Article de méthode

Étiquetage balistique des neurones pyramidaux dans les tranches de cerveau et dans la culture cellulaire primaire

DOI :

10.3791/60989

⸱

2 avril 2020

 ,  ,  , 
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons un protocole pour étiqueter et analyser les neurones pyramidaux, qui est essentiel pour évaluer les altérations morphologiques potentielles dans les neurones et les épines dendritiques qui peuvent sous-tendre les anomalies neurochimiques et comportementales.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il a été rapporté que la taille et la forme des épines dendritiques est liée à leur plasticité structurelle. Pour identifier la structure morphologique des neurones pyramidaux et des épines dendritiques, une technique d’étiquetage balistique peut être utilisée. Dans le protocole actuel, les neurones pyramidaux sont étiquetés avec le colorant DilC18(3) et analysés à l’aide d’un logiciel de reconstruction neuronale pour évaluer la morphologie neuronale et les épines dendritiques. Pour étudier la structure neuronale, l’analyse de branchement dendritique et l’analyse de Sholl sont exécutées, permettant aux chercheurs de tirer des inférences au sujet de la complexité de ramification dendritique et de la complexité neuronale d’arborescence, respectivement. L’évaluation des épines dendritiques est effectuée à l’aide d’un algorithme de classification assisté automatique faisant partie intégrante du logiciel de reconstruction, qui classe les épines en quatre catégories (c.-à-d. minces, champignons, stubby, filopode). De plus, trois autres paramètres (c.-à-d. longueur, diamètre de la tête et volume) sont également choisis pour évaluer les altérations de la morphologie de la colonne vertébrale dendritique. Pour valider le potentiel d’application large de la technique d’étiquetage balistique, les neurones pyramidaux de la culture cellulaire in vitro ont été étiquetés avec succès. Dans l’ensemble, la méthode d’étiquetage balistique est unique et utile pour visualiser les neurones dans différentes régions du cerveau chez les rats, ce qui, en combinaison avec un logiciel de reconstruction sophistiqué, permet aux chercheurs d’élucider les mécanismes possibles sous-jacents dysfonction neurocognitive.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En 2000, Gan et coll. ont décrit une technique d’étiquetage rapide pour les neurones individuels et les glia dans le système nerveux qui a combiné divers colorants lipophiles, permettant l’étiquetage simultané de nombreuses cellules du cerveau avec des couleurs différentes1,2. Plus récemment, une technique d’étiquetage balistique a été décrite par Seabold et coll.3 qui a introduit des colorants fluorescents (Dil) dans les neurones des tranches de cerveau. Technique polyvalente de coloration, l’étiquetage balistique est apprécié pour sa capacité à être utilisée chez plusieurs espèces animales et à travers un large éventail d’âges. En outre, il peut être combiné avec l’immunostaining pour identifier les sous-populations des cellules du cerveau3. Par rapport aux techniques traditionnelles (p. ex., l’imprégnation argentée Golgi-Cox, microinjection)4, l’étiquetage balistique offre l’occasion de distinguer plus clairement les caractéristiques morphologiques, y compris les épines dendritiques, une caractéristique essentielle pour tirer des inférences sur la complexité neuronale et la connectivité synaptique5.

Les neurones pyramidaux excitatoires sont caractérisés par un seul, grand dendrite apical, de multiples dendrites basales plus courtes, et des milliers d’épines dendritiques6. Les neurones pyramidaux se trouvent dans plusieurs régions du cerveau liées au traitement cognitif de l’ordre supérieur, y compris le cortex préfrontal (PFC) et l’hippocampe. Dans le PFC, les neurones pyramidaux sont observés dans les couches II/III et la couche V, chacun présentant une morphologie unique. Plus précisément, les neurones pyramidaux dans la couche II/III du PFC ont un dendrite apique plus court et moins de ramification que les neurones pyramidaux dans la couche V6. Dans l’hippocampe, les neurones pyramidaux sont situés dans les régions CA1 et CA3, chacun affichant des morphologies distinctes. Plus précisément, les neurones pyramidaux dans la région de CA1 présentent un dendrite apical plus distinctif, avec la branche se produisant plus loin de la soma, par rapport à la région de CA36.

