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Article de méthode

Un modèle immunologique pour la transplantation héterotopique de cellules cardiaques et cardiaques chez les rats

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DOI :

10.3791/60956

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8 mai 2020

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1Regenerative Medicine and Experimental Surgery, Department of General, Visceral and Transplant Surgery, Hannover Medical School

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un modèle de transplantation abdominale hétérotopique de coeur chez les rats, impliquant des modifications des stratégies actuelles, qui mènent à une approche chirurgicale simplifiée. En outre, nous décrivons un modèle de rejet nouveau par l’injection dans l’oreille des cellules cardiaques vitales de muscle, permettant d’autres analyses immunologiques de greffe chez des rats.

Résumé

La transplantation héterotopique de coeur chez les rats a été un modèle couramment employé pour diverses études immunologiques pendant plus de 50 années. Plusieurs modifications ont été signalées depuis la première description en 1964. Après 30 ans d’exécution de la transplantation hétérotopique de coeur chez les rats, nous avons développé une approche chirurgicale simplifiée, qui peut être facilement enseignée et exécutée sans formation chirurgicale ou fond ultérieur.

Après dissection de l’aorte ascendante et de l’artère pulmonaire et de la ligature des veines cavales et pulmonaires supérieures et inférieures, le cœur du donneur est récolté et perfusé par la suite avec la solution saline glacée complétée par de l’héparine. Après avoir serré et incisiné les vaisseaux abdominaux receveurs, l’aorte ascendante et l’artère pulmonaire du donneur sont anastomosed à l’aorte abdominale destinataire et le cava inférieur de vena, respectivement, utilisant des sutures continues de fonctionnement.

Selon différentes combinaisons donneur-bénéficiaires, ce modèle permet d’analyser le rejet aigu ou chronique des allografts. La signification immunologique de ce modèle est encore renforcée par une nouvelle approche de l’injection intra-auriculaire des cellules cardiaques vitales de muscle et l’analyse ultérieure du tissu lymphatique cervical drainant.

Introduction

La transplantation cardiaque hétérotopique est un modèle expérimental fréquemment utilisé pour différentes investigations concernant la tolérance de transplantation, le rejet aigu et chronique d’allogreffe, les dommages d’ischémie-réperfusion, la perfusion de machine ou le remodelage cardiaque. Entre autres avantages, la fonction de greffe peut être surveillée non invasivement par palpation et l’échec de greffe ne conduit pas à une déficience vitale du receveur en contraste avec d’autres organes, tels que les reins ou les foies.

En 1964, Abbott et coll. ont d’abord décrit la transplantation héterotopique abdominale de coeur chez les rats1. Plus tard, en 1966, la technique de bout en bout pour les anastomoses a été décrite par Tomita et coll.2. Le travail de base pour le modèle actuellement utilisé a été rapporté par Ono et Lindsey en 19693. Au cours des dernières décennies, plusieurs modifications ont été publiées pour créer différents types de greffes de cœur ventriculaire gauches déchargées, partiellement chargées ou chargées, y compris la transplantation cardiaque-poumon hétérotopiquecombinée 4,5,,6. Pour les analyses immunologiques, une transplantation de greffe de coeur chargée non-volume est le plus couramment effectuée. Dans ce cas, le flux sanguin pénètre rétrogradement dans l’aorte ascendante de donneur et par la suite les artères coronaires. Le drainage veineux se produit le long du sinus coronaire dans l’oreillette et le ventricule droit(figure 1A-B). Par conséquent, le ventricule gauche est exclu du flux sanguin, en dehors des quantités marginales de sang des veines de Thèbes. Cela en fait également un modèle utile pour étudier les mécanismes pathophysiologiques pendant la thérapie gauche ventriculaire dispositif d’assistance7.

