines amphiphiliques sur mesure de type élastine s’assemblent en structures supramoléculaires complexes telles que les vésicules, les fibres et les coacervates déclenchés par des paramètres environnementaux. Les protocoles d’assemblage décrits donnent des compartiments à base de membrane protéique (PMBCs) avec des propriétés de thon, permettant l’encapsulation de diverses cargaisons.

Résumé

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Les blocs de construction protéinés sur mesure sont des candidats polyvalents pour l’assemblage de structures supramoléculaires telles que des cellules minimales, des véhicules de livraison de médicaments et des échafaudages enzymatiques. En raison de leur biocompatibilité et de leur thonibilité sur le plan génétique, les protéines elastin (PEL) sont des éléments constitutifs idéaux pour les applications biotechnologiques et biomédicales. Néanmoins, l’assemblage de structures supramoléculaires basées sur des protéines avec des propriétés physiochimiques distinctes et un bon potentiel d’encapsulation demeure difficile.

Ici, nous fournissons deux protocoles efficaces pour l’auto-assemblage guidé des PEL amphiphiles dans des architectures de protéines supramoléculaires telles que les coacervates sphériques, les fibres et les vésicules stables. Les protocoles d’assemblage présentés génèrent des compartiments à base de membrane protéique (PMBC) basés sur les PEL ayant des propriétés physicochimiques adaptables. Les PMBC démontrent le comportement de séparation de phase et révèlent la fusion de membrane dépendante de la méthode et sont capables d’encapsuler des molécules de cargaison fluorescentes chimiquement diverses. Les PMBC qui en résultent ont un potentiel d’application élevé en tant que plate-forme de formulation et d’administration de médicaments, de cellules artificielles et d’espace de réaction compartimenté.

Introduction

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L’assemblage de structures supramoléculaires pour les applications biotechnologiques devient de plus en plus important1,2,3,4,5. Pour l’assemblage d’architectures fonctionnelles telles que les coacervates, les vésicules et les fibres avec les propriétés physicochimiques souhaitées, il est important de comprendre et de contrôler les propriétés physicochimiques et conformationnelles des composants. En raison de la précision moléculaire des molécules présentes dans la nature, les blocs de construction des structures supramoléculaires sont de plus en plus basés sur les lipides, les acides nucléiques ou les protéines. Comparés aux polymères synthétiques, les blocs de construction protéinés permettent un contrôle précis sur les structures supramoléculairesémergentes 6 sur le plan génétique. La séquence primaire d’acide aminé (aa) des blocs de construction de protéines individuelles code intrinsèquement l’information pour leur potentiel d’assemblage du niveau moléculaire jusqu’au niveau macroscopique ainsi que la forme tridimensionnelle et les propriétés physiques de la structure supramoléculaire finale7.

