Effectuer des biopsies de pincement guidées par colonoscopique chez la souris et évaluer les changements ultérieurs des tissus

Résumé

Ici, nous fournissons une description détaillée de la procédure pour induire des biopsies de pincement colonoscopique-guidées chez les souris et suivre la fermeture de blessure en temps réel. En outre, des méthodes pour la préparation des tissus pour des analyses histologiques, immunohistochimiques et moléculaires du lit de blessure sont fournies.

Résumé

Comprendre les changements tissulaires et cellulaires qui se produisent dans la réponse aux blessures aiguës ainsi que pendant le processus de cicatrisation des plaies est d’une importance primordiale lors de l’étude des maladies du tractus gastro-intestinal (IG). Le modèle de biopsie de pincement du côlon murin est un outil utile pour définir ces processus. En outre, l’interaction entre la teneur en luminal intestinal (p. ex., les microbes) et le côlon peut être étudiée. Cependant, l’induction des plaies et la capacité de suivre la fermeture des plaies au fil du temps d’une manière fiable peuvent être difficiles. De plus, la préparation et l’orientation des tissus doivent être effectuées de manière normalisée afin d’interroger de façon optimale les changements histologiques et moléculaires. Ici, nous présentons une méthode détaillée décrivant des dommages biopsie-induits et la surveillance de la fermeture de blessure par des coloscopies répétées. Une approche est décrite qui assure des mesures cohérentes et reproductibles de la taille des plaies, la capacité de recueillir le lit de plaie pour des analyses moléculaires ainsi que de visualiser le lit de la plaie lors de la section des tissus. La capacité d’effectuer avec succès ces techniques permet d’effectuer des études sur la réponse aiguë aux blessures, la cicatrisation des plaies et les interactions luminal-hôte dans le côlon.

Introduction

Le tractus gastro-intestinal (IG) est un système d’organes complexe compte tenu de ses multiples fonctions, des types de cellules hôtes (p. ex. épithéliales, immunitaires, stromal, etc.) ainsi que des milliards de microbes. À la lumière de cette complexité, les maladies du tractus gastro-intestinal impliquent souvent l’interaction de tous ces facteurs. Par exemple, les maladies inflammatoires de l’intestin (MII) sont associées à des cycles d’inflammation et de rémission dans le tractus gastro-intestinal, impliquant l’activation de cellules inflammatoires, la dysbiose et la réparation épithéliale^{1,2,3,4,5,6,7}. Il est essentiel d’avoir des systèmes modèles appropriés pour étudier les MII et d’autres affections inflammatoires du tractus gastro-intestinal pour élucider la pathogénie de la maladie. Plusieurs modèles existent pour étudier la pathogénie des MII, y compris les souris génétiquement modifiées et l’utilisation de produits chimiques tels que le sulfate de sodium dextran (DSS)^{chez les rongeurs 8,9,10}. Les limites de ces modèles incluent une incapacité de contrôler avec précision l’induction de l’inflammation aussi bien que des difficultés en évaluant la guérison de blessure. D’autres méthodes pour imiter des aspects de la pathogénie d’IBD pourraient s’avérer utiles pour développer des thérapies.

Les biopsies de pincement colonoscopique-guidées chez les souris offrent un système modèle utile pour étudier la pathogénie de la réponse inflammatoire, la guérison de blessure, aussi bien que les interactions d’hôte-microbe dans le côlon. Cette approche a été utilisée pour la première fois comme outil expérimental en 2009, ce qui a démontré son utilité pour étudier la réponse inflammatoire aiguë et la cicatrisation des plaies dans^{l’intestin 11}. Des études ultérieures ont utilisé cette technique pour évaluer les rôles des différentes voies de signalisation ainsi que le microbiote intestinal, dans la cicatrisation des plaies du côlon^{11,12,13,14,15,16,17,18}. Plus récemment, notre groupe a utilisé ce modèle pour étudier l’importance de la signalisation sphingosine-1-phosphate et des bactéries dans la réponse aiguë aux dommages du côlon¹⁹. Bien qu’utile, effectuer des biopsies de pincement colonoscopiques-guidées chez les souris et évaluer des changements ultérieurs de tissu peut être techniquement provocant. Par exemple, la perforation de l’intestin peut se produire lors de l’induction des blessures et de s’assurer que des mesures cohérentes du lit de la plaie par des coloscopies en série peuvent être difficiles. En outre, orienter le tissu du côlon correctement pour visualiser le lit de la plaie pour des analyses histologiques ou immunohistochimiques peut être difficile. Bien que certaines informations existent sur ces méthodes^18,20, une description précise étape-sage de ces techniques le long sera aides visuelles promet d’améliorer la fiabilité et l’utilité plus large de ce modèle. Ici, nous présentons une méthode détaillée pour effectuer des biopsies de pincement colonoscopiques-guidées chez les souris, suivre la fermeture de blessure au fil du temps et préparer le tissu pour permettre des analyses histologiques et moléculaires du lit de blessure. La création d’une méthode standard pour effectuer ces techniques peut étendre l’utilisation de ce modèle pour étudier les médiateurs précédemment non étudiés qui sont potentiellement importants pour l’inflammation gastro-intestinale et la réparation des plaies.