La transplantation cardiaque hétérotopique a été effectuée chez diverses espèces, y compris les souris, lapins, porcs et a même été utilisé comme un dispositif d’assistance uni- ou biventriculaire chez l’homme8,9,10,11. Le rat représente toujours un animal expérimental populaire pour les modèles de transplantation, d’autant plus que les temps de survie de greffe pour différentes combinaisons de souches de rat ont été bien définis dans le passé et un grand nombre de réactifs immunologiques sont accessibles12,13. Contrairement aux souris, les rats sont plus grands faisant la chirurgie et l’accès au tissu lymphatique pour des analyses immunologiques plusfaisables 12. En outre, l’introduction de technologies commerciales de clonage chez les rats ces dernières années conduira très probablement à un intérêt récurrent pour les modèles de rat expérimental14.

En général, les greffes cardiaques hétérotopiques peuvent être fixées aux vaisseaux receveurs en effectuant une anastomose cervicale ou abdominale. Cependant, quelques études suggèrent qu’une anastomose fémorale facilite une meilleure surveillance en raison d’un meilleur accès pour la palpation manuelle ou l’échocardiographie transfemorale et permet ainsi une détection plus précise de l’échec de greffe15,16.

Il a été démontré qu’il n’y a aucune différence en ce qui concerne le temps d’opération, le taux de complication, les résultats et le temps de survie de greffe entre les deux techniques d’anastomose17. De toute évidence, la disponibilité d’un nombre suffisant de ganglions lymphatiques drainants doit être mentionnée comme un avantage de l’anastomose cervicale; cependant, des périodes d’entraînement plus longues sont nécessaires. En revanche, l’anastomose abdominale est moins compliquée et également valable pour les investigations immunologiques, particulièrement lorsqu’elle est combinée avec des résultats d’une nouvelle méthode d’injection dans l’oreille des cellules cardiaques allogenic et lymphadenectomy cervical suivant. Une combinaison des deux modèles offre un large éventail d’analyses immunologiques post-interventionnelles.

Le protocole suivant se réfère à l’opération en paires de chirurgiens afin de réduire le temps d’ischémie. Cependant, toutes les expériences peuvent être effectuées par une seule personne. La configuration d’instruments et de matériaux pour l’explantation et l’implantation cardiaque est affichée dans la figure 2A-B.

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Protocole

Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément aux directives du Comité local d’examen des animaux d’éthique des autorités régionales pour la protection des consommateurs et la sécurité alimentaire de Basse-Saxe (LAVES, Oldenburg, Allemagne) avec l’approbation des 12/0768 et 17/2472.

1. Explantation et perfusion cardiaque

REMARQUE : Comme les donneurs de greffe, les rats femelles ou mâles à un âge de 7-22 semaines ont été employés.

  1. Anesthésiez le rat donneur par inhalation d’isoflurane (induction à 5% et entretien à 3% avec un flux O2 de 1 L/min). Injecter 5 mg de carprofène sous-cutanée par kg de poids corporel pour l’analgésie périopératoire et vérifier l’absence du réflexe de retrait de pincement d’étteil.
  2. Appliquer le lubrifiant pour les yeux et enlever la fourrure abdominale et thoracique à l’aide d’une tondeuse mécanique.
  3. Placer le donneur en position de supine, fixer les membres à la base de la table d’opération avec des bandes élastiques et stériliser la peau avec 70% d’éthanol ou une autre alternative suffisante.
  4. Incisez la peau dans la direction longitudinale et après l’application de l’anesthésique local (p. ex., la lidocaïne 0,2 %) effectuer une laparotomie médiane à l’aide de ciseaux.
  5. Insérez les rétracteurs, mobilisez l’intestin à gauche du donneur et exposez le cava de vena inférieur avec des cotons-tiges stérilisés.
  6. Pour l’anticoagulation, injecter 500 I.U. d’héparine dissous dans 1 ml de solution saline isotonique glacée par voie intraveineuse en perforant le cava vena inférieur. Arrêtez le saignement au site de perforation par compression légère avec un coton-tige après rétractation de l’aiguille(figure 3A).
  7. Incisez le diaphragme et effectuez la thoracotomie latérale aux deux côtés du donneur.
  8. Épinglez le mur ventral mobilisé du thorax sur la table d’opération.
  9. Retirez le péricarde et le nerf vagal par préparation émoussée à l’aide de deux porte-aiguilles micro.
  10. Effectuer la transection des vaisseaux abdominaux afin d’exsanguinate le donneur et décharger le cœur.
  11. Insérez la branche émoussée d’une sonde aux ciseaux pointus dans le sinus péricardique transversal et séparez l’aorte ascendante et l’artère pulmonaire aussi distale que possible sous la traction cautale légère du cœur avec une compresse mouillée(figure 3B).
  12. Placez une seule ligature 5-0 autour du vena cava supérieur et inférieur et les veines pulmonaires et serrez-le aussi dorsal que possible (figure 3C).
  13. Coupez le tissu dorsale à la ligature et extrayez le cœur (figure 3D).
  14. Perfusez le cœur explanté avec une canule de 18 G à partir d’un cathéter intraveine à travers l’aorte ascendante et l’artère pulmonaire avec 30 ml de glace froide, solution saline isotone complétée par 1000 I.U. d’héparine et placer le cœur dans un tube de 15 mL rempli de solution saline sur la glace (Figure 3E-F).