Les méthodes signalées pour l’assemblage de différentes structures supramoléculaires impliquent souvent des protéines amphiphiles telles que des protéines sensibles à l’élastine sensible à la température (PEL)5,8,9, oléosine recombinante10et des amphiphiles protéinés artificiels11. Les méthodes déclenchées par la température ont conduit à l’assemblage de micelles4,10,12Fibres13Feuilles14et les vésicules9,15,16. Des méthodes impliquant des solvants organiques ont été appliquées pour la formation de vésicules dynamiques à base de protéines8,11,14. Jusqu’à présent, les protocoles appliqués pour la formation de vésicules manquent souvent de contrôle d’assemblage sur les assemblages de taille de micromètres16,17ou ont un rendement d’assemblage limité5. En outre, certains vésicules à base de PEL signalés ont un potentiel d’encapsulation altéré12ou une stabilité limitée au fil du temps9. En s’attaquant à ces inconvénients, les protocoles présentés permettent l’auto-assemblage de structures supramoléculaires de micromètre et de micromètres de taille avec des propriétés physiochimiques distinctes, un bon potentiel d’encapsulation et une stabilité de longue date. Les PEL amphiphiles sur mesure s’assemblent en structures supramoléculaires, allant des coacervates sphériques et des faisceaux de fibres torsadées très ordonnés aux vésicules nonilamellar selon le protocole appliqué et les conditions environnementales associées. Les grands compartiments à base de membrane protéique vésiculaire (PMBC) révèlent tous les phénotypes principaux tels que la fusion de membrane et le comportement de séparation de phase analogue aux liposomes. Les PMBC encapsulent efficacement les molécules de cargaison fluorescentes chimiquement diverses qui peuvent être surveillées à l’aide d’une simple microscopie épifluorescence. Les domaines répétitifs du PEL utilisés dans cette étude sont des éléments constitutifs attrayants pour les architectures supramoléculaires à base de protéines18. L’unité de répétition de pentapeptide ELP (VPGVG) est connue pour tolérer différentes aa en plus de proline à la quatrième position (valine, V), tout en préservant ses propriétés structurelles et fonctionnelles19. La conception de PEL amphiphiles contenant des domaines hydrophiles et hydrophobes distinctifs a été réalisée en insérant des résidus d’invités aa (X) dans la répétition VPGXG avec hydrophobicité distincte, polarité, et charge20. Domaines amphiphiliques DE PEL où équipés de phénylalanine hydrophobe (F) ou d’isoleucine (I) tandis que le domaine hydrophile contenait de l’acide glutamique chargé (E) ou de l’arginine (R) comme résidus d’invités. Une liste des constructions de PEL amphiphiles admissibles et des séquences aa correspondantes se trouve dans les informations et références supplémentaires8,21. Tous les blocs de construction lorsqu’ils sont équipés de petites colorants fluorescentes ou de protéines fluorescentes pour la visualisation par microscopie à fluorescence. MEGFP et d’autres protéines fluorescentes ont été fusionnées en A-terminalement dans les domaines hydrophiles des amphiphiles du PEL. Les colorants organiques ont été conjugués par l’intermédiaire d’une souche sans cuivre promue cycloaddition alkyne-azide (SPAAC) à un acide aminé non naturel co-translationnellement introduit (UAA). L’incorporation co-translationnelle de l’UAApara-azidophenylalanine (pAzF)22permet la modification N-terminale du domaine hydrophile PEL. De cette façon, le colorant fluorescent vert BDP-FL-PEG4-DBCO (BDP) ou toute petite molécule fluorescente avec un cyclooctyne tendu peut être utilisé comme sonde fluorescente. L’incorporation réussie de l’UAA pAzF et la cycloaddition du colorant via SPAAC peut être facilement confirmée par l’intermédiaire de LC-MS/MS en raison de l’ionisation efficace des peptides tryptiques correspondants8. Ce petit colorant organique a été appliqué pour élargir le choix de solvant pour les protocoles d’assemblage, puisque les protéines fluorescentes sont incompatibles avec la plupart des solvants organiques. Les deux protocoles d’assemblage les plus efficaces pour les structures supramoléculaires développées dans notre laboratoire sont décrits ci-dessous. La méthode de gonflement THF est seulement compatible avec le PEL amphiphilique modifié de colorant organique. En revanche, la méthode d’extrusion de 1 butanol (BuOH) est compatible avec de nombreuses protéines comme sonde fluorescente, par exemple mEGFP, puisque la méthode décrite préserve entièrement la fluorescence de ces protéines de fusion. En outre, l’encapsulation de petites molécules et le comportement de fusion vésiculaire fonctionne mieux en employant la méthode d’extrusion BuOH.

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Protocole

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1. Conception et clonage de protéines amphiphiles ressemblant à de l’élastine (PEL)