Protocole

Toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par le Institutional Animal Care and Use Committee of Weill Cornell Medicine. À : « Toutes les procédures décrites ici ont été approuvées par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de Weill Cornell Medicine et de l’Université Stony Brook.

1. Coloscopie et induction des plaies

1. Préassembler les composants de l’endoscope en insérant d’abord l’endoscope rigide de 1,9 mm dans la gaine (figure 1A-B). Attachez la pompe à air (pour assurer l’insufflation du côlon) à l’aide du tube fourni, à la vanne de gaz sur le côté gauche de la gaine à côté du canal de travail (figure 1C).
   REMARQUE : Bien que l’objectif décrit ici soit de 0 °, une lentille à 30 ° peut également être utilisée à cette fin.
2. Assurez-vous que le canal de travail est en position ouverte et insérez des forceps de biopsie 3 Fr à travers le canal de travail et avancez-le jusqu’à la fin de la gaine (tout en veillant à ce qu’il ne dépasse pas de la gaine) (Figure 1C). Fixez l’endoscope assemblé à la source lumineuse et au dispositif d’imagerie vidéo selon les instructions du fabricant.
3. Anesthésier la souris avec 5% d’isoflurane avec de l’oxygène dans une chambre d’induction. Déplacez ensuite la souris vers une plate-forme de stadification endoscopique contenant un système de chauffage (pour prévenir l’hypothermie) sur son côté ventral et maintenez sous anesthésie à l’aide d’un cône nasal avec 2% d’isoflurane avec de l’oxygène. Ajouter de l’onguent vétérinaire aux yeux pour éviter la sécheresse sous anesthésie. Assurez-vous que la souris est entièrement anesthésiée en pinçant doucement le pied arrière pour tester un réflexe.
   REMARQUE : Toute souche ou l’un ou l’autre sexe de souris peut être utilisé avec cette technique; cependant, il est préférable que les souris sont au moins 8 semaines d’âge de sorte qu’ils sont assez grands pour la procédure.
   1. Ajouter de l’onguent vétérinaire aux yeux pour éviter la sécheresse sous anesthésie.
   2. Assurez-vous que la souris est entièrement anesthésiée en pinçant doucement le pied arrière pour tester un réflexe.
4. Remplissez une seringue de 3 mL d’une aiguille de gavage de rat attachée avec une solution saline tamponnée de phosphate (PBS) à température ambiante. Insérer l’aiguille d’environ 1 cm dans l’anus de la souris et infuser doucement PBS pour effacer le matériau fécal. Plusieurs granulés fécaux devraient sortir de la souris avec le PBS qui a été infusé.
   REMARQUE : L’instillation d’un volume excessif de PBS peut avoir comme conséquence la formation de mousse dans le lumen qui pourrait obscurcir l’observation du lumen.
5. Insérez l’endoscope assemblé de 0,5 cm dans l’anus de la souris. Avancez les forceps de biopsie dans le lumen du rectum jusqu’à ce que les « mâchoires » complètes (y compris la charnière) des forceps sont au-delà de l’extrémité de la gaine (comme observé sur le moniteur vidéo) (Vidéo supplémentaire 1). Tournez les forceps à 90° de sorte que les mâchoires s’ouvrent dans une orientation est-ouest (Vidéo supplémentaire 1).
6. Pour biopsier, ouvrez les forceps et avancez d’environ 1 cm, fermez les forceps et en un seul mouvement lisse reculez rapidement sur les forceps tout en les laissant fermés (Vidéo supplémentaire 1).
   1. Évitez d’insuffler complètement le côlon lors de l’exécution de la biopsie. Par conséquent, laissez le côté droit de la vanne de gaz ouvert pendant cette étape; bien qu’il convient de noter qu’en ouvrant les forceps il ya un risque d’endommager la muqueuse lorsque le côlon est dans cette position.