Les épines dendritiques sur les neurones pyramidaux dans le PFC et l’hippocampe sont le site primaire des synapses excitatrices7. Les caractéristiques morphologiques des épines dendritiques, qui sont classiquement caractérisées en trois catégories primaires (c.-à-d. minces, trapues, ou champignons8), ont été liées à la taille de la synapse excitatrice9. Les épines minces, caractérisées par un long cou mince, une petite tête bulbeuse et de plus petites densités postsynaptiques, sont plus instables et développent des connexions plus faibles. Cependant, les épines de champignon, qui ont une tête de colonne vertébrale dendritique plus grande, sont identifiées pour former des connexions synaptiques plus fortes, un effet résultant de leur plus grande taille. En contraste net, les épines trapues sont dépourvues d’un cou de la colonne vertébrale, présentant un rapport de volume de la tête et du cou à peu près égal8. Dans l’hippocampe, des épines ramifiées peuvent également être observées, auquel cas la colonne vertébrale a plusieurs têtes qui émergent du même cou de la colonne vertébrale dendritique10. Par conséquent, les changements morphologiques des épines dendritiques pourraient refléter la fonctionnalité et la capacité structurelle. En outre, des études ont démontré que la taille et la forme des épines dendritiques se rapportent à leur plasticité structurelle, conduisant à l’idée que les petites épines sont impliquées dans l’apprentissage et l’attention, tandis que de plus grandes épines plus stables, sont impliqués dans des processus à long terme, y compris la mémoire11. En outre, la distribution des épines dendritiques le long de la dendrite peut être associée à la connectivité synaptique5,12.

Ainsi, le présent document méthodologique a trois objectifs: 1) Présenter notre protocole d’étiquetage balistique, qui a été utilisé avec un taux de réussite (c’est-à-dire, neurones répondant aux critères de sélection et approprié pour l’analyse) de 83,3%5,12,13 et à travers les régions du cerveau multiples (c.-à-d., PFC, noyau accumbens, hippocampe); 2) Démontrer la généralisation de la technique et son application aux neurones cultivés in vitro; 3) Détail de la méthodologie utilisée dans le logiciel de reconstruction neuronale et les inférences qui peuvent être tirées à partir de ces données.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les protocoles d’animaux ont été examinés et approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Caroline du Sud (numéro d’assurance fédéral : D16-00028).

1. Préparation de tubes de perles DiI/Tungsten

  1. Dissoudre 100 mg de polyvinylpyrrolidone (PVP) avec 10 ml de ddH2O. Vortex la solution PVP à la légère.
  2. Remplissez le tube avec la solution PVP (voir Tableau des matériaux) et laissez-le pendant 20 min. Ensuite, expulsez la solution PVP à l’autre extrémité de la tubulure à l’aide d’une seringue de 10 ml.
  3. Mélanger 170 mg de perles de microcarrier de tungstène avec 250 lil de chlorure de méthylène. Vortex la suspension de perle de tungstène à fond.
  4. Mélanger 6 mg de colorant lipophile DilC18(3) avec 300 lil de chlorure de méthylène. Vortex la solution de teinture DilC18(3) à fond.
    REMARQUE : Effectuez les étapes 1.3-1.4 dans un capot de fumée.
  5. Pipette 250 L de la suspension de perle de tungstène sur une glissière en verre. Attendez que la suspension soit sèche à l’air (3 min).
  6. Ajouter 300 L de solution de teinture DilC18(3) sur le dessus de la couche de suspension de perle de tungstène. Mélanger la solution de teinture DiIC18(3) et la suspension de perle de tungstène à fond avec une pointe de pipette et laisser sécher le mélange (3 min).
  7. Une fois séché, utiliser une lame de rasoir pour diviser le mélange en deux tubes de centrifugeuse de 1,5 mL. Remplir les tubes d’eau.
  8. Sonicate dans un bain d’eau (Amp I, 100%) jusqu’à consistance homogène (5 min). Assurez-vous que la pointe du sonicateur se trouve directement sur les tubes avec la suspension de perle.
  9. Mélanger les deux 1,5 ml de mélange homogénéisé dans un tube conique de 15 ml. Sonicate le mélange pour un autre 3 min.
  10. Dessiner le mélange de teinture de tungstène-DilC18(3) dans le tube enrobé de PVP à l’aide d’une seringue de 10 ml. Nourrir les tubes dans la station de préparation (voir Tableau des matériaux).
  11. Tourner pendant 1 min sur la station de préparation. Retirez soigneusement toute l’eau du tube à l’aide d’une seringue de 10 ml.
  12. Allumez le gaz azoté et ajustez le débit d’azote à environ 0,5 litre par minute (LPM), faites pivoter le tube dans la station de préparation et séchez avec de l’azote pendant 30 min.
  13. Retirer le tube de la station de préparation et couper en longueurs de 13 mm (correspondant à la taille de chargement de la cartouche) à l’aide d’un coupe-tubing. Gardez les longueurs de 13 mm dans les flacons scintillants dans l’obscurité.

