Protocole d’imagerie et de caractérisation de Terahertz pour les tumeurs fraîchement excisées du cancer du sein

L’imagerie et la spectroscopie de Terahertz (THz) ont connu une croissance rapide au cours de la dernière décennie. Le développement continu d’émetteurs THz plus efficaces et plus cohérents de l’ordre de 0,1 à 4 THz a fait croître leurs applications de manière significative^{de 1}. Un domaine où THz a montré la promesse et la croissance significative est le domaine biomédical². Le rayonnement THz s’est avéré non ionisant et biologiquement sûr aux niveaux de puissance généralement utilisés pour analyser les tissus fixes³. En conséquence, l’imagerie et la spectroscopie THz a été utilisée pour classer et différencier diverses caractéristiques tissulaires telles que la teneur en eau pour indiquer les dommages causés par la brûlure et la guérison⁴, la cirrhose du foie⁵, et le cancer dans les tissus excisés^6,7. L’évaluation du cancer en particulier couvre un large éventail d’applications cliniques et chirurgicales potentielles, et a été étudiée pour les cancers du cerveau⁸, foie⁹, ovaires¹⁰, tractus gastro-intestinal¹¹, et sein^{7,12,13,14,15,16,17,18,19}.

Les applications de THz pour le cancer du sein sont principalement axées sur le soutien de la chirurgie de conservation du sein, ou tumorectomie, par l’évaluation de marge. L’objectif d’une tumorectomie est d’enlever la tumeur et une petite couche de tissu sain environnant, contrairement à la mastectomie complète, qui enlève le sein entier. La marge chirurgicale du tissu excisé est ensuite évaluée par pathologie une fois que l’échantillon a été fixé en formaline, sectionné, incorporé dans la paraffine, et monté en tranches de 4 m à 5 m sur des lames de microscope. Ce processus peut prendre beaucoup de temps et nécessite une intervention chirurgicale secondaire à une date ultérieure si une marge positive est observée²⁰. Les lignes directrices actuelles de l’American Society of Radiation Oncology définissent cette marge positive comme ayant des cellules cancéreuses contactant l’encre de marge de surface²¹. L’imagerie THz pour le tissu hydraté à forte absorption est principalement limitée à l’imagerie de surface avec une certaine pénétration variable basée sur le type de tissu, qui est suffisante pour répondre aux besoins chirurgicaux de l’évaluation rapide de la marge. Une analyse rapide des conditions de marge pendant le réglage chirurgical diminuerait considérablement les coûts chirurgicaux et le taux de procédure de suivi. À ce jour, THz s’est avéré efficace en différenciant entre le cancer et les tissus sains dans les tissus formalisés, paraffin-embeddeds (FFPE), mais une étude supplémentaire est nécessaire pour fournir une détection fiable du cancer dans les tissus fraîchement excisés⁷.

Ce protocole détaille les étapes d’exécution de l’imagerie et de la spectroscopie THz sur des échantillons de tissus humains fraîchement excisés prélevés sur une biobanque. Les applications THz construites sur des tissus du cancer du sein humain fraîchement excisés ont rarement été utilisées dans la recherche publiée^7,18,22,23, en particulier par des groupes de recherche non intégrés à un hôpital. L’utilisation de tissus fraîchement excisés est également rare pour d’autres applications de cancer, avec la plupart des exemples de cancer humain non-sein étant rapportés pour le cancer du côlon^24,25. L’une des raisons en est que les blocs de tissus FFPE sont beaucoup plus faciles d’accès et de manipulation que les tissus fraîchement excisés à moins que le système THz utilisé pour l’étude fasse partie du flux de travail chirurgical. De même, la plupart des systèmes THz de laboratoire commercial ne sont pas préparés à manipuler les tissus frais, et ceux qui le font sont encore dans les étapes de l’utilisation de la croissance de la lignée cellulaire ou ont seulement commencé à regarder les tissus excisés à partir de modèles animaux. Pour appliquer THz à un paramètre peropératoire nécessite que des étapes d’imagerie et de caractérisation soient développées à l’avance pour les tissus frais afin que l’analyse n’interfère pas avec la capacité d’effectuer une pathologie standard. Pour les applications qui ne sont pas intrinsèquement destinées à être peropératoires, la caractérisation des tissus frais est encore une étape difficile qui doit être abordée pour travailler vers des applications in vivo et la différenciation.

L’objectif de ce travail est de fournir une ligne directrice pour l’application THz pour les tissus fraîchement excisés à l’aide d’un système commercial THz. Le protocole a été développé sur un système d’imagerie et de spectroscopie THz²⁶ pour les tumeurs murines de cancer du sein^13,17,19 et a été étendu au tissu chirurgical humain obtenu des biobanques^7,18. Tandis que le protocole a été généré pour le cancer du sein, les mêmes concepts peuvent être appliqués aux systèmes semblables d’imagerie de THz et d’autres types de cancers de tumeur solide qui sont traités avec la chirurgie où le succès dépend de l’évaluation de marge^27. En raison d’une quantité assez faible de résultats publiés THz sur les tissus fraîchement excisés, c’est le premier travail à la connaissance des auteurs de se concentrer sur le protocole de manipulation des tissus frais pour l’imagerie THz et la caractérisation.

