Approche stéréotaxique angulaire adaptable pour des techniques de neuroscience polyvalentes

Résumé

Décrite ici est une procédure stéréotaxique qui peut cibler des régions cérébrales difficiles et difficiles à atteindre (en raison de limitations spatiales) en utilisant une approche coronale inclinée. Ce protocole est adaptable aux modèles de souris et de rats et peut être appliqué à diverses applications neuroscientifiques, y compris l’implantation de canules et les microinjections de constructions virales.

Résumé

La chirurgie stéréotaxique est un outil essentiel dans le laboratoire de neurosciences moderne. Cependant, la capacité de cibler avec précision et précision les régions cérébrales difficiles à atteindre présente toujours un défi, en particulier lorsqu’il s’il s’art de cibler les structures cérébrales le long de la ligne médiane. Ces défis comprennent l’évitement du sinus sagittal supérieur et du troisième ventricule et la capacité de cibler systématiquement les noyaux cérébraux sélectifs et discrets. En outre, les techniques de neurosciences plus avancées (par exemple, l’optogénétique, la photométrie des fibres et l’imagerie à deux photons) reposent sur l’implantation ciblée de matériel important dans le cerveau, et les limitations spatiales sont un obstacle courant. Présenté ici est un protocole modifiable pour le ciblage stéréotaxique des structures cérébrales des rongeurs en utilisant une approche coronale inclinée. Il peut être adapté à 1) des modèles de souris ou de rats, 2) diverses techniques de neurosciences et 3) plusieurs régions du cerveau. À titre d’exemple représentatif, il comprend le calcul des coordonnées stéréotaxiques pour le ciblage du noyau ventromédian hypothalamique (VMN) de souris pour une expérience d’inhibition optogénétique. Cette procédure commence par la micro-injection bilatérale d’un virus adéno-associé (AAV) encodant un canal chlorure sensible à la lumière (SwiChR++) sur un modèle murin dépendant de Cre, suivie de l’implantation bilatérale inclinée de canules à fibres optiques. En utilisant cette approche, les résultats montrent que l’activation d’un sous-ensemble de neurones VMN est nécessaire pour les réponses antirégulatrices du glucose intactes à l’hypoglycémie induite par l’insuline.

Introduction

Le contrôle neuronal du comportement, de l’alimentation et du métabolisme implique la coordination de neurocircuits hautement complexes, intégratifs et redondants. L’un des ent objectifs du domaine des neurosciences est de disséquer la relation entre la structure et la fonction des circuits neuronaux. Bien que les outils classiques des neurosciences (c’est-à-dire les lésions, les injections pharmacologiques locales et la stimulation électrique) aient révélé des connaissances vitales concernant le rôle de régions cérébrales spécifiques qui contrôlent le comportement et le métabolisme, ces outils sont limités par leur manque de spécificité et de réversibilité^1.

Les progrès récents dans le domaine des neurosciences ont considérablement amélioré la capacité d’interroger et de manipuler la fonction du circuit d’une manière spécifique au type cellulaire avec une résolution spatio-temporelle élevée. Les approches optogénétiques² et^{chimiogénétiques 3,} par exemple, permettent la manipulation rapide et réversible de l’activité dans des types cellulaires génétiquement définis d’animaux en mouvement libre. L’optogénétique implique l’utilisation de canaux ioniques sensibles à la lumière, appelés channelrhodopsines, pour contrôler l’activité neuronale. La clé de cette technique est l’administration génique de la channelrhodopsine et une source de lumière pour activer l’opsine. Une stratégie courante pour l’administration de gènes consiste à combiner 1) des souris génétiquement modifiées exprimant la Cre-recombinase dans des neurones discrets et 2) des vecteurs viraux dépendants de la Cre codant pour la channelrhodopsine.