2. Préparation des sections cérébrales

REMARQUE : Les rats mâles adultes F344/N étaient des rats de paire logés dans un environnement contrôlé sous un cycle clair:obscurité de 12/12 avec l’accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Tous les animaux ont été pris en charge à l’aide des lignes directrices établies par les National Institutes of Health dans le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

  1. Anesthésiez profondément les rats à l’aide de 5 % de sévoflurane.
  2. Passez à l’étape suivante lorsque les rats ne sont pas sensibles aux stimuli nocifs et les réflexes sont absents.
  3. Fixez le rat en position de supine à l’intérieur d’une hotte chimique.
  4. Faire une incision à travers la peau le long de la ligne médiane thoracique. Séparer le diaphragme et ouvrir la poitrine avec des ciseaux. Insérez une aiguille de 20 G et 25 mm dans le ventricule gauche.
  5. Couper immédiatement l’oreillette droite avec des ciseaux. Perfuse 50 mL de 100 mM PBS avec un débit de 5 ml/min. Perfuse 100 ml de paraformaldéhyde de 4 % tamponné dans 100 mM PBS.
  6. Retirez tout le cerveau du rat juste après la perfusion.
  7. Postfix le cerveau entier pendant 10 min avec 4% de paraformaldéhyde.
    REMARQUE : Ne pas postfixer dans 4% de paraformaldéhyde pendant plus de 30 minutes, car il affectera l’étiquetage.
  8. Couper 500 m d’épaisseur sections coronales à l’aide d’une matrice du cerveau de rat (voir Tableau des matériaux). Faire la première coupe et garder la lame en place. Faire une deuxième coupe à l’aide d’une deuxième lame et enlever verticalement la première lame, en gardant le tissu sur la surface de la lame.
  9. Placer les tranches de cerveau dans une plaque de 24 puits avec 1 ml de PBS de 100 mM dans chaque puits. Répétez ce processus jusqu’à ce que toutes les tranches aient été coupées.

3. Étiquetage et visualisation balistiques des sections cérébrales

  1. Retirez le PBS de chaque puits ciblé.
  2. Chargez la cartouche avec un morceau de tuyauterie de perles DiI/Tungsten et placez-la dans l’applicateur.
  3. Mettez un morceau de papier filtre entre deux écrans en maille. Connectez l’applicateur au tuyau d’hélium. Ajuster la pression de sortie de l’hélium à 90 livres par pouce carré (psi).
  4. Placez l’applicateur verticalement à la main au centre du puits ciblé à une distance de 1,5 cm entre l’échantillon et l’écran de maille. Feu le tuyau de perles DiI/Tungsten.
    REMARQUE: Assurez-vous de supprimer tous les PBS des puits ciblés avant le tournage.
  5. Chargez la cartouche avec le prochain tube de perles DiI/Tungsten. Tirer continuellement les perles DiI/Tungstène de la tuyauterie sur les tranches restantes.
  6. Remplissez la plaque de 24 puits de 100 mM de PBS. Laver avec 500 L de frais 100 mM de PBS 3x. Ne laissez pas les tranches se retourner pendant le lavage avec PBS.
  7. Ajouter 500 L de PBS frais de 100 mM et garder les tranches à 4 oC dans l’obscurité pendant 3 h.
  8. Transférer les tranches de cerveau sur des toboggans en verre à l’aide d’une brosse fine.
    REMARQUE : Trois sections cérébrales peuvent être transférées sur chaque lame de verre.
  9. Ajouter immédiatement 1 ml d’antifade à montage moyen sur chaque section. Placez un housse de 22 mm x 50 mm sur les sections du cerveau. Sécher les toboggans en verre dans l’obscurité pendant 2 jours.
  10. Allumez le système de microscope confocal et passez à un objectif de 60 degrés.
  11. Réglez le système de microscope confocal pour avoir un grossissement de 60 '(A/1.4, huile) et un intervalle Z-plan de 0.15 'm (taille de trou d’épingle 30 'm, rétro-projeté rayon de trou d’épingle 167 nm). Utilisez une longueur d’onde de 543 nm pour acquérir des images des neurones d’intérêt.
  12. Obtenez des images Z-stack pour le type de neurone ciblé basé sur les limites de la région du cerveau et les caractéristiques morphologiques des neurones.
    REMARQUE : Acquérir au moins trois images de chaque animal.