Ce protocole suit toutes les exigences établies par le département de la santé et de la sécurité environnementales de l’Université de l’Arkansas.

1. Mettre en place la zone de manutention des tissus

1. Prenez un plateau en métal en acier inoxydable et couvrez-le avec le sac biorisque comme le montre la figure 1. Toute manipulation des tissus biologiques sera effectuée dans la zone du plateau (c.-à-d. la zone de manipulation des tissus).
2. Préparer des pinces de laboratoire, des lingettes de tissu, des essuie-tout, un pack de papier filtre, des bouteilles de teinture de tissu, une bouteille d’eau de Javel et une bouteille d’éthanol autour du plateau pour un accès facile au besoin. Gardez tous les tissus usagés, les lingettes et les gants sur la surface du matériau biorisque pour éliminer à la fin du protocole.
3. Remplissez un tube de centrifugeuse de 50 ml avec jusqu’à 45 ml de formaline tampon neutre de 10 % et placez-le dans le plateau de stockage des centrifugeuses près du plateau de manutention des tissus.

Figure 1 : Configuration de la zone de manipulation des tissus. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

2. Manipulation de tumeur fraîche de cancer du sein pour la spectroscopie de transmission de THz

CAUTION: Avant de manipuler des tissus vivants, mettez des gants nitrile, des lunettes de protection oculaire, un masque facial et une blouse de laboratoire. Utilisez toujours des pinces de laboratoire pour manipuler les tissus et évitez de les toucher directement avec les mains. Tous les travaux avec du tissu frais à l’extérieur d’un contenant scellé ou de l’étape de balayage devraient être effectués à la zone de manipulation des tissus établie à l’étape 1.1.

REMARQUE: Tous les tissus manipulés dans ce travail ont été expédiés dans le milieu de l’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco et la solution antibiotique de la biobanque.

1. Retirez la tumeur en vrac de la solution DMEM et placez-la dans un plat Petri sur la zone de manipulation des tissus (voir la figure 2A).
2. De l’inspection brute, identifier les régions tumorales distinctes à partir desquelles trancher de petits morceaux pour la caractérisation de transmission. Couper un segment de 0,5 mm d’épaisseur de tumeur des points identifiés à l’aide d’une lame de profil bas en acier inoxydable, comme le montre la figure 2B. Placez cette section tranchée entre deux fenêtres à quartz avec un espaceur de 0,1 mm d’épaisseur dans un porte-échantillons liquides, comme le montre la figure 2C.

Figure 2 : Section tumorale pour les mesures de spectroscopie de transmission de THz. (A) Photographie de la tumeur en vrac. (B) Photographie des petites sections (0.5 mm) de la tumeur coupée de la tumeur en vrac. (C) La section de tumeur tranchée placée dans le support d’échantillon liquide entre les deux fenêtres de quartz avec un espaceur de polytetrafluoroethylène de 0.1 mm pour la mesure de spectroscopie. Figure republiée de T. Bowman et coll.¹⁸ avec la permission de SPIE. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

3. Mesures de spectroscopie de transmission THz

1. Réglez le module de spectroscopie de transmission à l’intérieur de la chambre centrale de THz en alignant les poignées du module sur les poteaux de montage du système central et en faisant glisser l’étape vers le bas dans le système. Resserrer les deux vis de montage en haut à droite et en bas à gauche du module comme le montre la figure 3A.
2. Purger le système avec du gaz azoté sec à 5 L/min (LPM) pendant toute la procédure de spectroscopie pour enlever la vapeur d’eau de l’espace de l’échantillon.
3. Ouvrez le logiciel de mesure de la spectroscopie de transmission THz à partir du bureau connecté au système THz. Il ouvrira la fenêtre principale.
4. Cliquez sur l’onglet Scan en haut de la fenêtre. Une fenêtre Spectra Scan Setup apparaîtra. Du menu de baisse de l’onglet Mode De mesure en haut à droite de la fenêtre, sélectionnez Transmission pour configurer la spectroscopie de transmission. Si le pic n’est pas automatiquement visible, vérifiez l’option Enable sous l’onglet Manual Peak Search et étapez manuellement le délai optique pour mettre le pic en vue.
5. Après 30 minutes de purge, enregistrez un signal de référence de l’air en suivant les étapes ci-dessous.
   1. Sous l’onglet Paramètres de balayage dans la fenêtre de configuration de balayage des spectres, entrez un nom approprié pour le fichier de référence, définissez Num Scans à 1 800, et définissez le délai de démarrage (s) à 0. Laissez les autres paramètres comme valeurs par défaut.
   2. Cliquez sur La référence de mesure dans la fenêtre de configuration d’analyse pour prendre la mesure de référence de l’air. Cliquez ensuite sur l’échantillon de mesure pour mesurer le signal de transmission par l’air comme un échantillon moyen de 1 800 signaux sur 1 min.