  1. Clone et concevoir les constructions comme décrit ailleurs8,20. Les plasmides sont disponibles sur demande.

2. Expression, purification et préparation des protéines

  1. Expression de F20E20-mEGFP et F20E20-mCherry
    1. Inoculer la culture d’expression principale de la pré-culture du jour au lendemain à un OD600 de 0,3. Incuber à 37 oC, 200 tr/min en milieu stérile de 400 ml lB complété par des antibiotiques appropriés dans un flacon de 2 L.
    2. Préparer la solution de stock IPTG (1 M) pour l’induction de la culture d’expression dans l’eau ultrapure.
    3. Lorsque l’OD600 0.5-0.8 est atteint, ajoutez IPTG à la culture d’expression à une concentration finale de 1 mM et réduisez la température d’incubation à 20 oC. Autoriser l’expression à 20 oC pendant environ 20 h à 200 tr/min.
  2. Expression d’ELP amphiphile contenant UAA pAzF
    1. Inoculer la culture principale de l’expression de la pré-culture E. coli contenant les deux plasmides pEVOL pAzF et par exemple pET28-NMBL-(TAG)R40F20-son à un OD600 de 0,3 (voir les informations supplémentaires pour les séquences d’acides aminés). Incuber à 37 oC, 200 tr/min en milieu stérile de 400 ml lB complété par de la kanamycine et du chloramphenicol dans un flacon de 2 L.
    2. Préparer une solution de stock pAzF de 100 mM dans l’eau ultrapure. Pour 10 ml de solution de stock pAzF, peser 206,2 mg pAzF et le ressaisciser dans 8 ml d’eau ultrapure. Pour dissoudre le pAzF soulever le pH de la solution avec 3 M NaOH et mélanger vigoureusement. Lorsque le pAzF est dissous, abaissez soigneusement le pH à 10,5 et ajoutez de l’eau ultrapure à un volume final de 10 ml. Utilisez un filtre stérile (0,22 m) et alaïz la solution dans des tubes de réaction de 2 ml.
    3. Préparer 1 M de solution de stock IPTG dans l’eau ultrapure et 20% solution de stock arabinose dans l’eau ultrapure.
    4. Lorsque l’OD600 0.5-0.8 est atteint, ajouter pAzF à la culture d’expression à une concentration finale de 2 mM. Incuber la culture pour 10 min, 37 oC, 200 tr/min pour permettre l’absorption de pAzF.
    5. Induire l’expression de la protéine cible et l’expression de la synthéase t-RNA/t-RNA nécessaire par l’ajout simultané d’IPTG (1 mM) et d’arabinose (2 %) et réduire la température d’incubation à 20 oC.
    6. Autoriser l’expression à 20 oC pendant environ 20 h à 200 tr/min. Récoltez la culture d’expression par centrifugation à 4 oC, 4000 x g,40 min.
  3. lyse cellulaire et purification des protéines
    1. Resuspendez le granule E. coli en tampon de lyse (10 ml par litre de culture; 50 mM Tris-HCl pH 8, 500 mM NaCl, 4 M urea, 0,25% Triton X-100) contenant du lysozyme (0,1 mg/mL) et pmSF (0,1 mM). Incuber pendant 30 minutes sur la glace et congeler et décongeler deux fois par la suite en submergeant l’échantillon d’azote liquide.
    2. Sonicate la suspension (30%, 15 fois, 30 s: 10 s pause) et effacer le lysate par centrifugation (4 oC, 10.000 x g pour 40 min).
    3. Purifier les protéines à l’aide d’une chromatographie d’affinité (p. ex. sur une colonne de nickel de 1 ml à l’aide d’un système FPLC relié à un collecteur fractionnaire; voir Tableau des matériaux). Elute la protéine avec tampon d’elution (50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 4 M urea, 250-500 m imidazole) et stocker à 4 oC jusqu’à traitement ultérieur.
    4. Analyser l’efficacité de purification via SDS-PAGE.

3. Modification de la teinture des PEL via SPAAC

  1. Estimer grossièrement la concentration de la solution PEL.  Une absorptionde 280 pour l’évaluation de concentration n’est pas valable puisque la séquence pAzF-R40F20 manque d’acides aminés absorbant dans la gamme UV. Par conséquent, un amphiphile ELP précédemment lyophilisé et pondéré peut être utilisé comme référence pour la comparaison de bande de SDS PAGE. En comparant l’intesité de valeur grise résumée des bandes SDS PAGE des solutions ELP avec des concentrations connues et votre échantillon, la concentration approximative de votre échantillon peut être estimée.
  2. Ajoutez 1 L de colorant fluorescent BDP-FL-PEG4-DBCO (solution de stock de 10 mM; concentration finale de 20 M) à 500 L de solution ELP (20 m de M). Incuber la réaction pendant environ 10 h à 15 oC, tout en secouant et protégé de la lumière.
  3. Pour une utilisation ultérieure, dialysez la réaction pour enlever le BDP excessif.
    1. Équilibrer une membrane de dialyse (p. ex. 12 kDa coupure) dans l’eau ultrapure pendant 10 min. Couper la membrane de dialyse dans la bonne taille à placer sur le dessus d’un tube de réaction contenant la solution DE PEL cliquetée. Pour fixer la membrane de dialyse dans l’ouverture, placez un couvercle de tube de réaction avec le noyau perforé sur l’ouverture, fermant ainsi le tube.
    2. Placez le tube de réaction à l’envers dans le tampon choisi. Échangez le tampon (2 à 5 L) deux fois après la dialyse pendant au moins 3 h à chaque fois. Enlever les bulles d’air emprisonnées entre la membrane de dialyse et le tampon pour assurer une dialyse réussie.

