Une plate-forme personnalisée de microscopie multiphoton pour l’imagerie en direct de la cornée de souris et de la conjonctive

Summary

Présenté ici est une plate-forme microscopique multiphoton pour l’imagerie de surface oculaire de souris vivante. La souris transgénique fluorescente permet la visualisation des noyaux cellulaires, des membranes cellulaires, des fibres nerveuses et des capillaires à l’intérieur de la surface oculaire. Les signaux non linéaires de deuxième génération harmonique dérivés de structures collagènes fournissent une imagerie sans étiquette pour les architectures stromales.

Abstract

Les systèmes d’analyse histologique et de culture cellulaire conventionnels sont insuffisants pour simuler complètement la dynamique physiologique et pathologique in vivo. La microscopie multiphoton (MPM) est devenue l’une des modalités d’imagerie les plus populaires pour l’étude biomédicale aux niveaux cellulaires in vivo, les avantages incluent la haute résolution, la pénétration profonde des tissus et la phototoxicité minimale. Nous avons conçu une plate-forme d’imagerie MPM avec un porte-yeux de souris personnalisé et un stade stéréotaxique pour l’imagerie de la surface oculaire in vivo. La souris reporter de protéine fluorescente double permet la visualisation des noyaux cellulaires, des membranes cellulaires, des fibres nerveuses, et des capillaires dans la surface oculaire. En plus des signaux de fluorescence multiphoton, l’acquisition de la deuxième génération harmonique (SHG) permet simultanément la caractérisation de l’architecture stromale collagène. Cette plate-forme peut être utilisée pour l’imagerie intravitale avec un positionnement précis sur toute la surface oculaire, y compris la cornée et la conjonctive.

Introduction

Les structures oculaires de surface, y compris la cornée et la conjonctive, protègent d’autres tissus oculaires plus profonds contre les perturbations externes. La cornée, la partie avant transparente de l’œil, fonctionne à la fois comme une lentille réfractive pour diriger la lumière dans l’œil et comme une barrière protectrice. L’épithélium cornéen est la couche la plus externe de la cornée et se compose de couches distinctes de cellules superficielles, de cellules d’aile et de cellules basales. Le stroma cornéen est composé de lamelles collagènes sophistiquées intégrées aux kératocytes. L’endothélium cornéen, une seule couche de cellules hexagonales plates, a un rô....

Protocol

Toutes les expériences animales ont été menées conformément aux procédures approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université nationale de Taiwan et de l’hôpital Mémorial Chang Gung.

1. Configuration de microscopie multiphoton

1. Construire un système basé sur un microscope droit avec immersion d’eau 20x 1.00 OBJECTIF NA (Figure 1A).
2. Utilisez Ti: Sapphire laser (avec longueur d’onde tunable) comme source d’excitation. Réglez la longueur d’onde de sortie laser à 880 nm pour EGFP et 940 nm pour tdTomato (Figure 1A).<....

Results

À l’aide de cette plate-forme d’imagerie en direct, la surface oculaire de la souris peut être visualisée au niveau cellulaire. Pour visualiser les cellules individuelles uniques dans la surface oculaire, nous avons employé les souris transgéniques fluorescentes doubles avec EGFP exprimés dans le noyau et tdTomato exprimés dans la membrane cellulaire. Le stroma cornéen riche en collagène a été mis en évidence par les signaux SHG.

Dans l’épithélium cornéen, les cellules superficielles, les cell.......

Discussion

Cette plate-forme d’imagerie MPM sur mesure avec un logiciel de contrôle a été utilisée pour l’imagerie intravitale des organes épithéliaux de souris, y compris la peau¹⁰, follicule pileux¹⁰ et la surface oculaire^9,10 (Figure 1A). Le système sur mesure a été utilisé pour sa flexibilité dans le changement des composants optiques pour diverses expériences, depuis le début de notre projet........

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Logiciel AVIZO Lite	Thermo Fisher Scientific		Version : 2019.3.0
Filtres passe-bande	Semrock	FF01-434/17 FF01-500/24 FF01-585/40
Miroirs dichroïques	Semrock	FF495-Di01-25x36 FF580-Di01-25x36
Galvano	Thorlabs	GVS002
Logiciel de contrôle Jade BIO	SouthPort Corporation	Jade BIO
Chlorhydrate d’oxybuprocaïne	Sigma	O0270000
PMT	Hamamatsu	H7422A-40
Tube en polyesthylène	BECTON DICKINSON	427401
Porte-souris stéréotaxique	Step Technology Co., Ltd	000111
Ti : Laser saphir	Spectra-Physics	Mai-Tai DeepSee
Microscopie verticale	Olympus	BX51WI
Vidisic Gel	Dr. Gerhard Mann Chem-pharm. Fabrik GmbH	D13581
Zoletil	Virbac	VR-2831