Figure 3 : Configuration du module de spectroscopie de transmission THz. (A) Chambre centrale THz avec le module de transmission monté sur elle. (B) Une photographie du porte-échantillons liquides. (C) Le porte-échantillon placé à l’intérieur de la chambre centrale pour les mesures. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

6. Mesurer les deux fenêtres de quartz dans le porte-échantillons liquides comme le montre la figure 3B.
   1. Placez les deux fenêtres de quartz dans le porte-échantillons liquides sans espacer entre les deux.
   2. Ouvrez la chambre centrale de THz. Monter le porte-échantillons liquides sur le module de spectroscopie de transmission, comme le montre la figure 3C. Fermez la chambre.
   3. Cliquez sur l’onglet Scan sur la fenêtre principale. Répétez les étapes 3.5.1-3.5.2 pourl’échantillonde quartz, mais mettez à jour Le délai de démarrage ( s ) à 900. Cela laisse le temps de purger toute vapeur d’eau avant la mesure.
   4. Si le quartz est souhaité comme référence pour des échantillons supplémentaires, cliquez sur l’onglet Clear Reference sous les Paramètres d’analyse. Cela efface la référence de l’air. Cliquez ensuite sur l’onglet De référence de mesure pour enregistrer les mesures de quartz comme nouvelle référence.
7. Placez la section de tumeur tranchée entre les deux fenêtres de quartz à l’intérieur du support d’échantillon liquide et placez le support à l’intérieur de la chambre pour une mesure de transmission à un seul point du tissu. Pour enregistrer la mesure, répétez l’étape 3.6.3.
8. Retirez le porte-échantillons liquides de la chambre lorsque les mesures sont terminées et amenez-le à la zone désignée pour la manipulation des tissus. Démonter le porte-échantillons liquides, essuyer la section tumorale des fenêtres de quartz avec les lingettes de tissu, et placer les lingettes de tissu utilisées dans le même plateau pour disposer dans le sac biorisque avec les autres déchets biorisques.
9. Répétez les étapes 2.2, 3.7, et 3.8 comme nécessaire pour caractériser des tranches de tumeur supplémentaires. Lorsque les mesures sont terminées, rendez-vous sur la fenêtre principale et cliquez sur l’onglet Fichier pour enregistrer les données de mesure. Fermez la fenêtre logicielle.

4. Manipulation de tumeur fraîche de cancer du sein pour l’imagerie de mode de réflexion de THz

1. Retirez l’échantillon de tumeur fraîche de la solution DMEM et antibiotiques et placez-le sur un plat Petri. En utilisant l’inspection brute, sélectionnez un côté de la tumeur à l’image qui est suffisamment plat et a peu de sang et peu de vaisseaux sanguins. Évitez les tissus d’imagerie avec du sang ou des vaisseaux sanguins si possible.
2. Placez la tumeur avec le côté pour être photographié sur le papier filtre de grade 1 pour sécher l’excès de DMEM et effacer le tissu du liquide ou des sécrétions de la tumeur, comme indiqué dans la figure 4A. Repositionner la tumeur sur le papier filtre à un endroit sec pendant que le papier sature. Séchez la tumeur pendant 5 min.

Figure 4 : Préparation fraîche d’échantillon de tumeur pour l’imagerie de THz. (A) Tumeur placée sur du papier filtre pour sécher. (B) Tumeur placée sur la plaque de polystyrène au-dessus de la fenêtre d’imagerie avec des tampons d’essuyage de tissu pour absorber l’excès de fluides. (C) Tumeur vue d’en bas pour suivre l’orientation et vérifier les bulles d’air. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

3. Démonter le module de spectroscopie de transmission et définir la base miroir du module d’imagerie de réflexion (RIM) sur le système de base de THz, comme le montre la figure 5A. Lors de la mise des miroirs, monter le stade de balayage RIM au-dessus de la base miroir et le visser dans le système de base (voir figure 5B).
4. Purger le système avec du gaz azoté sec à 5 LPM pendant 30 minutes avant la procédure d’imagerie pour enlever la vapeur d’eau du compartiment de l’échantillon. Après 30 min, réduisez la quantité de gaz azoté sec à 3 LPM pour le reste du temps que le système est utilisé.
5. Placez une plaque d’épaisseur en polystyrène de 1,2 mm sur la fenêtre de balayage du diamètre de 37 mm. Centre de la fenêtre de balayage avec la plaque de polystyrène sur l’étape de l’échantillon.

Figure 5 : Configuration du système pour l’imagerie de réflexion. (A) Base miroir module d’imagerie de réflexion. (B) Étape de numérisation. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

REMARQUE: D’autres épaisseurs et matériaux de plaque conviennent à l’étape 4.5 mais devraient avoir une épaisseur uniforme et être d’absorption assez faible pour ne pas entraver le signal de THz.

