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Article de méthode

Purification des fibroblastes et des cellules de Schwann des nerfs sensoriels et moteurs in vitro

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DOI :

10.3791/60952

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20 mai 2020

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1Key Laboratory of Neuroregeneration of Jiangsu and Ministry of Education, Co-Innovation Center of Neuroregeneration, Jiangsu Clinical Medicine Center of Tissue Engineering and Nerve Injury Repair, Nantong University

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons une méthode pour purifier les fibroblastes et les cellules de Schwann des nerfs sensoriels et moteurs in vitro.

Résumé

Les principales cellules du système nerveux périphérique sont les cellules Schwann (SC) et les fibroblastes. Ces deux cellules expriment distinctement les phénotypes sensoriels et moteurs impliqués dans différents modèles d’expression de gène de facteur neurotrophique et d’autres processus biologiques, affectant la régénération de nerf. La présente étude a établi un protocole pour obtenir des SCs et des fibroblastes hautement purifiés de rat sensoriels et moteurs plus rapidement. La racine ventrale (nerf moteur) et la racine dorsale (nerf sensoriel) des rats néonatals (7 jours) ont été dissociées et les cellules ont été cultivées pendant 4-5 jours, suivies par l’isolement des fibroblastes sensoriels et moteurs et des SC en combinant la digestion différentielle et les méthodes d’adhérence différentiellement. Les résultats des analyses d’immunocytochimie et de cytométrie de flux ont montré que la pureté des SC et des fibroblastes sensoriels et moteurs était de >90%. Ce protocole peut être utilisé pour obtenir un grand nombre de fibroblastes sensoriels et moteurs / SC plus rapidement, contribuant à l’exploration de la régénération sensorielle et motrice des nerfs.

Introduction

Dans le système nerveux périphérique, les fibres nerveuses se composent principalement d’axones, de cellules Schwann (SC) et de fibroblastes, et contient également un petit nombre de macrophages, de cellules endothéliales microvasculaires et de cellules immunitaires1. Les SC enveloppent les axones dans un rapport de 1:1 et sont entourés d’une couche de tissu conjonctif appelée endoneurium. Les axones sont ensuite regroupés pour former des groupes appelés fascicles, et chaque fascicle est enveloppé dans une couche de tissu conjonctif connue sous le nom de périneurium. Enfin, la fibre nerveuse entière est enveloppée dans une couche de tissu conjonctif, qui est appelé l’épineurium. Dans l’endoneurium, la population cellulaire entière est composée de 48% SC, et une partie substantielle des cellules restantes implique des fibroblastes2. En outre, les fibroblastes sont des composants importants de tous les compartiments nerveux, y compris l’épineurium, le périneurium, et l’endoneurium3. De nombreuses études ont indiqué que les SC et les fibroblastes jouent un rôle crucial dans le processus de régénération après les lésions nerveuses périphériques4,5,6. Après la transection du nerf périphérique, les fibroblastes périneuriaux régulent le tri cellulaire par l’intermédiaire de la voie de signalisation ephrin-B/Ephb2 entre les SC et les fibroblastes, guidant davantage la repousse axonale à travers les blessures5. Les fibroblastes périphériques de nerf sécrètent la protéine de tenascine-C et améliorent la migration des SC pendant la régénération de nerf par la voie de signalisation β1-intégrine7. Cependant, les SC et les fibroblastes utilisés dans les études ci-dessus ont été dérivés du nerf sciatique, qui inclut les nerfs sensoriels et moteurs.

Dans le système nerveux périphérique, les nerfs sensoriels (nerfs afférents) conduisent la signalisation sensorielle des récepteurs au système nerveux central (SNC), tandis que les nerfs moteurs (nerfs efferents) conduisent des signaux du SNC aux muscles. Des études antérieures ont indiqué que les SC expriment des phénotypes moteurs et sensoriels distincts et sécrètent des facteurs neurotrophiques pour soutenir la régénération périphérique du nerf8,9. Selon une étude récente, les fibroblastes expriment également différents phénotypes moteurs et sensoriels et affectent la migration des SC10. Ainsi, l’exploration des différences entre les fibroblastes/SC des nerfs moteurs et sensoriels nous permet d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents complexes de la régénération spécifique du nerf périphérique.