4. Protocole d’enflure THF

  1. Dialysez la solution homogène de PEL contre le tampon de phosphate ou de tris (10 mM) avec le pH 7.5 stable pour enlever les sels et les composés restants de sa purification de l’étiquette.
  2. Préparer le lyophilizer et refroidir à la température de démarrage pour le gel-séchage.
  3. Aliquot la solution de protéines dialysées dans des tubes de réaction de 1,5 mL (50 à 500 ll par tube) et gel de choc dans l’azote liquide. Pour éviter le mélange indésirable de différentes solutions protéiques pendant le séchage du gel, les bouchons avec un petit trou peuvent être mis sur le dessus du tube de réaction pour le sceller partiellement.
  4. Sortez les échantillons de protéines congelés de l’azote liquide et placez-les immédiatement dans le lyophilizer pour commencer le lyophiling. Le séchage du gel est terminé lorsque l’échantillon est complètement sec (environ 24 à 48 h). Par la suite, ventilez les PEL amphiphiles lyophilisés avec N2sec, puis fermez immédiatement les couvercles de tube de réaction pour éviter le contact avec l’humidité de l’air.
  5. Ajoutez du THF pur aux échantillons lyophilisés (PEL, 5 à 10 M) et placez la solution dans un sonicateur de bain d’eau contenant de l’eau glacée pendant 15 min pour permettre un gonflement du PEL dans le THF.
  6. Préchauffer un thermocycleur à 30 à 60 oC pour la formation de vésicules ou jusqu’à 90 oC pour la formation de fibres et préparer de nouveaux tubes de réaction contenant de l’eau ultrapure ou un tampon (50 m NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 5-13). Les coacervates sphériques s’assemblent principalement à 20 oC dans le pH 9-13. La formation de Vésicule est favorisée à 50-60 oC entre pH 7 et 9. La formation de fibres est induite avant-plan au-dessus de 60 oC entre le pH 5 et 12.
  7. Après l’étape de sonication, placez la solution ELP/THF ainsi que l’eau ultrapure préparée ou la solution tampon dans le thermocycler et chauffez jusqu’à la température désirée pendant 5 min. Lorsque la température est atteinte, la solution ELP/THF préchauffée doit être soigneusement stratifiée au-dessus de l’eau ultrapurée préchauffée ou de la solution tampon. Une séparation claire des deux phases avec une interface distincte doit être visible.
  8. Remettre le mélange dans le thermocycler et incuber pendant 20 minutes pour permettre la formation de vésicule ou de fibres à l’interface. Ensuite, laissez les échantillons refroidir à température ambiante pendant 10 min avant d’être analysés par microscopie ou dialyse de fluorescence.
  9. Solution de dialyse contenant les structures supramoléculaires contre l’eau ou la mémoire tampon ultrapure (50 mM NaH2PO4/Na2HPO4, 50 mM NaCl, pH 7-10).

5. Protocole d’extrusion BuOH

  1. Préparer une solution ELP de 1 à 50 M dans de l’eau ou un tampon ultrapure (50 mM PB pH 7,5, 100 mM NaCl, peut contenir jusqu’à 4 M d’urée). La concentration de la solution amphiphile ELP F20R20-mEGFP et F20R20-mCherry peut être déterminée à l’aide des coefficients d’extinction molaires (F20R20-mEGFP A28 22015 M-1 cm-1 et F20R20-mCherry A280 -34380 M-1 cm-1) (voir les informations supplémentaires pour les séquences aa).
  2. Ajoutez 10 % à 20 % (v/v) 1-butanol et mélangez immédiatement la solution en le faisant monter et descendre ou en la tirant à travers une seringue plusieurs fois. Une pipette commune de 100 L ou une seringue Hamilton équipée d’une aiguille de 0,25 x 25 mm peut être appliquée. La turbidité de la solution pendant le mélange devrait augmenter, indiquant la formation de vésicule. 1-octanol 5%-15% (v/v) peut également être utilisé pour l’extrusion de vesicle au lieu de 1-butanol.
  3. Afin d’obtenir une distribution de taille étroite, extrude vésicules à l’aide d’un mini extrudeur à travers une membrane avec une taille de pore de 1 m à température ambiante. La taille de la membrane utilisée pour l’extrusion détermine le seuil de taille supérieure des vésicules.
  4. Dialysez les vésicules décrites ci-dessus (étape 3.3) pour enlever le 1-butanol résiduel.