4. Utilisation de la méthodologie avec la culture cellulaire

  1. Isoler les neurones corticaux primaires des rats F344/N au premier jour postnatal en utilisant la méthodologie précédemmentrapportée 14.
  2. Culture principales neurones corticaux dans un plat de fond en verre de 35 mm pendant une semaine. Changer la moitié du milieu de culture avec le milieu de croissance de neurone frais au troisième jour après l’isolement. Laver le plat de fond de verre 2x avec 1 mL de 100 mM PBS.
  3. Fixer avec 4% de paraformaldéhyde pendant 15 minutes à température ambiante. Répétez les étapes 3.2-3.6 pour étiqueter balistiquement les cellules.
  4. Laver avec 1 mL de 100 mM PBS 3x. Ajouter 500 L de 100 mM frais de PBS et le garder à 4 oC dans l’obscurité pendant 3 h.
  5. Ajouter 200 L de milieu de montage d’antifade.
  6. Obtenez des images Z-stack pour chaque neurone ciblé en utilisant les paramètres de l’étape 3.10.

5. Analyse neuronale et quantification de la colonne vertébrale dendritique

  1. Neurones aveugles utilisant des numéros de code pour empêcher le biais d’expérimentateur.
  2. Établir des critères de sélection pour les neurones en fonction de la région cérébrale d’intérêt.
    REMARQUE : Les critères de sélection des neurones comprennent la coloration dendritique continue, le bas fond, l’absence de grappes de colorant à l’intérieur des cellules, la diffusion minimale du colorant DiI dans l’espace extracellulaire, la morphologie correcte des neurones pyramidaux(figure 1).
  3. Logiciel de reconstruction neuronale ouvert (Voir la vidéo ci-jointe 1).
  4. Chargez un fichier d’image en cliquant sur l’image «File Folder» dans le coin supérieur gauche.
  5. Cliquez sur "Soma" et marquez la sme des neurones sur l’image.
  6. Cliquez sur "Tree" et sélectionnez "User-Guided".
  7. Tracez toutes les branches d’intérêt dendritiques.
    REMARQUE : Pour les neurones pyramidaux, qui sont caractérisés par un dendrite apique et de multiples dendrites basilaires, seul le dendrite apique est tracé. Assurez-vous que toutes les branches de connexion sont attachées les unes aux autres.
  8. Cliquez sur "Spine".
  9. Définir les paramètres de détection et cliquez sur " Détectertous".
    REMARQUE : Pour les tranches de cerveau, les paramètres cohérents utilisés dans les régions du cerveau sont : 2,0 (outer Range), 0.3 (hauteur minimale), 100% (sensibilité de détecteur), et 10 (compte minimum). Pour la culture cellulaire, il est nécessaire d’augmenter la sensibilité au détecteur et de diminuer le nombre minimum.
  10. Classer les épines en sélectionnant «Classify All».
    REMARQUE : Les épines dendritiques sont classées à l’aide d’un algorithme faisant partie intégrante du logiciel de reconstruction neuronale15.
  11. Enregistrez le traçage en sélectionnant l’image de disque dans le coin supérieur gauche.
  12. Effectuez des analyses morphologiques neuronales et dendritiques de la colonne vertébrale.
    1. Logiciel d’analyse quantitative de reconstruction neuronale ouvert (Voir la vidéo ci-jointe 2).
    2. Chargez l’image en cliquant sur "File" et "Open Data File".
    3. Cliquez sur "Analyse" et "Analyse de structure ramifiée" pour analyser la morphologie neuronale et la morphologie de la colonne vertébrale dendritique.
    4. Pour la morphologie neuronale, cliquez sur "Tree Totals" et sélectionnez la case pour "Dendrite Totals".
    5. Pour la morphologie de la colonne vertébrale dendritique, cliquez sur "Spines" et sélectionnez ensuite la boîte pour "Spine Details".
    6. Enregistrez la sortie sous forme de fichier texte (.txt) en cliquant à droite sur la table de sortie et en sélectionnant «Enregistrer pour le fichier».
    7. Cliquez sur "Analyse" et "Analyse Sholl".
    8. Réglez le rayon de départ à 10 m et l’incrément de rayon à 10 m.
    9. Cliquez sur la case "Dendrites" et cliquez sur "Display".
    10. Enregistrez la sortie sous forme de fichier texte (.txt) en cliquant à droite sur la table de sortie et en sélectionnant « Enregistrer pour lefichier».