6. Ouvrez le logiciel de mesure d’imagerie de réflexion THz à partir du bureau connecté au système THz. Une fenêtre apparaîtra montrant plusieurs icônes de dialogue pour des fonctions spécifiques et deux sous-ensemble pour les parcelles de champ THz, (unités arbitraires a.u.) contre le temps et la fréquence, respectivement.
7. Pour définir les paramètres de la configuration RIM, cliquez sur l’icône Du dialogue de paramètres d’image en haut de la fenêtre. Une fenêtre paramètres d’acquisition d’images apparaîtra. Sélectionnez RIM dans le menu de dépôt de l’onglet Template pour l’imagerie de réflexion mis en place. Frappez OK et retournez à la fenêtre principale du logiciel.
8. Sur la fenêtre principale, cliquez sur l’icône Scan à points fixes. Cela activera les antennes THz pour commencer à envoyer le signal THz incident et de recevoir le signal THz réfléchi à partir d’un seul point sur la plaque de polystyrène.
9. Cliquez sur l’icône Motor Stage Dialog sur le haut de la fenêtre principale. La fenêtre de commande du moteur s’ouvrira. Ajustez l’axe de retard optique en cliquant sur les flèches de direction avant/inverse pour centrer l’impulsion réfléchie du polystyrène dans la fenêtre principale.
   REMARQUE: Après ajustement de l’axe de retard optique, deux impulsions doivent apparaître sur la fenêtre, comme le montre la figure 6: l’une à partir de l’interface inférieure de la plaque de polystyrène (réflexion primaire), et l’autre de l’interface supérieure de la plaque de polystyrène (réflexion secondaire).
10. Fenêtre sur la réflexion primaire de la plaque de polystyrène et garder la réflexion secondaire dans la fenêtre, qui contribuera aux réflexions du tissu pendant la procédure d’imagerie. Cela se fait en deux étapes.
    1. Tout d’abord, cliquez sur le bouton Paramètres DAQ en haut de la fenêtre principale pour ouvrir la fenêtre de dialogue des paramètres DAQ. Changez la valeur de retard optique de 5 V (par défaut) à 4 V.
    2. Deuxièmement, ajustez la position verticale de l’étape de balayage avec l’échelle de micromètre sur l’étape de balayage jusqu’à ce que le minima de l’impulsion secondaire soit le plus fort. Ajuster le retard optique de l’axe dans la fenêtre de contrôle moteur pour mettre la réflexion primaire en dehors de la portée du signal réfléchi mesuré.
       REMARQUE: Pour une plaque de polystyrène de 1,2 mm d’épaisseur, la réflexion primaire est fenêtreée lorsque le pic minimum de réflexion secondaire est d’environ -0,3 mm sur l’axe de retard optique de la fenêtre de domaine temporel.

Figure 6 : Réflexions THz des interfaces inférieures et supérieures de la plaque de polystyrène. (A) THz signal incident à et réfléchi à partir d’une plaque de polystyrène de 1,2 mm d’épaisseur. (B) Mesuré primaire et secondaire signaux de domaine temporel THz du polystyrène. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