6. Encapsulation de teinture avec le protocole d’extrusion de BuOH

  1. Mélanger environ 40 ml de solution ELP en 10 mM Tris-HCl, pH 8 avec 1 L Dextran Texas Red (0,0025 mg/mL de concentration finale).
  2. Ajoutez 10 L de BuOH à la solution et extrude 5 à 10 fois à travers une seringue équipée d’une aiguille de 0,25 x 25 mm.

7. Analyse des structures supramoléculaires à l’aide de la microscopie à fluorescence

  1. Placez un anneau de renfort sur une glissière en verre et appuyez fermement sur le côté adhésif au verre.
  2. Ajouter 5 L de l’échantillon à l’intérieur de l’anneau de renfort et placer une feuille de couverture sur le dessus.
  3. Sceller l’échantillon avec du vernis à ongles sur les bords du couvercle pour éviter l’évaporation de l’échantillon pendant l’analyse.
  4. Effectuez la microscopie de fluorescence comme décrit précédemment8.

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Résultats

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Développement de protocole pour la production de vésicules
La figure 1 décrit les deux méthodes de préparation des vésicules différentes. La méthode de gonflement THF sur le côté gauche est composée de trois étapes successives et se traduit par différents assemblages supramoléculaires du PEL en fonction de la température. Dans la figure 1A, les images de microscopie à épifluorescence montrent des vésicules assembl...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un défaut tout en suivant les protocoles décrits pour l’assemblage de structures supramoléculaires définies conduit principalement à la formation d’agrégats non spécifiques(figure 2,IV) ou à distribués uniformément ELP-amphiphiles. Les étapes critiques du protocole sont discutées ci-dessous :

