Une plate-forme personnalisée de microscopie multiphoton pour l’imagerie en direct de la cornée de souris et de la conjonctive

Les structures oculaires de surface, y compris la cornée et la conjonctive, protègent d’autres tissus oculaires plus profonds contre les perturbations externes. La cornée, la partie avant transparente de l’œil, fonctionne à la fois comme une lentille réfractive pour diriger la lumière dans l’œil et comme une barrière protectrice. L’épithélium cornéen est la couche la plus externe de la cornée et se compose de couches distinctes de cellules superficielles, de cellules d’aile et de cellules basales. Le stroma cornéen est composé de lamelles collagènes sophistiquées intégrées aux kératocytes. L’endothélium cornéen, une seule couche de cellules hexagonales plates, a un rôle important dans le maintien de la transparence de la cornée en maintenant le stroma cornéen dans un état relativement déshydraté grâce à ses fonctions de pompage¹. Limbus forme la frontière entre la cornée et la conjonctive, et est le réservoir de cellules souches épithéliales cornéennes². La conjonctive très vascularisée aide à lubrifier les yeux en produisant du mucus et des larmes³.

La dynamique cellulaire des structures de surface cornéennes est traditionnellement étudiée soit par l’analyse histologique ou la culture cellulaire in vitro, qui pourrait ne pas simuler adéquatement la dynamique cellulaire in vivo. Une approche non invasive d’imagerie vivante peut donc combler un tel écart. En raison de ses avantages, qui comprennent la haute résolution, photodamage minimal et profondeur d’imagerie plus profonde, MPM est devenu une modalité puissante dans divers domaines de la recherche biologique^4,5,6,7,8. Pour l’imagerie cornéenne, MPM fournit des informations cellulaires provenant de l’autofluorescence intrinsèque dérivée du NAD(P)H intracellulaire. Les signaux de deuxième génération harmonique (SHG) dérivés des fibres de collagène de type I non centrosymétriques sous balayage laser femtoseconde fournissent des structures stromales collagènes sans procédures de coloration supplémentaires⁹. Auparavant, nous et d’autres groupes avons exploité MPM pour l’imagerie des cornées animales et humaines^{9,10,11,12,13,14,15}.

Les lignées transgéniques de souris présentant des protéines fluorescentes dans des populations cellulaires spécifiques ont été largement utilisées pour diverses études en biologie cellulaire, y compris le développement, l’homéostasie tissulaire, la régénération des tissus et la carcinogenèse. Nous avons utilisé des souches de souris transgéniques étiquetées avec des protéines fluorescentes pour l’imagerie in vivo des cornées^9,10, follicules pileux¹⁰ et épiderme¹⁰ par MPM. La double souche de souris fluorescente avec membrane cellulaire étiquetée avec tdTomato et noyau cellulaire marqué avec EGFP est élevée à partir de deux souches de souris: R26R-GR (B6;129-Gt (ROSA)26Sor^tm1Ytchn/J, #021847)¹⁶ et mT-mG (Gt(ROSA26)^{ACTB-tdTomato-EGFP}, #007676)¹⁷. La ligne transgénique de souris R26R-GR contient une double construction de radiopro protéines fluorescentes, y compris un gène de fusion H2B-EGFP et un gène de fusion de signal d’ancrage mCherry-GPI, inséré dans le locus gt (ROSA)26Sor. La souche transgénique mT-mG est une souris tdTomato et Cre-reporter fluorescente ciblée par membrane cellulaire. Avant la recombinaison de Cre, la protéine de membrane cellulaire avec l’expression de fluorescence tdTomato est largement présente dans diverses cellules. Cette souche de souris transgénique nous permet de visualiser les noyaux-EGFP et la membrane avec tdTomato sans excitation Cre. Deux femelles (R26R-GR^+/+) et une souris transgénique mâle (mT-mG^+/+) ont été élevées ensemble pour produire suffisamment de souris pour des expériences. Leur progéniture avec R26R-GR^+/-;mT-mG^+/- génotype, une souche de souris fluorescentes doubles, ont été utilisées dans cette étude. Par rapport à une ligne de souris de journaliste fluorescent comme décrit précédemment^9,10, cette souche de souris double reporter fluorescent nous fournit une acquisition réduite de 50% de temps d’imagerie.