À l’heure actuelle, il existe de nombreuses façons de purifier les SC et les fibroblastes, y compris l’application d’agents antimitotiques, cytolyse à médiation d’anticorps11,12, immunopanning séquentiel13 et laminine substrat14. Cependant, toutes les méthodes ci-dessus éliminent les fibroblastes et ne préservent que les SC. Les SC et les fibroblastes hautement purifiés peuvent être obtenus par la technologie de tri de cytométrie de flux15, mais c’est une technique longue et coûteuse. Ainsi, dans cette étude, une simple méthode de digestion différentielle et d’adhérence différentielle pour purifier et isoler les fibroblastes et les SC des nerfs sensoriels et moteurs a été développée afin d’obtenir un grand nombre de fibroblastes et de SC plus rapidement.

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Protocole

Cette étude a été réalisée conformément aux Lignes directrices institutionnelles sur les soins aux animaux de l’Université de Nantong. Toutes les procédures, y compris les sujets animaux, ont été approuvées de manière éthique par le Comité d’administration des animaux expérimentaux, province du Jiangsu, Chine.

1. Isolement et culture des fibroblastes et des SC des nerfs moteurs et sensoriels

  1. Utilisez des rats Sprague-Dawley (SD) vieux de sept jours (n=4) fournis par le Experimental Animal Center de l’Université de Nantong en Chine. Placer les rats dans un réservoir contenant 5% d’isoflurane pendant 2-3 minutes, laisser les animaux respirer lentement et n’avoir aucune activité indépendante, puis désinfecter à l’aide de 75% d’éthanol avant la décapitation.
  2. Utilisez des ciseaux pour couper la peau arrière pendant environ 3 cm et enlever la colonne vertébrale. Ouvrez soigneusement le canal vertébral pour exposer la moelle épinière.
  3. Maintenir la moelle épinière dans une boîte de Pétri de 60 mm avec 2-3 mL de solution de sel équilibrée (HBSS) de D-Hanks glacée.
  4. Basé sur la structure anatomique, exciser la racine ventrale (nerf moteur) puis la racine dorsale (nerf sensoriel) sous un microscope de dissection. Ensuite, placez-les dans une solution de sel équilibrée (HBSS) glacée de D-Hanks.
  5. Après avoir enlevé le HBSS, couper les nerfs en morceaux de 3-5 mm avec des ciseaux et digérer avec 1 mL de 0,25% (w/v) trypsin à 37 °C pendant 18-20 min. Ensuite, compléter avec 3-4 mL de DMEM contenant 10% de sérum bovin foetal (FBS) pour arrêter la digestion.
  6. Pipette le mélange de haut en bas doucement environ 10 fois et la centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min. Après cela, jeter le supernatant et suspendre le précipité en 2-3 mL de DMEM complété par 10% FBS.
  7. Filtrer la suspension cellulaire à l’aide d’un filtre à mailles de 400, puis inoculer les cellules dans une boîte et une culture Petri de 60 mm à 37 °C en présence de 5 % de CO2. Après 4-5 jours de culture, isoler le passage 0 (p0) fibroblastes et SC après avoir atteint 90% confluence.
  8. Isolement et culture des SC (Figure 1)
    1. Laver les cellules une fois à l’aide de 1x PBS. Ajouter 1 mL de 0,25% (w/v) de trypsie (37 °C) par boîte de Pétri de 60 mm pour digérer les cellules de 8 à 10 s à température ambiante. Après cela, ajouter 3 mL de DMEM complété avec 10% FBS pour arrêter la digestion.
    2. Souffler doucement le mélange pour détacher les SC avec une pipette. Ensuite, recueillir et centrifuger les SC à 800 x g pendant 5 min.
    3. Jetez le supernatant et suspendez le précipité dans 3 ml de DMEM avec 10% FBS, 1% de pénicilline/streptomycine, 2 μM de forskolin et 10 ng/mL HRG, puis inoculer les cellules dans une boîte de 60 mm petri non enduite. Après avoir cuté à 37 °C pendant 30-45 min, les fibroblastes (un certain nombre de fibroblastes sont digérés avec des SC) s’attachent au fond du plat.
    4. Transférer le supernatant (y compris les SC) dans un autre plat et une culture mi-couchés poly-L-lysine (PLL) à 37 °C pendant 2 jours.
  9. Isolement et culture des fibroblastes (Figure 1)
    1. Après avoir enlevé les SC (comme indiqué à l’étape 1.8), laver les fibroblastes restants dans la vaisselle avec 1x PBS, puis ajouter 1 mL de 0,25% (w/v) trypsin pour digérer les fibroblastes pendant 2 min à 37 °C.
    2. Ajouter DMEM complété avec 10% FBS pour mettre fin à la digestion. Soufflez les fibroblastes à l’aide d’une pipette, puis collectez-les et centrifugez à 800 x g pendant 5 min.
    3. Jetez le supernatant, suspendez le précipité avec 2 mL de DMEM contenant 10% de FBS, puis inoculez les cellules dans une boîte de Pétri non garnie de 60 mm. Les fibroblastes après la culture pendant 30-45 min à 37 °C s’attachent au fond du plat. Jetez le supernatant (y compris quelques nombres de SC). Ajouter ensuite 3 mL de DMEM complétés par 10% de FBS dans le plat et la culture des fibroblastes à 37 °C pendant 2 jours.
  10. Passer les cellules p1 jusqu’à ce qu’elles atteignent 90% confluence. Ensuite, purifier par la digestion différentielle et l’adhérence différentielle à nouveau comme décrit dans les sections 1.8 et 1.9.
  11. Digestez les fibroblastes p2 et les SC après la culture pendant 2 jours, puis recueillir les cellules, compter et inoculer en 1 x 105 nombres/bien sur des diapositives enduites de PLL pour l’immunocytochimie (ICC).