Pour un rendement à haute expression du PEL amphiphile, une température relativement basse de 20 oC est optimale. Pour la purification basée sur l’affinité réussie du PEL amp...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient le BMBF pour son soutien financier et le Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) d’avoir fourni le centre de recherche. Nous sommes reconnaissants à P. G. Schultz, TSRI, La Jolla, Californie, Etats-Unis pour fournir le plasmide pEVOL-pAzF. Nous remercions le personnel du Life Imaging Center (LIC) du Center for Biological Systems Analysis (ZBSA) de l’Albert-Ludwigs-University Freiburg pour l’aider avec leurs ressources de microscopie confocale, et l’excellent soutien dans l’enregistrement d’images.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 et micro ; m et 0,2 & micro ; m Filtre stéroïdeVWR
1,4-DithiothréitolMerck
1-butanol. >99,5 % p.a.Roth
2log Échelle d’ADNNEB
2-MercaptoethanolRoth
50 mL Falcon tubesVWR
79249 Alcyne Mega Stokes colorantSigma Aldrich
Acide acétique glacialVWR
Acétonitrile, anhydre, 99,8 %Sigma-Aldrich
Ampicilline-sel de sodium, 99 %Roth
BDP-FL-PEG4-DBCOJena Bioscience
BiofugeHeraeus
Bottle Top Filter avec membrane PES (45 µ ; m, 22 et micro ; m)Thermo Scientific
Brillant Blue G250 (Coomassie)Roth
BspQINEB
Camera DS Qi1
Nikon Centrifuge 5417rEppendorf
Centrifuge 5810rEppendorf
CF-400-Cu grille en cuivre à maille carréeEMS
ChloramphénicolRoth
CompactStar CS 4VWR
Dextran, Texas Red, 3000 MW, neutreLife Technologies
Sonifiant numériqueBranson
Dimethylsulfoxide (DMSO)Applichem
Dnase iApplichem
EarINEB
EcoRI-HFNEB
Agitateur environnemental incubateur ES-20Biosan
Éthanol absoluRoth
Solution de bromure d’éthidiumRoth
Supports de filtreAvanti
Plaques de verreBio-Rad
Glycérol Protéomique GradeAmresco
GlycinApplichem
H4-Azido-Phe-OHBachhem
Plaque chauffante MR HeiTecHeidolph
HindIIINEB
HisTrap FF colonne bruteGE Life SciencesColonne de nickel
Chlorhydrate fumant acide, 37 %, p.a. Merck
Illuminator ix 20INTAS
Illuminator LAS-4000Fujifilm
ImidazoleMerck
Immersions huile pour la microscopieMerck
Incubators agitateurs Unimax 1010Heidolph
Inkubator 1000Heidolph
IPTG, >99 %Roth
KanamycinsulfateRoth
L(+)-ArabinoseRoth
Balances de laboratoire Extended ed2202s/224s-OCESartorius
LB-MediumRoth
Lyophilizer Alpha 2-4 LSCChrist
Lysozyme, 20000 U/mgRoth
CM 100
Philips Microscope Eclipse TS 100Nikon
Lunettes de protection de microscopie (15 x 15 mm)Lames
MicrowaveStudio
Mini-Extruder SetAvanti Polar Lipids
NaCl, >99,5 %, p.a.Roth
Natriumpastilles d’hydroxydeRoth
Ni-NTA Agarose, PerfectPro5 Prime
Nucleopore Track-Etch MembraneAvanti
meter 766 calimaticKnick
Phenylmethylsulfonylflourid (PMSF)Colonnes en
(1 mL)Qiagen
PowerPac basicBioRad
Propanol-2-olEmplura
Échelle protéique 10-250 kDaNEB
Refroidisseur à recirculation F12Julabo
Anneaux de renfortHerma
SacI HFNEB
SDS PelletsRoth
Sodiumdihydrogénophosphate dihydraté, NaH2PO4VWR
Filtre seringue stérile 0,2 mm Acétate de celluloseVWR
T4 ADN LigaseNEB
TEMEDRoth
TexasRed Dextran-ConjugateMolecularProbes
Thermomix confortEppendorf
THF, >99,5 % par anAcros
Triton X 100Roth
Trypton/Pepton de CaseinRoth
Nettoyeur à ultrasonsVWR
Urea p.a.Roth
Pompe à vide 2.5Vacuubrand
XbaINEB
XhoINEB
ZelluTrans membrane tubulaire en cellulose régénérée (12.0 S/ 3.5 S/ 1.0 V)Roth
Microscope de microscopie VWR PH polypropylène Roth