Dans ce travail, nous décrivons un protocole technique détaillé pour l’imagerie in vivo de la surface oculaire d’une manière étape par étape utilisant notre plate-forme d’imagerie et des souris transgéniques fluorescentes doubles.

Toutes les expériences animales ont été menées conformément aux procédures approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université nationale de Taiwan et de l’hôpital Mémorial Chang Gung.

1. Configuration de microscopie multiphoton

1. Construire un système basé sur un microscope droit avec immersion d’eau 20x 1.00 OBJECTIF NA (Figure 1A).
2. Utilisez Ti: Sapphire laser (avec longueur d’onde tunable) comme source d’excitation. Réglez la longueur d’onde de sortie laser à 880 nm pour EGFP et 940 nm pour tdTomato (Figure 1A).
3. Inclure deux miroirs dichroiques (495 nm et 580 nm) pour la séparation de SHG/EGFP et EGFP/tdTomato (figure 1A). Séparer spectralement les signaux SHG, EGFP et tdTomato par filtres bandpass 434/17nm, 510/84nm et 585/40nm (Figure 1A).
4. Afin d’optimiser la qualité de l’image et d’éviter le photobleaching et les dommages tissulaires, réglez la puissance laser à environ 35 mW pour l’imagerie cornée et 50 mW pour limbus. Mesurez la puissance laser avant que le laser ne passe le système optique. La puissance laser exacte sur les échantillons est d’environ 8-9 mW. La conception microscopique complète est indiquée à la figure 1A.
   REMARQUE : La limite supérieure de la puissance laser est réglée à 70 mW pour éviter le blanchiment photo et les dommages aux tissus.

2. Préparation animale pour l’imagerie vivante

1. Utilisez des souris de 8 à 12 semaines pour l’expérience. Injecter intramusculairement 50-80 mg/kg de tiletamine HCl et zolazépam HCl pour l’anesthésie générale. Vérifiez l’absence de réponse au réflexe de retrait en pinçant un orteil. Une anesthésie suffisante est importante pour permettre une surveillance stable du taux de respiration.
   REMARQUE : Les souris à l’âge de 8 semaines ou plus sont recommandées parce que leurs globes oculaires sont mûris.
2. Placez la souris sous anesthésie sur une scène chauffée et insérez la sonde de surveillance de la température dans l’anus.
   ATTENTION : La sonde doit être insérée entièrement dans la cavité anale sans exposition à l’air, afin d’éviter la surchauffe du chauffe-eau et l’induction d’un coup de chaleur.