Alors que l’optogénétique fournit un moyen élégant et très précis de contrôler l’activité neuronale, la méthode dépend de la micro-injection stéréotaxique réussie du vecteur viral et du placement de la fibre optique dans une région définie du cerveau. Bien que les procédures stéréotaxiques soient courantes dans le laboratoire de neurosciences moderne (et il existe plusieurs excellents protocoles décrivant cette procédure),^4,5,6, être capable de cibler de manière cohérente et reproductible des régions cérébrales discrètes le long de la ligne médiane (c’est-à-dire l’hypothalamus médio-sasal, une zone du cerveau essentielle à la régulation des fonctions homéostatiques⁷) présente des défis supplémentaires. Ces défis comprennent l’évitement du sinus sagittal supérieur, du troisième ventricule et des noyaux hypothalamiques adjacents. En outre, il existe des limites spatiales importantes à l’implantation bilatérale du matériel nécessaire aux études d’inhibition. Avec ces défis à l’esprit, ce protocole présente ici une procédure modifiable pour cibler des régions cérébrales discrètes via une approche stéréotaxique inclinée.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées conformément aux National Institutes of Health, au Guide for the Care and Use of Animals et ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) et environmental Health and Safety de l’Université de Washington.

1. Calcul des coordonnées inclinées

1. À l’aide d’un atlas du cerveau coronal, marquez un triangle rectangle afin que l’hypoténuse traverse la région cible d’intérêt. Dans l’exemple représentatif(Figure 1),le noyau ventromédian hypothalamique (VMN) est ciblé à un angle de 15° par rapport à la ligne médiane coronale.
   REMARQUE: Le placement de l’axe de rotation représenté à la figure 1 (et donc la longueur du côté C) est arbitraire et peut être modifié pour cibler n’importe quelle région du cerveau. Bien que cela puisse sembler contre-intuitif, les étapes ultérieures du protocole ajusteront la position de la tête dans l’axe z de sorte que ce point s’aligne sur le centre de rotation stéréotaxique (voir section 6). Cependant, il est recommandé de ne pas dépasser un angle de rotation coronal de 15° en raison des contraintes physiques de l’appareil de support de tête.
2. Établissez l’angle souhaité (a) et la longueur estimée du côté B et utilisez la trigonométrie pour calculer la longueur des côtés A et C. Cette étape est importante pour bien positionner la tête pendant la rotation.
   REMARQUE: Dans l’exemple de la figure 1,le quadrillage de l’atlas est utilisé pour approximer la longueur du côté B, ce qui donne une longueur de 7,576 mm. Ces informations sont utilisées pour calculer la longueur de la face A :
   
   Dans cet exemple, 2,03 mm indique la distance R/L de la ligne médiane à laquelle la canule à fibres optiques pénètre dans le cerveau lorsque la tête est tournée de 15°.
   1. Si vous le souhaitez, calculez la longueur du côté C pour approximer la coordonnée D/V :
      
      REMARQUE: 1) La longueur de l’hypoténuse (C) ne représente pas la profondeur de l’injection, mais sera utile pour déterminer la coordonnée D / V, qui peut devoir être ajustée pour s’adapter à la longueur accrue par rapport au côté B pour les injections directes. Il est donc recommandé d’effectuer des injections de test pour optimiser la coordonnée D/V. 2) Dans cet exemple ciblant le VMN, on obtient deux ensembles de coordonnées : un pour la microinjection non inclinée (A/P = -1,4, R/L = 0,4 à 0°, D/V = -5,7) et un pour l’implantation en fibre optique inclinée (A/P = -1,4, R/L = 0,0 à 15°, D/V = -5,4).