2. Visualisation et mesure du lit de plaie

1. Lancez l’enregistrement vidéo immédiatement après la biopsie en appuyant sur la pédale fixée au dispositif d’enregistrement du colonoscope. Insuffler complètement le côlon en appuyant fermement sur un index contre le côté droit de la valve à gaz pour couvrir complètement l’ouverture afin de forcer l’air dans l’endoscope et donc dans le côlon.
   REMARQUE : Bien que ce protocole décrive l’utilisation d’une pompe à air dans laquelle le débit d’air est contrôlé manuellement, une pompe périssaliste avec un approvisionnement en air contrôlé peut également être utilisée.
2. Avancez les forceps de retour hors de la gaine, et dans le lumen rectal tandis que dans la position fermée (Vidéo supplémentaire 1). Placez les forceps contre la paroi rectale immédiatement au-dessus de la plaie jusqu’à ce que la base des mâchoires soit alignée avec le bord supérieur du champ d’observation(figure 2 et vidéo supplémentaire 1). Continuer à insuffler complètement le côlon jusqu’à ce qu’une vue claire de la plaie puisse être observée.
   REMARQUE : Il faut veiller à étendre les forceps suffisamment loin pour ne révéler que les mâchoires des forceps jusqu’à la base pour chaque souris examinée afin d’assurer une distance constante entre la lentille de l’endoscope et la lésion (figure 2, flèche blanche).
3. Si vous effectuez des biopsies sur plusieurs souris le même jour, retirez le tissu biopsié de la souris précédente des forceps (à l’aide de la brosse de nettoyage fournie) et essuyez la gaine de la lentille avec 70% d’éthanol pour le nettoyer avant d’induire une blessure dans la souris suivante.
   REMARQUE : Bien que ce protocole décrit la réalisation d’une biopsie simple par souris, de multiples biopsies peuvent être effectuées sur une seule souris à condition que le tissu prélevé lors de la biopsie antérieure soit retiré des forceps afin de s’assurer qu’une biopsie complète peut être effectuée sur des biopsies ultérieures.
4. Placez la souris dans une cage vide d’autres souris et sur le dessus d’une serviette pour garder les voies respiratoires claires jusqu’à ce qu’elle se remette de l’anesthésie après avoir terminé l’intervention. Surveiller la souris pour s’assurer qu’elle se remet de l’anesthésie comme indiqué par la reprise de l’activité.
   REMARQUE : Deux personnes sont tenues d’induire la plaie et de visualiser le lit de la plaie le jour 0 (l’une exploitant l’endoscope et l’autre exploitant les forceps de biopsie), mais une seule personne est nécessaire pour visualiser les blessures les jours suivants (comme décrit ci-dessous).
5. Suivez la même procédure de préparation de la souris et de coloscopie pour les mesures subséquentes des plaies (généralement les jours 2, 4 et 6 après biopsie), tel que décrit ci-dessus dans les sections 1.1-1.4, à l’exception de l’induction de la plaie.
6. Placez le lit de plaie sur le moniteur vidéo à ces points de temps après l’insertion de l’endoscope, et avancez les forceps de biopsie (dans la position fermée) à immédiatement au-dessus du lit de blessure, insufflez le côlon et initiez l’enregistrement vidéo, tel que décrit dans les sections 2.1 et 2.2 (figure 2).
   REMARQUE : Il peut être difficile de localiser le lit de plaie plus de 6 jours après la biopsie.
7. Avancez les forceps dans le lumen ces jours suivants à la même distance que le jour 0 pour assurer une distance constante entre la lentille de l’endoscope et la lésion à travers les jours. Assurer une distance constante entre la lentille et la lésion améliorera la précision des mesures au fil du temps.
   REMARQUE : Une personne peut effectuer des mesures ces jours-ci (l’endoscope est actionné avec la main droite et les forceps de biopsie sont avancés avec la main gauche).
8. Une fois toutes les mesures terminées, ouvrez les enregistrements vidéo des coloscopies en série dans un logiciel de montage vidéo qui permet la création de plans immobiles à partir de vidéos.
9. Avancez la vidéo sur un cadre montrant un moment où le lit de plaie peut être facilement visualisé, les forceps fermés sont au-dessus du lit de plaie et contre la paroi rectale et le mur est tendu. Prenez un instantané de ce cadre et codez le nom du fichier pour vous assurer que les mesures des lits de plaies sont effectuées de manière aveugle.
10. Ouvrez les images avec des noms de fichiers codés dans NIH ImageJ pour quantifier la taille du lit de plaie. Sous l’onglet Analyser, sélectionnez Mesures définies et cochez la case Zone.
    1. Sélectionnez l’outil sélections à main levée de la barre de menu principale et dessinez un périmètre autour de la plaie (voir figure 2). Sous l’onglet Analyser sélectionnez Mesurer et la valeur de cette mesure se remplira automatiquement dans la fenêtre Résultats.
11. Exportez les résultats dans une feuille de calcul après avoir effectué des mesures pour toutes les images, en sélectionnant Enregistrer comme sous l’onglet Fichier dans la fenêtre Résultats et en changeant l’extension pour devenir un fichier de feuille de calcul.
12. Calculer la taille de la plaie les jours suivant l’induction de la plaie (c.-à-d. les jours 2, 4 et 6) par rapport à la taille le jour 0 (immédiatement après la blessure) dans une feuille de calcul. Pour ce faire, divisez la taille de la plaie chaque jour par la taille de la plaie le jour 0 et convertissez cette valeur en pourcentage.
    REMARQUE : Dans des conditions normales utilisant cette méthode de visualisation colonoscopique, la plus grande fermeture de la plaie est observée après les 2 premiers jours (~75% de réduction de taille) avec une fermeture plus progressive les jours 4 et 6 (~80% et ~95% de réduction de taille, respectivement).