Références

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  1. Elzoghby, A. O., Samy, W. M., Elgindy, N. A. Protein-based nanocarriers as promising drug and gene delivery systems. Journal of Controlled Release. 161 (1), 38-49 (2012).
  2. Jang, Y., Champion, J. A. Self-Assembled Materials Made from Functional Recombinant Proteins. Accounts of Chemical Research. 49 (10), 2188-2198 (2016).
  3. Timmermans, S. B. P. E., van Hest, J. C. M. Self-assembled nanoreactors based on peptides and proteins. Current Opinion in Colloid & Interface Science. 35, 26-35 (2018).
  4. Dreher, M. R., et al. Temperature Triggered Self-Assembly of Polypeptides into Multivalent Spherical Micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (2), 687-694 (2008).
  5. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2014).
  6. Matsuurua, K. Rational design of self-assembled proteins and peptides for nano- and micro-sized architectures. RSC Advances. 4 (6), 2942-2953 (2013).
  7. Rocklin, G. J., et al. Global analysis of protein folding using massively parallel design, synthesis, and testing. Science. 357 (6347), 168-175 (2017).
  8. Schreiber, A., Stühn, L. G., Huber, M. C., Geissinger, S. E., Rao, A., Schiller, S. M. Self-Assembly Toolbox of Tailored Supramolecular Architectures Based on an Amphiphilic Protein Library. Small. 15 (30), 1900163(2019).
  9. Jang, Y., Hsieh, M. -C., Dautel, D., Guo, S., Grover, M. A., Champion, J. A. Understanding the Coacervate-to-Vesicle Transition of Globular Fusion Proteins to Engineer Protein Vesicle Size and Membrane Heterogeneity. Biomacromolecules. 20 (9), 3494-3503 (2019).
  10. Vargo, K. B., Sood, N., Moeller, T. D., Heiney, P. A., Hammer, D. A. Spherical micelles assembled from variants of recombinant oleosin. Langmuir: the ACS journal of surfaces and colloids. 30 (38), 11292-11300 (2014).
  11. Bellomo, E. G., Wyrsta, M. D., Pakstis, L., Pochan, D. J., Deming, T. J. Stimuli-responsive polypeptide vesicles by conformation-specific assembly. Nature Materials. 3 (4), 244-248 (2004).
  12. Martín, L., Castro, E., Ribeiro, A., Alonso, M., Rodríguez-Cabello, J. C. Temperature-Triggered Self-Assembly of Elastin-Like Block Co-Recombinamers:The Controlled Formation of Micelles and Vesicles in an Aqueous Medium. Biomacromolecules. 13 (2), 293-298 (2012).
  13. Li, Y., Rodriguez-Cabello, J. C., Aparicio, C. Intrafibrillar Mineralization of Self-Assembled Elastin-Like Recombinamer Fibrils. ACS Applied Materials & Interfaces. , (2017).
  14. Vargo, K. B., Parthasarathy, R., Hammer, D. A. Self-assembly of tunable protein suprastructures from recombinant oleosin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (29), 11657-11662 (2012).
  15. Park, W. M., Champion, J. A. Thermally Triggered Self-Assembly of Folded Proteins into Vesicles. Journal of the American Chemical Society. 136 (52), 17906-17909 (2014).
  16. Vogele, K., et al. Towards synthetic cells using peptide-based reaction compartments. Nature Communications. 9 (1), 3862(2018).
  17. Vogele, K., et al. In Vesiculo Synthesis of Peptide Membrane Precursors for Autonomous Vesicle Growth. Journal of Visualized Experiments. (148), e59831(2019).
  18. Huber, M. C., et al. Designer amphiphilic proteins as building blocks for the intracellular formation of organelle-like compartments. Nature Materials. 14 (1), 125-132 (2015).
  19. Urry, D. W., et al. Elastin: a representative ideal protein elastomer. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 357 (1418), 169-184 (2002).
  20. Huber, M. C., Schreiber, A., Wild, W., Benz, K., Schiller, S. M. Introducing a combinatorial DNA-toolbox platform constituting defined protein-based biohybrid-materials. Biomaterials. 35 (31), 8767-8779 (2014).
  21. Schreiber, A., Huber, M. C., Schiller, S. M. Prebiotic Protocell Model Based on Dynamic Protein Membranes Accommodating Anabolic Reactions. Langmuir. 35 (29), 9593-9610 (2019).
  22. Chin, J. W., Santoro, S. W., Martin, A. B., King, D. S., Wang, L., Schultz, P. G. Addition of p-Azido-l-phenylalanine to the Genetic Code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  23. Sonnino, S., Prinetti, A. Membrane domains and the "lipid raft" concept. Current Medicinal Chemistry. 20 (1), 4-21 (2013).
  24. Bräse, S., Gil, C., Knepper, K., Zimmermann, V. Organische Azide - explodierende Vielfalt bei einer einzigartigen Substanzklasse. Angewandte Chemie. 117 (33), 5320-5374 (2005).
  25. Li, Z., et al. Large-Scale Structures in Tetrahydrofuran–Water Mixture with a Trace Amount of Antioxidant Butylhydroxytoluene (BHT). The Journal of Physical Chemistry B. 115 (24), 7887-7895 (2011).
  26. Huber, M. C., Schreiber, A., Schiller, S. M. Minimalist Protocell Design: A Molecular System Based Solely on Proteins that Form Dynamic Vesicular Membranes Embedding Enzymatic Functions. ChemBioChem. 20 (20), 2618-2632 (2019).
  27. Raghunathan, G., et al. A comparative study on the stability and structure of two different green fluorescent proteins in organic co-solvent systems. Biotechnology and Bioprocess Engineering. 18 (2), 342-349 (2013).
  28. Sallach, R. E., et al. Long-term biostability of self-assembling protein polymers in the absence of covalent crosslinking. Biomaterials. 31 (4), 779-791 (2010).

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Protein AssemblyVesicle FormationFiber FormationCoacervate FormationProtein PurificationFluorescent Cargo EncapsulationDialysis MethodExtrusion TechniqueConfocal Microscopy

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