2. Implantation cardiaque

REMARQUE : En tant que destinataires, des rats femelles ou mâles de 10 à 14 semaines ont été utilisés. Les donneurs et les receveurs étaient à peu près appariés.

  1. Effectuez l’anesthésie du rat destinataire en utilisant également l’inhalation d’isoflurane (induction à 5% et entretien à 1,5-2% avec un flux O2 de 1 L/min). Injecter 5 mg de carprofène sous-cutanée par kg de poids corporel pour l’analgésie périopératoire et vérifier l’absence du réflexe de retrait de pincement d’étteil.
  2. Appliquer le lubrifiant pour les yeux, enlever la fourrure abdominale, fixer les membres et stériliser la peau de façon analogue à la préparation du donneur. Pour des résultats postopératoires optimaux, effectuez l’opération sur un tapis de chauffage pour prévenir l’hypothermie peropératoire.
  3. Après l’incision longitudinale de la peau, appliquez un anesthésique local, tel que la lidocaïne (0,2 %), sur le fascia abdominal. Ouvrez la cavité abdominale par la laparotomie médiane et insérez les rétracteurs.
  4. Mobiliser l’intestin vers le côté supérieur gauche du receveur et le placer dans une compresse chaude et mouillée.
  5. Après avoir mobilisé le duodénum et le jejunum proximal, respectivement, à l’aide du microscope chirurgical (ou des lunettes grossissantes) avec un grossissement 5-7x, exposer l’aorte abdominale et le vena cava inférieur par préparation émoussée avec des cotons-tiges. Ne séparez pas les vaisseaux abdominaux.
  6. Élever les vaisseaux abdominaux à l’aide de deux micro-porte-aiguilles sans blesser les veines lombaires et positionner la pince vasculaire Cooley(figure 4A).
  7. Perforez les vaisseaux abdominaux avec une canule arquée de 27 G(figure 4B).
  8. Agrandir le site de perforation à l’aide de ciseaux Potts pour créer une incision longitudinale qui correspond à la taille des lumen des vaisseaux donneurs(figure 4C-D) et perfuser les vaisseaux destinataires avec une solution saline afin d’enlever les caillots et de prévenir la thrombose postopératoire.
  9. Placez la greffe dans le situs et fixez l’aorte ascendante du donneur à l’aorte abdominale du receveur par deux points interrompus simples (8-0 monofilament suture non résorbable) au coin crânien et caudal de l’incision longitudinale(figure 4E).
  10. Anastomose l’aorte ascendante du donneur avec l’aorte abdominale du receveur par un 8-0 en cours d’exécution suture monofilament en deux étapes: premièrement, placez la greffe à droite des vaisseaux destinataires et effectuez la première moitié de l’anastomose(figure 4E). Par la suite, placez la greffe à gauche des vaisseaux destinataires et effectuez la deuxième moitié de l’anastomose(figure 4F).
  11. Fixer l’artère pulmonaire du donneur au cava inférieur de vena analoguement à l’anastomose aortale (8-0 monofilament suture non résorbable). Suture la première moitié de l’anastomose veineuse du côté intraluminal du vaisseau(figure 4G-H).
  12. Rincer les anastomoses avec saline directement avant de resserrer les noeuds pour prévenir l’embolie périphérique.
  13. Placez une gaze hémostatique autour des deux anastomoses et relâchez soigneusement la pince vasculaire de Cooley de sorte que la répafusion de la greffe puisse commencer. Manipuler les saignements le long des anastomoses par compression légère avec des cotons-tiges stérilisés.
    REMARQUE : La greffe devrait commencer à battre après environ 60 s.
  14. Remplacez l’intestin dans un méandre comme la mode. Assurez-vous qu’il n’y a pas de malrotations du radix mésensèque pour prévenir la nécrose intestinale ou l’obstruction mécanique.
  15. Fermez les muscles abdominaux/fascia et la peau séparément à l’aide de sutures continues de polyfilament 3-0.