3. Fixation des yeux pour l’imagerie en direct de la surface oculaire

1. Pour l’imagerie en direct de la surface oculaire, utilisez le support de souris stéréotaxique conçu sur mesure composé de deux parties : un support de tête pour stabiliser la tête et un support oculaire pour rétracter les paupières et exposer toute la surface oculaire (Figure 1B-D).
2. Insérez des barres d’oreille dans le meatus auditif externe et maintenez la fixation en trois points du support de tête (Figure 1B,D).
3. Appliquer topiquement une solution de 0,4% d’oxybuprocaïne chlorhydrate dans la solution saline et le laisser pendant 3 min pour anesthésier la surface oculaire.
4. Assurez-vous que le globe oculaire est en saillie par la rétraction manuelle appropriée des paupières. Sinon, l’ischémie et le saignement du globe oculaire peuvent se produire.
5. Placez soigneusement une boucle du tube de polyéthylène du support oculaire le long de la marge de la paupière pour exposer la surface oculaire. Stabiliser le globe oculaire avec le support oculaire composé d’un forceps Dumont no 5 avec ses pointes recouvertes de la boucle du tube de polyéthylène (Figure 1C,D).
6. Vis forceps à l’aide d’un bouton dans les forceps distal de support oculaire pour garder le globe oculaire stable (Figure 1D).
7. Appliquer un gel pour les yeux avec l’indice de réfraction de 1.338 sur la surface cornéenne comme milieu d’immersion pour maintenir l’humidité de la surface oculaire toutes les heures. En outre, l’application régulière du gel pour les yeux toutes les heures éviter l’obscurcissement dans la cornée pendant l’imagerie.
8. Faites pivoter le globe oculaire avec le support qui s’est verrouillé sur le stade motorisé par stepper pour l’imagerie sur toute la surface cornéenne de la cornée centrale à la région périphérique (Figure 1C,D).
   ATTENTION : L’excès et l’insuffisance des quantités de gel pour les yeux peuvent avoir un impact sur la qualité des images pendant l’imagerie. Par conséquent, compléter le gel pour les yeux toutes les heures pour garder la surface humide régulièrement est important pour l’imagerie.

4. Acquisition d’images en série Z

REMARQUE : Définissez la première et la dernière diapositive de chaque pile pour réduire les artefacts de mouvement de chute.

1. Avant de prendre les images, imagez le champ de ciblage avec une source de lumière mercure.
2. Cliquez sur le symbole du logiciel microscope pour activer le logiciel.
3. Sélectionnez le gain de PMT approprié et le gain numérique pour visualiser la structure cellulaire dans la surface oculaire.
4. Définissez la première diapositive et la dernière diapositive pour acquérir une pile.
5. Entrez des valeurs numériques pour la résolution d’image et l’étape z, par exemple, 512 x 512 et 1 μm en z-step.
6. Cliquez sur le bouton Démarrer pour collecter des images en série z.
7. Acquérir des images en direct deux fois dans la même zone, d’abord à 880 nm d’excitation pour la collecte de signaux SHG/EGFP et d’autres à 940 nm d’excitation pour la collecte de signaux EGFP/tdTomato.
   REMARQUE : La combinaison de deux piles fournit des images de 3 canaux. La résolution de l’image et la taille du format d’analyse étaient respectivement de 512 x 512 pixels et de 157 μm x157 μm.

5. Traitement d’image et reconstruction 3D

1. Chargez les images en série z dans le logiciel Fidji¹⁸.
2. Sélectionnez le filtre 3D médian du plugin aux Fidji pour réduire les bruits de fond.
3. Sélectionnez le filtre Masque unsharp package aux Fidji pour affiner les images.
4. Cliquez sur "Auto" en luminosité/contraste pour optimiser automatiquement la qualité des images.
5. Enregistrez les images sous forme de séquences d’images pour pouvoir exporter les images en série z.
6. Chargez des images en série z dans des logiciels commerciaux (p. ex., Avizo lite) pour la reconstruction 3D à l’aide du rendu de volume.
7. Dans toutes les images MPM, présentez les signaux EGFP, tdTomato et SHG en couleur pseudo-verte, rouge et cyan respectivement.
8. Capturez des images de structure 3D par l’instantané.

À l’aide de cette plate-forme d’imagerie en direct, la surface oculaire de la souris peut être visualisée au niveau cellulaire. Pour visualiser les cellules individuelles uniques dans la surface oculaire, nous avons employé les souris transgéniques fluorescentes doubles avec EGFP exprimés dans le noyau et tdTomato exprimés dans la membrane cellulaire. Le stroma cornéen riche en collagène a été mis en évidence par les signaux SHG.