11. Niveler l’étape de l’échantillon et enregistrer le signal de référence.
    1. Sélectionnez deux points sur chaque axe (axe A et axe B) qui dénotent des emplacements sur la plaque de polystyrène près du bord de la fenêtre de l’échantillon. Par exemple, pour l’axe A allant de -15 mm à 15 mm, les deux points de position peuvent être de -10 mm et 10 mm; et pour l’axe B allant de -15 mm à 15 mm, les deux points de position peuvent être de -10 mm et 10 mm.
    2. Cliquez sur le bouton Motor Control Dialog pour ouvrir la fenêtre de commande du moteur. Repositionner la fenêtre de commande du moteur et la fenêtre logicielle principale de sorte que le signal du domaine temporel soit visible tout en ajustant les positions du moteur. Réglez à 0 mm l’axe A et l’axe B.
    3. Niveler l’axe A à l’aide des étapes suivantes. Une portée de -10 mm à 10 mm est utilisée à titre d’exemple.
    4. Dans la fenêtre de contrôle moteur, changer la valeur de l’axe A de 0 à -10 et frapper Enter. L’étape se déplace vers la position de -10 mm sur l’axe A et un changement dans la position du signal sur la fenêtre principale est observé.
    5. Utilisez l’échelle de micromètre réglable sur l’étape de numérisation indiquée dans la figure 5B pour ramener le pic minimum du signal à la position fixée à l’étape 4.10.2.
    6. Modifiez la valeur de l’axe A à 10 euros et appuyez sur l’entrée. L’étape va maintenant passer de la position de -10 mm à la position de 10 mm sur l’axe A et un changement dans le signal est observé à nouveau. Notez la direction et la distance que le signal a déplacé de sa position précédente et de changer la valeur A-axe à nouveau à -10. Le signal reviendra à la position fixée dans l’étape 4.11.5.
    7. Faites pivoter la vis de nivellement sur l’axe A de l’étape de balayage, comme le montre la figure 5B et déplacez le signal pour doubler la distance dans la même direction qu’elle s’est déplacée de la position d’origine. Utilisez le micromètre sur l’étape de balayage pour déplacer le signal vers la position d’origine (-0,3 mm pour 1,2 mm de polystyrène).
    8. Les étapes de répétition 4.11.6-4.11.7 jusqu’à ce que le signal à 10 et -10 sont égaux et le pic pour les deux positions est concentré à la position d’origine (-0,3 mm sur l’axe optique).
12. Une fois le nivellement de l’axe A atteint, modifiez la valeur de l’axe A à 0 et répétez la même procédure pour l’axe B. Commencez par changer la valeur de l’axe B sur la fenêtre de commande du moteur de 0 à la valeur la plus positive (par exemple 10 mm). En outre, tout en nivellement, utilisez la vis de nivellement sur l’axe B de l’étape de numérisation, qui est indiqué dans la figure 5B.
13. Une fois que les deux axes sont nivelés, retournez à la fois l’axe A et l’axe B à 0 mm. Fermez la fenêtre de contrôle moteur et vérifiez que le signal est dans sa position d’origine au cas où il serait un peu décalé.
14. Enregistrez ce signal comme référence.
    1. Rendez-vous à la fenêtre DAQ Properties. Changez la valeur moyenne à 5 et conservez tous les autres paramètres en tant que défaut.
    2. Cliquez sur Nouvelle Référence. Le compteur moyen en haut à droite de la fenêtre comptera de 0 à 20. Une fois que le compteur atteint 20, changer la valeur moyenne à 1 et cliquez sur OK. Le signal réfléchi du polystyrène sera enregistré comme référence pour toutes les analyses prises plus tard.
       REMARQUE : Si seulement la procédure d’imagerie de THz doit être exécutée, alors il est préférable d’effectuer des étapes 4.3-4.14 avant de prendre le tissu de tumeur hors de la solution DMEM.
15. Montez la tumeur sur la plaque de polystyrène couvrant la fenêtre de scène de balayage.
    1. Retirez la fenêtre d’imagerie de l’étape de balayage et apportez-la à la zone de manipulation des tissus. Placez la tumeur sur une plaque de polystyrène, comme le montre la figure 4B.
    2. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air significatives entre la plaque et la tumeur. Si des bulles d’air sont observées, appuyez sur la tumeur avec des pincettes ou soulevez la tumeur et roulez-la doucement sur le polystyrène jusqu’à ce que les trous d’air soient réduits au minimum.
    3. Placez les épicateurs absorptifs à intervalles réguliers autour de l’échantillon d’essai tel que indiqué dans la figure 4B. Placez une autre plaque de polystyrène au-dessus de la tumeur et appuyez doucement afin de rendre la surface de tumeur aussi plate que possible. Tapissez cet arrangement polystyrène-tumorale-polystyrène sur la fenêtre de l’échantillon.
16. Retournez la fenêtre de l’échantillon comme indiqué dans la figure 4C, et prenez des photos de la tumeur pour tenir un registre de son orientation. Remettre la fenêtre de l’échantillon avec la tumeur à l’étape de balayage.
17. Cliquez sur le bouton De dialogue de paramètres d’image pour ouvrir la fenêtre paramètres d’acquisition d’images. Définir les valeurs de Axis1min, Axis1max, Axis2min, et Axis2max pour bien renfermer la position de la tumeur dans la fenêtre d’imagerie
    REMARQUE: Par défaut, Axis1 est l’axe A et Axis2 est l’axe B.
18. Définissez Axis1step et Axis2step à 0,2 mm pour l’analyse d’imagerie.
    REMARQUE : La configuration du step Axis1 et de l’Axis2step définira la taille de l’étape des moteurs stepper à 200 m par incréments au cours du processus de numérisation. Le temps total d’analyse peut être estimé dans la fenêtre paramètres d’acquisition d’images.
19. Cliquez sur l’onglet Mesurer sur la fenêtre principale et sélectionnez l’option Flyback 2D Scan. Dans la fenêtre qui apparaît, indiquez l’annuaire et le nom de fichier sous lequel enregistrer les données d’analyse.

5. Post-traitement du tissu frais en préparation de la procédure d’histopathologie

1. À la fin du processus de numérisation, retirez la fenêtre de l’échantillon, les plaques de polystyrène et échantillonnez du système THz de base et déplacez-les vers la zone désignée pour les déchets dangereux. Retirez la tumeur de la plaque de polystyrène et placez-la sur un morceau plat de carton d’une taille comparable à celle de la tumeur. Assurez-vous que l’orientation de la tumeur est la même que sur le polystyrène, avec le visage d’imagerie touchant le carton.
2. Trempez un coton-tige dans la teinture de tissu rouge et tachez le côté gauche de la tumeur jusqu’à l’endroit où le bord de la tumeur contacte le carton. De même, tacher le côté droit de la tumeur avec la teinture bleue de tissu. Tacher la surface exposée de la tumeur avec une ligne de colorant jaune de tissu reliant la tache rouge à la tache bleue pour désigner le dos de l’échantillon, comme indiqué dans la figure 7A.
   REMARQUE: Pour empêcher l’encre de colorer la solution de formaline, appliquez seulement une fine couche sur le tissu. Ceci peut être accompli en tamponnant le coton-tige sur une surface différente avant de tacher le tissu ou d’utiliser un coton-tige propre pour essuyer n’importe quel colorant excessif. Évitez de laisser le colorant entrer en contact avec la peau ou les vêtements. Ce processus de coloration de tumeur est mené comme référence pour fournir l’information sur le côté image de la tumeur et son orientation au pathologiste.