3. Soins postopératoires

  1. Pour l’analgésie postopératoire, fournir aux destinataires une injection sous-cutanée supplémentaire de 5 mg de carprofène par kg de poids corporel le premier jour postopératoire (POD). En outre, ajouter 1 g de Metamizol à 500 ml d’eau potable jusqu’à la troisième POD.
  2. Commencez à surveiller la fonction de greffe cardiaque par palpation abdominale quotidienne sur le troisième POD.
    REMARQUE : En cas d’échec de greffe avant le troisième POD, une insuffisance chirurgicale plutôt qu’immunologique devrait être considérée. Cependant, cela dépend bien sûr de la combinaison de souches choisie et du modèle immunologique respectif (p. ex., rejet hyperacute après la vaccination préalable).
  3. Après le rejet de greffe, extraire des tissus comme les ganglions lymphatiques rétropétonéaux drainants crâniens des anastomoses, de la rate, du sang, du thymus et de la greffe pour d’autres analyses immunologiques par cytométmétrie de débit ou immunohistochimie.

4. Digestion enzymatique du cœur et injection sous-cutanée des cellules cardiaques de l’oreille

  1. Effectuez l’explantation et la perfusion cardiaque de façon analogue à la transplantation cardiaque hétérotopique (voir étape 1).
  2. Badigeonné le cœur en blocs de 3 mm x 3 mm à l’aide d’un scalpel stérile ou de ciseaux stériles et incuber pendant 30 min à 37 oC en milieu de culture contenant 0,5 mg/mL collagenase.
    REMARQUE : Il est important d’employer le milieu de culture contenant la pénicilline, la streptomycine et la glutamine sans sérum foetal de veau (FCS) particulièrement pendant que FCS inhibe la digestion de collagène.
  3. Ajouter le tissu digéré à un tamis à gros pored, tout en en enlevant le milieu de la culture et hacher soigneusement pour obtenir une suspension des cellules cardiaques vitales, la plupart du temps des cellules cardiaques simples mortes et des cellules sanguines restantes. Laver la suspension cellulaire deux fois avec une solution saline isotonique stérile.
    REMARQUE : Paramètres de centrifugation : 10 min, 200 x g, 20 oC
  4. Filtrer la suspension à l’aide d’une passoire cellulaire de 40 m et recueillir les congeries cellulaires vitales en rinçant la passoire cellulaire avec 5-10 ml de solution saline isotonique.
  5. Après centrifugation, réanimer les cellules du muscle cardiaque en solution saline dissoute à une concentration de 5x105 cellules/mL et tirer la solution cellulaire vers le haut dans une seringue de 1 mL.
  6. Effectuez une anesthésie analogue au protocole décrit pour la narcose bénéficiaire (voir étape 2) pour la transplantation cardiaque hétérotopique.
  7. Placez le destinataire dans une position latérale et fixez l’oreille avec un doigt à l’aide de ruban double(figure 5A).
  8. Injecter 20 lil de la solution de cellules de muscle cardiaque (contenant 1 x 104 cellules) par l’intermédiaire d’une canule de 27 G s.c. près des vaisseaux capillaires visuels dans l’oreille du receveur(figure 5B).
  9. Après une période d’observation définie (selon la combinaison de souches choisie et la force de rejet), extraire les ganglions lymphatiques cervical drainants et effectuez d’autres analyses telles que la cytométrie du débit ou les co-cultures(figure 5C).
    REMARQUE : En outre, l’analyse histologique du pinna peut être effectuée pour déterminer l’infiltration de cellules.