2. Préparation de la stéréotaxe pour la procédure inclinée

1. Confirmez que le cadre stéréotaxique et le micromanipulateur ont été étalonnés (voir le manuel Kopf pour le protocole complet).
2. Placez la jauge de hauteur centrale dans la douille de la plaque de base du support de tête.
3. Fixez la lunette de centrage dans le porte-outil, puis regardez vers le bas. Ajustez la position du micromanipulateur jusqu’à ce que le réticule soit aligné et focalisé sur le réticule de la jauge.
   REMARQUE: Au cours de cette étape, la lunette est positionnée dans le plan focal du centre de rotation du porteur de tête. Une fois établi, le micromanipulateur ne doit pas être déplacé pendant les étapes restantes.
4. Placez les barres d’oreille dans les supports et centrez-les de manière à ce que les lignes de l’indicateur des deux côtés soient à 0(Figure 3A).
5. Utilisez les boutons médiaux latéraux et antérieurs postérieurs du porte-tête (Figure 2) pour aligner au centre les barres d’oreille dans les plans x et y au-dessus du réticule de la jauge de hauteur centrale (Figure 3A).
6. Pour aligner la position de la barre auriculaire sur l’axe z, retirez les barres auriculaires du support et retirez la jauge de hauteur centrale. Remplacez les barres d’oreille et centrez-les à nouveau à 0.
7. Vue vers le bas de la portée. Utilisez le bouton de changement de vitesse vertical(Figure 3B)et le bouton d’inclinaison coronale, respectivement, pour abaisser et faire pivoter les barres d’oreille jusqu’à ce que le réticule de la lunette reste centré entre les barres d’oreille tout au long de la rotation coronale.
8. La stéréotaxe est maintenant calibrée et prête. N’apportez pas d’autres ajustements à la position du porte-tête.

3. Préparation des matériaux pour injection/implantation

1. Assurez-vous que tous les instruments, outils chirurgicaux et matériaux sont stérilisés et placés dans un champ chirurgical stérile à côté de la stéréotaxe.
2. Manipuler et stocker les constructions virales en fonction de leur niveau de biosécurité et des exigences réglementaires institutionnelles pertinentes en matière de biosécurité.
3. Aspirer le virus dans la seringue, en prenant soin d’utiliser des pratiques de manipulation appropriées et des équipements de protection individuelle.

4. Anesthésie

1. Enregistrez le poids corporel de la souris avant la chirurgie.
2. Anesthésiez profondément la souris à l’aide d’isoflurane.
3. Assurez-vous que la souris est profondément anesthésique en effectuant un test de pincement des orteils jusqu’à ce que la réponse vacillante soit absente. Si l’animal continue de montrer de forts réflexes, augmentez la concentration et/ou la durée de l’anesthésie.
4. Appliquez une pommade pour les yeux sur chaque œil pour les garder humides pendant la chirurgie.
5. Rasez le cuir chevelu juste derrière les oreilles jusqu’à juste derrière les yeux avec une tondeuse à cheveux.
6. Fournissez à la souris un analgésique approuvé par l’IACUC.
7. Surveiller en permanence l’animal tout au long de l’intervention chirurgicale et fournir un soutien thermique.

5. Intervention chirurgicale

1. Placez la tête dans le porte-tête en plaçant les incisives supérieures dans l’espace de la barre de morsure, en vous assurant que la langue est en dessous de la barre de morsure.
2. Fixez la tête dans les barres auriculaires en insérant doucement les barres auriculaires dans le méat auditif externe, en veillant à ce que les barres auriculaires soient placées symétriquement (généralement entre trois et quatre pour une souris adulte). Cette étape est essentielle pour s’assurer que la tête est stable et centrée pour la rotation.
3. Préparer de manière aseptique la zone d’incision rasée avec trois gommages alternés de bétadine et d’alcool, ou avec une préparation alternative au site chirurgical approuvée par l’institution.
4. Placez un drap chirurgical sur l’animal pour maintenir un champ chirurgical stérile et réduire le risque d’infection postopératoire.
5. Exposez le crâne en faisant une incision le long de la ligne médiane sagittale du cuir chevelu. Grattez doucement la surface du crâne pour enlever tout fascia et exposer les sutures.
   REMARQUE: Si les lignes de suture sont difficiles à visualiser, le peroxyde d’hydrogène peut être appliqué sur le crâne à l’aide d’un applicateur stérile à pointe de coton pour améliorer la visualisation de la suture.
6. Placez la lunette de centrage dans le support et centrez le réticule sur bregma (Figure 4, panneau de gauche). 2 2000 le micromanipulateur.
7. Déplacez le réticule caudalement vers lambda, en notant la distance bregma-lambda (B-L).
   REMARQUE: Si les lignes de suture ne suivent pas une ligne droite le long de la ligne médiane, il est recommandé d’établir la ligne médiane en utilisant la « ligne de meilleur ajustement » à travers bregma et lambda. Cependant, si les étapes ci-dessus sont suivies, le placement initial du réticule de la lunette doit être à mi-chemin entre les barres auriculaires et se rapprocher de la suture de la ligne médiane B-L.
8. Si la distance B-L est significativement inférieure ou supérieure à 4,21 mm, ajuster progressivement la distance assignée pour obtenir une distance B-L de 4,21 mm ± 0,2 mm.
9. Remplacez l’étendue de centrage par l’indicateur d’alignement. Placez les sondes sur lambda et bregma et ajustez le bouton d’inclinaison dorsale sur le support de tête pour niveler dans le plan sagittal (nez tourné vers le haut ou vers le bas), puis utilisez la lunette de centrage pour réaffecter bregma.
10. Utilisez l’indicateur d’alignement pour niveler dans le plan coronal à l’aide du bouton d’inclinaison coronal. Mesurez en plusieurs points de l’axe rostral/caudal pour tenir compte des déformations de surface du crâne.
11. Notez la position sur le cadran du bouton d’inclinaison coronal, car il s’agit de la position de rotation de 0 °.