Figure 7 : Post traitement sur la tumeur après imagerie de THz. (A) Tumeur placée face contre terre sur le support en carton et teint avec du colorant de marquage de tissu. (B) Papier filtre placé sur la tumeur et scotché pour maintenir le contact. (C) Tumeur tachetée fixée sur le carton immergé dans la solution de formaline tamponnée neutre de 10% et scellée avec le parafilm. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

3. Laisser sécher l’encre pendant environ 3 à 4 min. Couper un morceau de papier filtre avec les mêmes dimensions approximatives que le carton. Placez-le sur la tumeur et enveloppez un morceau de ruban adhésif complètement autour du papier filtre et du carton comme le montre la figure 7B. Le ruban adhésif et le papier filtre doivent fixer la tumeur contre le carton sans appliquer de pression significative.
4. Immerger le tissu taché apposé sur le carton dans une solution de formaline tamponnée neutre à 10 % et sceller le tube de centrifugeuse à l’aide d’un film de paraffine, comme le montre la figure 7C. Désignez le numéro d’échantillon, la date, le type de tissu et le numéro de tumeur pour l’échantillon sur l’étiquette de tube. Envoyez la tumeur au pathologiste pour plus de traitement de l’histopathologie.

6. Élimination des déchets dangereux

1. Recueillir tous les déchets du plateau de manipulation des tissus avec le sac biorisque utilisé pour couvrir le plateau et le mettre dans un nouveau sac biorisque, comme le montre la figure 8. Apportez le sac à la zone de déchets biorisques désignée dans le bâtiment et prenez rendez-vous avec le département de la santé et de la sécurité environnementales (EH et S) pour le ramassage des déchets. Nettoyez le plateau de manipulation des tissus et les environs sur la table avec une solution d’eau de Javel de 10 % et de l’éthanol.

Figure 8 : Photographie du sac à déchets biorisque. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

2. Prenez le porte-échantillons liquides avec les espaceurs et les fenêtres de quartz, fenêtre d’échantillonnage sur laquelle la tumeur a été montée, plaques de polystyrène, et pinces de laboratoire à la zone de lavage. Rincer tous les matériaux avec de l’eau, puis 10% solution d’eau de Javel, essuyant avec des essuie-tout au besoin pour enlever les débris de tissu. Rincer à nouveau avec de l’eau, frotter avec la solution alconox, et rincer à fond. Pour le verre et la plasticware, rincez dans 70% d’alcool isopropyl et réserver pour sécher.
   REMARQUE: Une fois que la tumeur est en formaline et que l’espace de l’échantillon est propre, le traitement des données peut être manipulé en même temps que l’imagerie ou une heure ultérieure.

7. Traitement des données pour construire des images THz

1. Exportez les fichiers de données .tvl enregistrés à partir du système THz. Les fichiers de données brutes obtenus à partir du système sont écrits en Python et sont mieux lus dans Python avant d’enregistrer sous forme de fichiers de données MATLAB.
2. Pour construire l’image THz du tissu frais numérisé, convertir les données brutes d’imagerie de réflexion du domaine temporel en domaine de fréquence à l’aide de Fourier se transformer sur la troisième dimension de la matrice de données brute (c.-à-d., la dimension temporelle). Prenez également la transformation Fourier des données de référence.
   REMARQUE: Un spectre de domaine de fréquence typique devrait fournir des données allant de 0,1 THz-4 THz.
3. Normaliser les données de l’échantillon avec les données de référence et effectuer les spectres de puissance en fonction de l’intégration des données normalisées sur la plage de fréquence de f₁ à 0,5 THz à f₂ à 1,0 THz en utilisant l’équation suivante¹⁹:
   
   REMARQUE: Ici, _{l’échantillon} E est les données d’imagerie de réflexion de domaine de fréquence de l’échantillon de tissu et la_référence E est le domaine de fréquence d’une donnée de réflexion ponctuelle unique du signal de référence.
4. Construisez l’image bidimensionnelle en traçant les données calculées de spectre de puissance à chaque point de la matrice définie par l’axe A et l’axe B. C’est ce qu’on appelle l’image de THz de spectre de puissance.
   REMARQUE: La méthode pour obtenir une image tomographique THz est plutôt détaillée dans les étapes 7.5-7.7.
5. Pour la caractérisation, calculez la réflexion théorique dépendante de la fréquence pour une gamme de propriétés tissulaires potentielles à l’aide de l’équation^{suivante 18}:
   
   REMARQUE : Ici, le coefficient complexe de réflexion Fresnel est le coefficient complexe de réflexion Fresnel entre la région i et la région j;d_j est l’épaisseur de la région j; et j est l’angle_j de propagation dans la région j lié à l’angle d’incidence par la loi de Snell. _T,ij est le coefficient de propagation complexe dans la région j, où est la fréquence angulaire, c est la vitesse de la lumière dans le vide, n_j est la partie réelle de l’indice réfractiv, et _{abdos, j} est le coefficient d’absorption¹⁸. La région 1 est l’air, la région 2 est la plaque de polystyrène, et la région 3 est le tissu.
6. Calculez la réflexion dans l’équation(2) pour une gamme d’index réfractifs définis par l’utilisateur et de coefficients d’absorption pour la région 3(n₃ et_abs,3) et comparez avec le signal mesuré à chaque point pour calculer l’erreur carrée moyenne combinée pour l’ampleur et la phase.
   REMARQUE: La solution pour l’index réfractiv et le coefficient d’absorption est la paire de valeurs qui donnent l’erreur la plus basse.
7. Construisez l’image tomographique THz à partir de l’index réfractivé extrait et des données de coefficient d’absorption (n₃ et_abs,3) à chaque pixel. Analyser les régions tumorales en comparant avec l’image de diapositive de pathologie obtenue du pathologiste. Les résultats représentatifs sont présentés à la figure 9, avec des exemples d’adhésion insuffisante au protocole de la figure 10 et de la figure 11.