6. Analyse des données

  1. Analyser les données de morphologie neuronale (c.-à-d. complexité de branchement dendritique).
    1. Ajoutez le nombre de dendrites à chaque ordre de branche et divisez par le nombre total de dendrites. Multipliez par 100 pour calculer les fréquences relatives pour le nombre de dendrites à chaque commande de branche.
  2. Analyser les données d’analyse Sholl pour examiner la complexité neuronale de l’arborescence et la connectivité de la colonne vertébrale dendritique.
    1. Calculez l’erreur moyenne et standard de la moyenne pour le nombre d’intersections à chaque rayon.
    2. Résumez le nombre d’épines dépendantes du type de colonne vertébrale (c.-à-d. mince, trapue, champignon) à chaque rayon et divisez par le nombre total d’épines pour ce type de colonne vertébrale. Multipliez par 100 pour calculer les fréquences relatives pour le nombre d’épines à chaque rayon.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans la figure 2A, les neurones pyramidaux typiques dans la région hippocampique dans les sections du cerveau de rat ont été identifiés par la technologie d’étiquetage balistique, caractérisée par un grand dendrite apical et plusieurs dendrites basales plus petites autour du soma. La figure 2B montre le neurone dans le logiciel d’analyse quantitative de reconstruction neuronale après que le soma ait été détecté, des branches dendritiques ont été tracées, et des ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans ce protocole, nous décrivons une technique d’étiquetage polyvalente pour les neurones du cerveau de rat et ceux cultivés in vitro. En outre, nous rapportons la méthodologie pour utiliser le logiciel de reconstruction neuronale et le logiciel d’analyse quantitative de reconstruction neuronale pour évaluer la morphologie neuronale et les épines dendritiques. L’évaluation de la morphologie neuronale et des épines dendritiques fournit une occasion de déterminer des altérations dans la complexité de ramification dendriti...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aucun des auteurs n’a de conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été financé par les subventions des NIH HD043680, MH106392, DA013137 et NS100624.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
20Gx25mm Aiguille PrecisionGlideBD305175
Plaque de culture cellulaire 24 puitsCostar3562
35 mm Plats à fond de verreMatTek CorporationP35G-1.5-20-C
Solution antibiotique-antimycosiqueCellgro30004CI100X
B-27 supplémentLife Technologies17504-04450X
Doublure de canonBIO-RAD165-2417
BoraxSigmaB9876
Acide boriqueSigmaB0252
Porte-cartoucheBIO-RAD165-2426
Logiciel d’imagerie confocaleNikonEZ-C1version 3.81b
Microscope confocalNikonTE-2000E
Couvercle verreVWR637-137
DilC18(3)Fisher ScientificD282
DMEM/F12 mediumLife Technologies10565-018
Dumont #5 ForcepsWorld Precision Instruments14095
Dumont #7 ForcepsWorld Precision Instruments14097
F344 rat(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)
GlucoseVWR101174Y
GlutaMaxLife Technologies35050-061100X
HBSSSigmaH464110X
Écrans de diffusion HeliosBIO-RAD165-2475
Kit de pistolet à gènes HeliosBIO-RAD165-2411
Système de pistolet à gènes HeliosBIO-RAD165-2431
Tuyau d’héliumBIO-RAD165-2412
Pince à irisWorld Precision Instruments15914
Ciseaux à irisWorld Precision Instruments500216
Chlorure de méthylèneFisher ScientificD150-1
Neurobasal mediumLife Technologies21103-049
Neurolucida 360 softwarembf bioscienceanalyse dendritique de la colonne
vertébrale ParaformaldéhydeSigma-Aldrich158127-500G
ParaformaldéhydeSigmaP6148
Poly-L-LysineSigmaP9155
PolyvinylpyrrolidoneFisher Scientific5295
Réactif anti-décoloration ProLong GoldFisher ScientificP36930support de montage
Matrice de cerveau de rat, 300 - 600g, coronale, 0,5 mmTed Pella15047
SevofluraneMerritt Veterinary Supply347075
Bicarbonate de sodiumLife Technologies25080
SuperFrost Plus LamesFisher Scientific12-550-154 %
Kitde seringueBIO-RAD165-2421
Tube en tefzelBIO-RAD165-2441
Trypsine-EDTALife Technologies15400-054
Coupe-tubeBIO-RAD165-2422
Station de préparation de tubesBIO-RAD165-2418
Tungstène M-25 Microcarrier 1.7 µ ; mBIO-RAD165-2269
Vannas CiseauxWorld Instrumentsde précision 500086

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations. Neuron. 27, 219-225 (2000).
  2. Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system. Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202(2009).
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  4. Spacek, J. Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections. Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).
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  14. Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (108), e53697(2016).
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Mots-clés

pines dendritiquesreconstruction neuronaleanalyse de Shollmicroscopie confocalecolorant DiI C18 3billes microporteuses de tungst ne

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