6. Alignement des axes centraux de rotation pour les coordonnées inclinées

1. Fixez la lunette de centrage dans le porte-outil et positionnez le micromanipulateur sur la coordonnée calculée de la section 1. Notez que la coordonnée R/L de l’implantation inclinée correspond à la longueur du côté A.
   1. Dans l’exemple de la figure 1, les coordonnées inclinées pour le placement de la fibre optique ciblant le VMN sont (A/P = -1,4, R/L = [2,03] à 0° de rotation coronale, [0,00] à rotation coronale de 15°, D/V = -5,4).
2. Repérage de la portée et marquage de cette coordonnée (R/L 2,03 mm à partir de la ligne médiane selon l’exemple VMN; Figure 4, panneau du milieu). Cette marque représente le point auquel la canule entrera dans le cerveau une fois la tête tournée.
3. Repositionnez le micromanipulateur sur la ligne médiane (R/L = 0,00). Utilisez le bouton d’inclinaison coronale pour faire pivoter la tête à l’angle calculé à la section 1.
   1. Si le réticule de la portée correspond déjà à la marque, passez à l’article 7.
   2. Si le réticule de la lunette ne s’aligne pas avec la marque de référence, ajustez la position de la tête dans l’axe z à l’aide du bouton de décalage vertical (Figure 2) jusqu’à ce que le réticule s’aligne le plus près possible de la marque.
4. Faites pivoter la tête vers la position coronale de 0°. Si le décalage vertical a été ajusté à l’étape 6.3, réaffectez bregma à l’aide de l’étendue de centrage.
5. Répétez les étapes 6.3 et 6.4 jusqu’à ce que le réticule atteigne systématiquement la marque de référence lorsque la tête est tournée (Figure 4C).
6. À ce stade, le point de rotation arbitraire établi dans la section 1 devrait maintenant être aligné sur le centre de rotation stéréotaxique.