Dans l’épithélium cornéen, les cellules superficielles, les cellules d’aile et les cellules basales (figure 2) ont été visualisées. Chez les souris transgéniques fluorescentes doubles, nous avons pu cartographier les cellules individuelles de la couche basale aux couches superficielles de l’épithélium cornéen et limbique (figure 2). Les cellules superficielles hexagonales ont été observées (pointe de flèche blanche dans la figure 2). La taille nucléaire et l’espacement internucléaire de la couche basale vers les couches extérieures ont augmenté dans l’épithélium cornéen (figure 2). Les signaux cytoplasmiques de fluorescence tdTomato ont indiqué que le système vésiculaire intracellulaire riche en protéines de la membrane, y compris l’appareil Golgi, le réticulum endoplasmique, était dispersé dans les cellules de l’aile (figure 2).

Dans le stroma collagène, les kératocytes en forme de stellate ont été décrits par la fluorescence tdTomato cible la membrane chez les souris transgéniques fluorescentes doubles (tête de flèche jaune dans la figure 3 et la figure 4). Les kératocytes incorporés dans le stroma de collagène étaient plus vaguement espacés que les cellules endothéliales. En outre, les nerfs minces de branchement dans le stroma cornéen ont également été visualisés par des signaux tdTomato de membrane-ciblage (pointe blanche de flèche dans la figure 3). Monocouche de cellules endothéliales cornéennes a montré une forme hexagonale relativement homogène reliée à un motif en nid d’abeilles (pointe de flèche blanche dans la figure 4). L’épithélium limbique se composait de 1 à 2 couches de cellules épithéliales (figure 5). La double souche de souris transgénique de reporter fluorescent nous a également permis d’imager les capillaires dans la conjonctive (Figure 6A). L’architecture 3D des capillaires a été reconstruite en décrivant l’endothélium vasculaire (figure 6B,6C).

Figure 1 : Configuration du MPM et du porte-souris rotatif.
(A) Configuration du MPM. (B) La conception du support de la souris. Le porte-souris se compose d’un porte-tête rotatif et d’un porte-yeux. (C) La conception du porte-yeux de souris. Le porte-œil rétracte les paupières par une boucle en plastique pour exposer la cornée et la conjonctive. Le support de tête et le support oculaire sont vissés ensemble (B) sur la scène pour permettre une rotation précise et contrôlable et l’imagerie de la surface oculaire. (D) Photographie de souris vivante pour l’imagerie cornéenne avec support oculaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Imagerie vivante de l’épithélium cornéen chez des souris transgéniques fluorescentes doubles.
L’épithélium cornéen a été photographié couche par couche, pour inclure les cellules superficielles, les cellules d’aile, et les cellules basales. Les cellules superficielles sont marquées d’une pointe de flèche blanche. Barre d’échelle = 50 μm. (Z = profondeur de la surface supérieure de l’épithélium (μm)). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Imagerie vivante du stroma cornéen.
Dans le stroma cornéen, les kératocytes (pointe de flèche jaune) et les fibres nerveuses (pointe de flèche blanche) ont été incorporés dans le stroma collagène (en couleur pseudo-bleue). Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Imagerie vivante de l’endothélium cornéen dans la cornée centrale.
Monocouche des cellules endothéliales cornéennes hexagonales (pointe de flèche blanche). Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Imagerie en direct de l’épithélium limbique.
Des images en direct de l’épithélium limbaire chez les souris transgéniques fluorescentes doubles ont montré des noyaux vacuolés. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Imagerie en direct et reconstruction tridimensionnelle du réseau vasculaire en conjonctive.
(A) Les capillaires en stroma conjonctif ont été visualisés. Barre d’échelle = 50 μm. (B) reconstruction 3D des réseaux capillaires effectués à l’aide d’un logiciel commercial. Barre d’échelle = 50 μm. (C,D) Des vues 3D magnifiées de l’image montrées dans le panneau B. Les cellules endothéliales vasculaires fluorescentes ont décrit les capillaires (pointes de flèche blanches et jaunes). Barre d’échelle pour le panneau C = 6,26 μm et pour le panneau D = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.