3. Collecte du lit de plaie pour l’analyse moléculaire

1. Euthanasier la souris à l’aide de l’asphyxie au CO₂ suivie d’une dislocation cervicale (ou d’une technique équivalente) le jour choisi suivant la biopsie.
2. Récoltez la région distale du côlon en ouvrant la peau et le muscle abdominal pour exposer la cavité corporelle. Placez des ciseaux fermés sous le côlon et soulevez-les doucement pour le libérer de la mesenterie sous-jacente, puis coupez le côlon à son point médian et à l’anus pour l’enlever de la souris.
3. Rincer la teneur en matières fécales à l’aide d’une aiguille de gavage de rat fixée à une seringue de 20 mL remplie de 1x PBS glacé, puis déposer le côlon sur du papier filtre.
4. Coupez le côlon longitudilement sur du papier filtre en veillant à ce que le côté mésentérique soit face contre le papier filtre. Appliquer 0,2% de bleu méthylène sur la muqueuse à l’aide d’un pipet squeeze tandis que le tissu est encore sur le papier filtre, puis égoutter l’excès de méthylène bleu. Voir le côlon sous un microscope disséquant et localiser le lit de plaie (Figure 3A).
5. À l’aide de ciseaux micro iris de 4 pouces, coupez autour du bord du lit de plaie(figure 3A,cercle pointillé) en prenant soin de ne pas couper dans la couche musculaire (à moins que le muscle ne soit désiré) et transférez le lit de plaie disséqué dans un tube à l’aide de pinces à point fines pour la méthode de stockage snap-freezing ou désirée.
   REMARQUE : La quantité de tissu recueillie de cette manière est suffisante pour extraire l’ARN pour l’ARN-seq ou l’analyse équivalente.