8. Extraction des propriétés électriques du tissu à l’aide de données de spectroscopie de transmission

1. Sur la fenêtre principale du logiciel de mesure de la spectroscopie de transmission THz, rendez-vous sur l’onglet Fichier et cliquez sur l’option Exportation. Une fenêtre apparaîtra pour sélectionner le type de données et l’échantillon à exporter. Choisissez les types de données de phase de transmission et de transmission pour les mesures du quartz et des échantillons de tissus.
2. Calculez la transmission théorique dépendante de la fréquence pour une gamme de propriétés tissulaires potentielles à l’aide de l’équation^{suivante 15}:
   
   REMARQUE: Voici le rapport entre les coefficients de transmission Fresnel pour l’échantillon et les configurations de référence; Les constantes complexes de propagation de l’air et des tissus sont respectivement de ₁ et _3; et d est l’épaisseur du tissu. La constante de propagation en général est définie comme . l’indice réfractiv complexe est défini comme , où n est la partie réelle de l’indice réfractiv; c est la vitesse de la lumière; est la fréquence angulaire; et _abdos est le coefficient d’absorption¹⁵.
3. Calculez l’erreur carrée moyenne combinée entre l’ampleur et la phase de la transmission dans l’équation (3) et les données de mesure du système pour une gamme de valeurs n et_{abs définies} par l’utilisateur.
   REMARQUE: La solution pour l’index réfractiv et le coefficient d’absorption est la paire de valeurs qui donnent l’erreur la plus basse.
4. Tracer l’indice réfractiv extrait et les données de coefficient d’absorption par rapport à la plage de fréquences de 0,15 à 3,5 THz. Les résultats représentatifs sont indiqués dans la figure 12.

Les résultats d’imagerie de THz18 obtenus suivant le protocole susmentionné du spécimen humain de tumeur de cancer du sein #ND14139 reçus de la biobanque sont présentés dans la figure 9. Selon le rapport de pathologie, la tumeur #ND14139 était un carcinome canalaire infiltré de catégorie d’I/II (IDC) obtenu d’une femme de 49 ans par l’intermédiaire d’une procédure gauche de tumorectomie de sein. La photographie de la tumeur est montrée dans la figure 9A, l’image de pathologie dans la figure 9B, et l’image de spectre de puissance de THz obtenue en utilisant l’équation (1) dans le protocole est montrée dans la figure 9C. L’évaluation de l’image de pathologie a été faite par notre pathologiste consultant à l’Université d’État d’Oklahoma. En corrélé l’image de THz avec l’image de pathologie, il était clair que la région cancéreuse (c.-à-d. la région de couleur rouge dans la figure 9C) a montré une réflexion plus élevée que la région grasse (c.-à-d. la région de couleur bleue dans la figure 9C). Le cercle bleu près du centre de la région cancéreuse de la figure 9C était dû à la présence d’une bulle d’air sous la tumeur pendant le processus d’imagerie.

Des images tomographiques basées sur les propriétés électriques de la tumeur obtenues à l’aide du modèle mentionné ci-dessus pour chaque pixel (2 477 pixels au total) sont également présentées. Les images tomographiques basées sur les données du coefficient d’absorption (cm-1)et des données de l’index réfractif(n- image) de la tumeur obtenues à la fréquence 0,5 THz et 1,0 THz sont montrées dans la figure 9D, 9E, 9Fet 9G,respectivement. Au fur et à mesure que la fréquence augmentait, les valeurs calculées de coefficient d’absorption (cm-1)pour le cancer et les pixels gras augmentaient, les pixels cancéreux affichant des valeurs plus élevées que la graisse aux deux fréquences. En revanche, l’indice réfractiv des deux tissus a diminué à mesure que la fréquence augmentait. Il convient de noter que la phase mesurée est devenue sujette à des variations à l’échelle micrométrique dans le nivellement de stade d’imagerie, l’épaisseur de la plaque de polystyrène, et la gigue de moteur de stepper pendant que la fréquence augmentait. Par exemple, les lignes horizontales observées dans la figure 9E et la 9G étaient dues au petit changement de phase introduit par les moteurs stepper pendant le processus de balayage, qui n’a pas été observé à des fréquences inférieures.