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Résultats

Dans le passé, différentes questions immunologiques ont été abordées sur la base du modèle, qui a été validé dans le groupe de travail par plus de 500 greffes avec un taux de survie de plus de 95%13,18,19,20,21,22,23,24. Les...

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Discussion

La méthode précédemment décrite de la transplantation cardiaque hétérotopique chez les rats est principalement basée sur la description d’Ono et Lindsey en 19693. Depuis lors, plusieurs modifications ont été introduites chez diverses espèces, ce qui a conduit à une grande diversité de ce modèle. Combinant plusieurs de ces modifications et introduisant notre propre expérience résultant de plus de 30 ans d’exécution des transplantations cardiaques hétérotopiques en laboratoire, nous avons créé une a...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous tenons à remercier Britta Trautewig, Corinna Lebbert et Ingrid Meder pour leur engagement.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Appareil d’anesthésie (y compris vaporisateur d’isoflurane)Summit Anesthesia SolutionsAucun numéro de catalogue disponible
Canule (27 G)BD Microlance302200
CarprofènePfizerRimadyl 50 mg/mL
Tubes Cellstar (15 mL)GreinerBioOne188271
Crépine cellulaire (40 µ ; m)BD Falcon2271680
Collagénase Type CLSIIBiochromeC2-22
Compresses 5x5 cmFuhrmann31501
Compresses 7,5x7,5 cmFuhrmann31505
Cotons-tigesHeinz Herenz Medizinalbedarf1032128
Dexpathenol (5 %)Bayer"Bepanthen »
DPBS BioWhittakerLonza17-512F
PinceB. BraunAesculap BD557R
PinceB. BraunAesculap BD313R
PinceB. BraunAesculap BD35
Tapis chauffantGaymar Industries"T/Pump"Gaze
hémostatiqueEthiconTabotamp
Héparine-Natrium 25 000 I.E.RatiopharmAucun numéro de catalogue disponible
Isofluran CPCP-PharmaAucun numéro de catalogue disponible
Tamis à grands pores (acier inoxydable)Forschungswerkstä ; tten Hannover Medical SchoolAucun numéro de catalogue disponible
LidocaïneAstra Zeneca2 % Xylocain
Metamizol-NatriumRatiopharmaNovaminsulfon 500 mg/mL
Micro pinceB. BraunAesculap BD3361
Porte-aiguille MicroCodman, Johnson & Johnson MedicalCodmann 80-2003
Micro porte-aiguilleB. BraunAesculap BD336R
Porte-aiguillemicro B. BraunAesculap FD241R
Micro-ciseauxB. BraunAesculap FD101R
Micro-ciseauxB. BraunAesculap FM471R
Porte-aiguilleB. BraunAesculap BM221R
Pénicilline/Streptomycine/Glutamine (100x)PAAP11-010
Cathéter veineux périphérique (18 G)B. Braun4268334B
Cathéter veineux périphérique (22 G)B. Braun4268091B
Ciseaux pointus sondeB. BraunAesculap BC030R
ÉcarteursForschungswerkstä ; tten Hannover Medical SchoolAucun numéro de catalogue disponible
BE12-702F
Solution saline (NaCl 0,9 %)BaxterAucun numéro de catalogue disponible
CiseauxB. BraunAesculap BC414
Microscope chirurgicalCarl-ZeissOPMI-MDM
Sutures (anastomoses)CatgutMariderm 8-0
(ligature)ResorbaSilk 5-0 polyfil
Sutures (peau, fascia)EthiconMersilene 3-0
(1 mL)B. Braun9166017V
Seringue (10 mL)B. Braun4606108V
Seringue (20 mL)B. Braun4606205V
Pince vasculaireB. BraunAesculap FB708R
Milieu de culture RPMI Lonza Sutures monofil Seringue

Références

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  2. Tomita, F. Heart homotransplantation in the rat. Sapporo igaku zasshi. The Sapporo Medical Journal. 30 (4), 165-183 (1966).
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