2. ICC pour l’identification de la pureté cellulaire

  1. Culturez les cellules pendant 24 h à 37 °C et effectuez la coloration icc après la digestion différentielle et l’adhérence différentielle des fibroblastes et des SC moteurs et sensoriels.
  2. Laver les fibroblastes et les SC moteurs et sensoriels avec 1x PBS et les fixer en 200 μL/puits de paraformaldéhyde à 4 % (pH 7,4) pendant 18 min à température ambiante.
  3. Bloquer l’échantillon de SC avec un tampon de blocage (0,1 % de Triton X-100 dans 0,01 M de SÉRUM CONTENANT 5 % de sérum de chèvre) et bloquer les fibroblastes d’échantillon avec un tampon de blocage (0,01 M pbs contenant 5 % de sérum de chèvre) pendant 45 min à 37 °C après les avoir lavés avec trois fois de PBS.
  4. Retirez la mémoire tampon de blocage et incuber avec les anticorps primaires suivants : anticorps anti-CD90 monoclonal souris (marqueur spécifique pour les fibroblastes) (1:1000) pour les fibroblastes et les anticorps anti-S100 de souris (marqueur spécifique pour les SC) (1:400) pour les SC à 4 °C pendant la nuit.
  5. Jetez les anticorps primaires, lavez-les trois fois avec pbs et incuber avec les anticorps secondaires suivants : Alexa Fluor 594 goatoile igG (1:400) pour les fibroblastes et IgG anti-souris de chèvre conjuguée à 488 (1:400) pour les SC à température ambiante pendant 1,5 h.
  6. Laver les échantillons trois fois avec pbs, et tacher les noyaux avec 5 μg/mL Hoechst 33342 colorant pendant 10 min à température ambiante. Laver l’échantillon avec 1x PBS trois fois et les monter à l’aide du support de montage (20 μL/slide) sur la glissière en verre.
  7. Prenez les photographies cellulaires par microscope à balayage laser confocal dans trois champs aléatoires pour chaque puits. Évaluez le nombre total de cellules positives cd90, de cellules S100 positives, puis calculez le pourcentage de cellules CD90 positives et de cellules S100 positives, respectivement. Effectuer la coloration en triple.