Figure 9 : Analyse de la tumeur de cancer du sein #ND14139 utilisant la technique d’imagerie de THz. (A) Photographie de la tumeur. (B) Image de pathologie de faible puissance de la tumeur. (C) THz image de spectre de puissance sur la gamme de fréquence 0.5 THz-1.0 THz. (D) THz image coefficient d’absorption tomographique obtenue à 0.5 THz. Cette image a été construite en utilisant les données extraites de coefficient d’absorption à chaque pixel des données brutes d’imagerie de réflexion de la tumeur. (E) Image coefficient d’absorption obtenue à 1.0 THz. (F) Image d’index réfractif (n- image) obtenue à 0.5 THz. Cette image a été construite à l’aide des données d’index réfractivés extraites à chaque pixel des données brutes d’imagerie de réflexion de la tumeur. (G) Image de l’index réfractif (n- image) obtenue à 1.0 THz. Figure rééditée de T. Bowman et coll.18 avec la permission de SPIE. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les résultats du THz dont il a été question à la figure 9 ont été obtenus en suivant avec succès le protocole décrit. Une manipulation insuffisante du tissu peut entraîner des résultats d’imagerie trompeurs. Par exemple, l’imagerie THz donne lieu à la figure 10 de la tumeur au cancer du sein humain #ND10405 montrer les effets d’un séchage insuffisant. La solution DMEM excessive dans le tissu a dominé l’image de spectre de puissance de THz de la tumeur dans la figure 10B28 avec la réflexion élevée qui n’a pas corrélé à l’image de pathologie montrée dans la figure 10A28. Ceci a mené à un résultat positif faux, suggérant une plus grande présence du cancer dans la tumeur. DMEM a montré un indice réfractivement également élevé et coefficient d’absorption à l’eau, comme on le voit dans la figure 10C19 et 10D19, il est donc fortement recommandé de sécher la tumeur correctement avant l’imagerie.

Figure 10 : Effet sur l’imagerie tumorale retiré de la solution DMEM sans séchage à l’aide de papier filtre. (A) Image de pathologie de faible puissance de la tumeur #ND10405. (B) THz image spectra de puissance de la tumeur #ND10405 sur la plage de fréquence 0.5 THz-1.0 THz. (C) La parcelle d’index réfracttif de transmission pour DMEM, PBS, et l’eau s’étendant de 0.15 THz-3.5 THz. (D) Le coefficient d’absorption de transmission (cm-1) parcelle pour DMEM, parcelle de terrain pour DMEM, PBS, et l’eau allant de 0,15 THz-3.5 THz. Figure 10A, 10B sont republiés de T. Bowman et al.28 avec la permission de l’IEEE et figure 10C, figure 10D sont republiés de N. Vohra et al.19 avec la permission de IOP Publishing, Ltd s’il vous plaît cliquez ici pour voir un chiffre plus grand de cette version.

Un autre exemple d’observance insuffisante du protocole est montré pour la tumeur #ND11713 dans la figure 11. Dans ce cas, les bulles d’air entre la plaque de polystyrène et la tumeur n’ont pas été enlevées quand la tumeur a été placée sur la plaque pour la procédure d’imagerie. Il en est résulté plusieurs points de faible réflexion à travers l’image de THz dans la figure 11B, ce qui a empêché une comparaison précise avec la pathologie de la figure 11A. Ainsi, si des bulles d’air sont observées après avoir placé la tumeur sur la plaque, appuyez-la avec les pincettes ou soulevez la tumeur et roulez doucement sur le polystyrène jusqu’à ce que les trous d’air soient enlevés.

Figure 11 : Les artefacts de l’image de THz causés par la présence de bulles d’air entre la plaque de polystyrène et la tumeur. (A) Image de pathologie de faible puissance de la tumeur #ND11713. (B) THz image spectre de puissance de la tumeur #ND11713 sur la gamme de fréquence de 0.5-1.0 THz. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les résultats de la spectroscopie de transmission18 pour le même échantillon (ND14139) sont présentés à la figure 12. Les sections tumorales ont été prises à partir de points et dans la figure 12A et caractérisées suivant le protocole. Les deux points sélectionnés ont été pris de la région de tissu de cancer dans la tumeur selon l’image de pathologie dans la figure 12B. Le coefficient d’absorption extrait et l’indice réfractiv pour les deux sections de tumeur sont présentés dans la figure 12C,D. Les deux points ont montré un bon accord pour toute la plage de fréquences. La courbe noire de 0,15 à 2 THz dans la figure 12C et la figure 12D représente les données obtenues à partir de la littérature23 pour comparer les résultats obtenus dans notre travail.

Figure 12 : La caractérisation de la tumeur de cancer du sein #ND14139 utilisant la spectroscopie de transmission de THz. (A) La photographie de la tumeur avec deux points sélectionnés marqués et d’où les sections de 0,5 mm d’épaisseur de la tumeur ont été coupées pour les mesures de spectroscopie de transmission. (B) Image de pathologie de faible puissance de la tumeur. (C) Le coefficient d’absorption de transmission (cm1) parcelle allant de 0,15 à 3,5 THz aux points et . (D) L’indice réfractif de transmission s’étend de 0,15 à 3,5 THz aux points et . Figure republiée de T. Bowman et coll.18 avec la permission de SPIE. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.