7. Microinjection

1. Placez la perceuse stéréotaxique dans le support et manœuvrez le micromanipulateur jusqu’à la première coordonnée d’injection.
   1. Selon l’exemple de ciblage du VMN, forez à A/P = -1,4 et R/L = 0,4 pendant que la tête est de niveau.
2. Abaissez la perceuse jusqu’à ce que la mèche soit juste au-dessus du crâne. Allumez la perceuse et abaissez doucement jusqu’à ce que le foret vienne de percer le crâne (pas la dura).
3. Répétez l’opération pour le site d’injection controlatérale.
4. Utilisez un conducteur d’aiguille stérile pour introduire une courbure de 90 ° dans une aiguille de 27 à 30 G (par exemple, d’une seringue à insuline stérile de 0,5 mL) et utilisez l’aiguille pliée pour percer doucement la dure-mère.
5. REMARQUE: En cas de saignement, appliquez une pression avec un applicateur stérile à pointe de coton et nettoyez avec de l’eau stérile jusqu’à ce que le saignement ait cessé.
6. Lorsque vous êtes prêt à injecter, placez soigneusement une seringue Hamilton remplie dans le support stéréotaxique.
   REMARQUE : Les coordonnées du micromanipulateur ne s’appliquent plus après le passage à un nouvel outil. Utilisez le centre du trou de bavure comme nouvelle cible pour l’injection.
7. Positionnez soigneusement l’aiguille au-dessus du trou de bavure.
8. Abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle touche légèrement la dure-dure au centre du trou de bavure. CRITIQUE: Mettent à zéro le micromanipulateur uniquement dans l’axe z, de sorte que les coordonnées sur le micromanipulateur pour la lunette de centrage stéréotaxique et la perceuse soient maintenues.
9. Abaissez lentement l’aiguille dans le cerveau, en surveillant de près pour s’assurer que l’aiguille ne dévie pas sur le bord du trou de bavure. Continuer à abaisser jusqu’à 0,05 mm ventral à la coordonnée d’injection D/V et attendre 1 min. Cette étape supplémentaire crée une petite « poche » pour minimiser le reflux viral lors du retrait de l’aiguille.
10. Soulevez lentement l’aiguille jusqu’à la coordonnée D/V et commencez l’injection.
    REMARQUE : Le débit et le volume varient en fonction de la région cible et de la conception expérimentale. Pour le silençage optogénétique des neurones VMN, une couverture suffisante est souhaitée, de sorte que 200 nL de virus sont injectés à un taux de 1 nL / s.
11. Après la microinjection, attendez 10 minutes au site d’injection pour minimiser l’efflux du virus pendant le sevrage.
12. Retirez lentement la micropipette du cerveau à une vitesse approximative de 1 mm/min.
13. Une fois que l’aiguille est dégagée du crâne, éjectez un petit volume de virus pour vous assurer que l’aiguille ne s’est pas obstruée avec du sang ou des tissus. Utilisez un applicateur stérile à pointe de coton pour éliminer le virus avant de continuer.
14. Répétez les étapes 7.6 à 7.12 pour le côté controlatéral.
15. Scellez les trous de bavure de micro-injection avec de la cire d’os pour améliorer la cicatrisation (Figure 5B).

8. Implantation de fibres optiques

REMARQUE: Après l’injection virale, des canules bilatérales à fibres optiques sont implantées à l’angle calculé par section 1. Notez que ces coordonnées doivent déjà être marquées sur le crâne à partir de la section 6.

1. Répétez les étapes 7.1 à 7.4 pour les coordonnées inclinées.
2. Ressez la tête à la position de niveau 0°.
3. Ensuite, utilisez la perceuse à main pour produire quatre trous supplémentaires pour les vis osseuses: deux doivent être placés antérieurement et deux postérieurement (Figure 5A). Ceux-ci serviront d’ancrages pour fixer les fibres optiques au crâne(Figure 5D).
   REMARQUE: Assurez-vous d’espacer les trous suffisamment loin des trous de bavure à coordonnées inclinées pour accueillir la partie ferrule de la fibre optique qui se trouve au-dessus du crâne.
4. Aussi doucement que possible, utilisez le petit tournevis à tête plate pour régler les vis osseuses de manière à ce qu’elles restent fermement dans le crâne mais ne pénètrent pas dans le cerveau.
5. Serrez une canule à fibre optique dans le porte-canule et placez-la dans le support stéréotaxique.
6. Faites pivoter la tête à l’angle calculé, en notant à nouveau que les coordonnées du micromanipulateur ne s’appliquent pas au nouvel outil. Utilisez le centre des trous de bavure inclinés comme cible d’implantation.
7. Abaissez la fibre optique jusqu’à ce qu’elle touche simplement la dure-dure au centre du trou de bavure(Figure 5C). 2000 le micromanipulateur dans l’axe z, puis ralentissez lentement la fibre optique jusqu’à la coordonnée inclinée D/V (-5,4 selon l’exemple VMN).
8. Utilisez du gel cyanoacrylate pour connecter la férule à fibre optique aux vis d’ancrage ipsilatérales, puis appliquez un accélérant avec une pointe de micropipette (Figure 5D).
9. Une fois que le gel de cyanoacrylate a complètement durci, desserrez doucement le porte-canule et soulevez jusqu’à ce qu’il soit dégagé de la férule de fibre optique.
10. Répétez les étapes 8.5 à 8.9 pour la coordonnée angulaire controlatérale, puis nivelez la tête. Pour plus de sécurité, établissez une connexion supplémentaire entre les deux canules à fibres optiques inclinées avec le gel cyanoacrylate et l’accélérant(Figure 5D).
11. Préparez une petite quantité relativement mince de ciment dentaire. Appliquer sur la surface du crâne, en veillant à bien couvrir les vis d’ancrage et la base des canules à fibres optiques. Laissez suffisamment de ferrule propre pour l’accouplement ultérieur avec les câbles de raccordement à fibre optique.
12. Une fois le ciment sec, retirez la souris de l’appareil stéréotaxique.
13. Placez la souris dans une cage de récupération avec support thermique. Laissez-le récupérer et transférer dans la cage de la maison une fois qu’il apparaît alerte, mobile et qu’il est en toilettage.