4. Préparation des tissus pour l’analyse histologique

1. Euthanasier la souris et récolter le côlon tel que décrit à l’étape 3.1-3.2.
2. Coupez le côlon longitudilement sur du papier filtre en veillant à ce que le côté mésentérique soit face contre le papier filtre. Appliquer délicatement 4% de paraformaldéhyde (ou fixatif de choix) à l’aide d’un pipet squeeze et couvrir le tissu avec du parafilm. Laisser à plat dans un récipient scellé pendant 4-6 heures.
3. Transférer les tissus à 70 % d’éthanol pour les entreposer. Lorsqu’il est prêt à traiter les tissus, enlever le parafilm et appliquer 0,2% de bleu méthylène à la muqueuse à l’aide d’un pipet squeeze tandis que le tissu est encore sur du papier filtre. Puis égoutter l’excès de méthylène bleu.
4. Voir le côlon sous un microscope disséquant et localiser le lit de plaie (Figure 3A). À l’aide d’un scalpel avec une lame de #10, couper directement à travers le centre du lit de la plaie et continuer à couper à travers le reste du côlon en ligne droite, de sorte que le côlon a été coupé en deux, longueur-sage (Figure 3A, ligne noire).
5. Traiter le côlon, puis l’intégration de paraffine (soit un ou les deux côtés qui restent après la coupe) de sorte que le côté qui a été coupé par le scalpel (le côté qui était le centre du lit de plaie avant la bisection) est face vers le bas dans la paraffine. Procéder à la coupe des sections et la coloration pour la tache désirée ou maker(s).
6. Si des cryosections sont nécessaires pour une coloration donnée, récoltez le côlon tel que décrit à l’étape 3.1 et ouvrez longituditinement sur du papier filtre, en veillant à ce que le côté mésentérique soit face contre le papier filtre.
7. Couper en deux le lit de plaie dans le côlon fraîchement récolté tel que décrit à l’étape 4.5 et intégrer le côlon (l’un ou les deux côtés qui restent après la coupe) de sorte que le côté qui a été coupé par le scalpel est face vers le bas dans un moule de base à moitié rempli de tissu gel moyen.
8. Fixez le tissu en place avec une pince fine et placez le moule de base sur une plaque métallique au-dessus de la glace sèche pour durcir le milieu de congélation. Une fois que la partie inférieure du milieu est congelée (et que le tissu est maintenu en place), relâchez le tissu et remplissez le volume restant du moule de base avec un milieu de congélation et revenez sur de la glace sèche.
   1. Après le gel total du volume de congélation moyenne, transférer dans un congélateur de -80 °C jusqu’à ce qu’il soit sectionnant.
9. Pour la paraffine ou les sections congelées, coupez et tacher des sections supplémentaires par H&E pour vous assurer que le lit de plaie a été capturé sur la section avant de procéder à des taches propres à l’étude. La figure 3B montre un exemple d’une section dans laquelle le lit de plaie peut être clairement observé.

Résultats

Les petits articles (lentille, gaine, forceps biopsie) nécessaires pour effectuer des biopsies sont indiqués dans la figure 1 ainsi que des indicateurs d’assemblage approprié de ces composants. La figure 2 montre des images représentatives des vues acceptables du lit de plaie afin de quantifier avec précision la taille du lit de plaie et le taux de fermeture de la plaie. La figure 3A montre un exemple d’une vue ex vivo du lit de pla...

Discussion

Il est d’une importance primordiale d’assurer des biopsies cohérentes et précises ainsi que des mesures de la taille des plaies lorsqu’on tente d’évaluer efficacement le taux de fermeture des plaies dans ce modèle. Par conséquent, plusieurs mesures devraient être prises pour être sûr que les procédures sont correctement exécutées. Premièrement, la profondeur de la biopsie ne doit pas être trop peu profonde ou profonde. S’il est trop peu profond, il n’y aura pas une fenêtre suffisante pour évaluer la fermeture des plaies....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Pince à biopsie, 3 Fr	Karl Storz	61071ZJ
Système de tour Coloview	Karl Storz	contacter l’entreprise
Gaine d’examen, 9 Fr, Kit	Karl Storz	61029DK
Télescope Hopkins, 0', 1,9 mm x 10 cm	Karl Storz	64301AA
isofluorane	Covetrus	2905
bleu de méthylène	Sigma-Aldrich	M9140
micro ciseaux à iris	Integra	18-1619
NIH ImageJ	NIH	N/A	logiciel disponible en téléchargement gratuit sur : https://imagej.nih.gov/ij/
Pawfly MA-60 pompe d’aquarium	Amazon	N/A
scalpal avec lame #10	Hill-Rom	372610