3. Analyse de cytométrie de flux (FCA) pour l’identification de la pureté cellulaire

  1. Évaluer la pureté des fibroblastes et des SC moteurs et sensoriels tels que décrits précédemment par FCA16. En bref, digérer les fibroblastes et les SC moteurs et sensoriels p2 avec une trypsie de 0,25 % (w/v), réutilir les granulés cellulaires et les incuber en milieu de fixation à température ambiante pendant 15 min.
  2. Incuber les cellules avec un milieu de perméabilisation et une sonde à l’aide d’anticorps anti-CD90 monoclonal souris (0,1 μg/106 cellules, 200 μL) pour les fibroblastes et les anticorps anti-S100 de souris (1:400, 200 μL) pour les SC à température ambiante pendant 30 min, respectivement.
  3. Incuber les cellules avec igG igG anti-souris de chèvre conjuguée à 488 pendant 30 min. Utilisez le calibre FACS pour effectuer la cytométrie de flux et analysez les données à l’aide du logiciel Cell Quest.
  4. Incuber les cellules uniquement avec 488-conjugués chèvre anti-souris IgG (fibroblastes Group) et la souris IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Contrôle de l’isotype (groupe SC), qui sert de contrôle négatif.

4. Analyse statistique

  1. Présenter toutes les données comme moyens ± SEM. Évaluer les différences statistiques dans les données par t-testnon apparié à l’aide de GraphPad Prism 6.0. Définissez la signification statistique à p<0.05. Effectuez tous les tests en triple.

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Résultats

Observation microscopique légère
Les SC et les fibroblastes sont les deux principales populations cellulaires obtenues dans la culture cellulaire primaire à partir des tissus nerveux. Après l’inoculation pendant 1 h, la plupart des cellules ont adhéré au fond du plat, et la morphologie cellulaire est passée de ronde à ovale. Après avoir passé 24 h à cultiver, les SC ont présenté une morphologie bipolaire ou tripolaire et la longueur de ceux-ci variait de 100 à 200 μm. ...

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Discussion

Les deux principales populations cellulaires de nerfs périphériques comprenaient les SC et les fibroblastes. Les fibroblastes et SC principalement cultivés peuvent aider avec précision à modéliser la physiologie des fibroblastes et des SC pendant le développement et la régénération des nerfs périphériques. L’étude a montré que les cellules nerveuses sciatiques de rat P7 contenaient environ 85% des SC S100-positifs, 13% des fibroblastes OX7-positifs et seulement 1,5% des macrophages OX42-positifs13...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par le National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2017YFA0104703), la National Natural Foundation of China (Grant No. 31500927).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Alexa Fluor 594 Chèvre Anti-Souris IgG(H+L)Life TechnologiesA11005Dilution : 1:400
CoraLite488-conjugué Affinipure Chèvre Anti-Souris IgG(H+L)ProteintechSA00013-1Dilution : 1:400
Microscope confocal à balayage laserLeica MicrosystemsTCS SP5
Logiciel Cell QuestBecton Dickinson Biosciences
Solution saline équilibrée de D-HankGibco14170112
DMEM Corning10-013-CV
Microscope de dissectionOlympusSZ2-ILST
Sérum fœtal bovin (FBS)Gibco10099-141C
ForskolinSigmaF6886-10MG
Fluoroshield Montage MediumAbcamab104135
Milieu de fixation/Milieu de perméabilisationMulti Sciences (LIANKE) Biotech, Co., LTDGAS005
Cytométrie en fluxBecton Dickinson BiosciencesFACS Calibur
Souris IgG1 kappa [MOPC-21] (FITC) - Contrôle des isotypesAbcamab106163Dilution : 1:400
Anticorps monoclonal anti-CD90 de sourisAbcamab225Dilution : 1:1000 pour ICC, 0,1 et micro ; g pour cellules 106 pour
anti-S100 de sourisAbcamab212816Dilution : 1:400
Polylysine (PLL)SigmaP4832
Humain recombinant NRG1-beta 1/HRG1-beta 1 Domaine EGF Protéine R& D Systems396-HB-050
0,25 % (p/v) trypsineGibco25200-072
anticorps Flow Cyt

Références

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