9. Soins post-chirurgicaux

1. Surveillez les animaux quotidiennement pendant 3 jours après l’opération pour le comportement, la posture, l’activité et le toilettage, et tenez des registres de l’apport alimentaire et du poids corporel.
2. Si les animaux présentent des indicateurs généraux de douleur ou de mauvaise santé, consultez les services vétérinaires.
3. Accordez aux souris au moins 2 semaines pour la récupération et l’expression virale avant de commencer les études comportementales.

10. Optogénétique

1. Pour la réalisation des études optogénétiques, voir Sidor et al.⁸.
2. Valider l’expression virale et le placement des fibres à la fin des études.

Résultats

Ce protocole décrit une intervention chirurgicale pour effectuer des études optogénétiques afin d’interroger le rôle des neurones VMN hypothalamiques dans le contrôle glycémique⁹. La première utilisation a été une approche stéréotaxique standard (non inclinée) pour la microinjection bilatérale d’un virus inhibiteur de la channelrhodopsine au VMN. Bien qu’une approche inclinée convienne également, l’approche standard (non inclinée) a été choisie parce qu’elle est suffisante pour cibler la région du...

Discussion

Les progrès récents des neurosciences ont soutenu une compréhension et une compréhension avancées de l’activité et de la fonction des neurocircuits cérébraux. Cela comprend l’application de technologies optogénétiques et chimiogénétiques pour activer ou réduire au silence des populations neuronales discrètes et leurs sites de projection in vivo. Plus récemment, cela a inclus le développement d’indicateurs de calcium génétiquement codés (par exemple, GCaMP, RCaMP) et d’autres biocapteurs fluorométriques (par exemple, dopa...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Canules à fibre optique	Lentilles doriques	MFC_200/230-0.57_###_MF1.25_FLT	Personnalisable
Kopf Modèle 1900 Système d’alignement stéréotaxique	Kopf	Modèle 1900 Kopf Modèle 1900-51
Jauge de hauteur centrale	Kopf	Modèle 1900-51
Kopf Modèle 1905 Indicateur d’alignement	Kopf	Modèle 1905
Kopf Modèle 1911 Perceuse stéréotaxique		Kopf Modèle 1911
Kopf Modèle 1915 Lunette de centrage	Kopf	Modèle 1915
Kopf Modèle 1922 Barres d’oreille non rompantes à 60 degrés	Kopf	Modèle 1922
Kopf Modèle 1923-B Support de tête d’anesthésie à gaz de souris	Kopf	Modèle 1923-B
Kopf Modèle 1940 Micromanipulateur	Kopf	Modèle 1940
Micro4 Système de micro-injection	World Precision Instruments	--Vis
à os de souris	Plastiques Un	00-96 X 1/16
, virole de 1,25 mm	Thor Labs	XCL
Foret chirurgical	Cell Point Scientific	Ideal Micro Drill