Article de méthode

Analyse de cytométrie de flux des sous-ensembles de cellules immunitaires dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial dans un modèle d’arthrose

DOI :

10.3791/61008

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24 avril 2020

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1Raymond Purves Bone and Joint Research Laboratory, Institute of Bone and Joint Research, Kolling Institute, Royal North Shore Hospital, University of Sydney, 2HTRG - Heidelberg Trauma Research Group, Center for Orthopedics, Trauma Surgery and Spinal Cord Injury, Trauma and Reconstructive Surgery, Heidelberg University Hospital, 3Department of Large Animal Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Michigan State University

Dans cet article

Résumé

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Ici, nous décrivons un protocole détaillé et reproductible de cytométrie de flux pour identifier les sous-ensembles monocytes/macrophage et t-cell utilisant des essais de coloration extra- et intracellulaire dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial, utilisant un modèle chirurgical établi de l’arthrose murine.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’arthrose est l’une des maladies musculo-squelettiques les plus répandues, affectant les patients souffrant de douleur et de limitations physiques. Des preuves récentes indiquent un composant inflammatoire potentiel de la maladie, avec les cellules T et les monocytes/macrophages potentiellement associés à la pathogénie de l’OA. D’autres études ont postulé un rôle important pour des sous-ensembles des deux lignées cellulaires inflammatoires, telles que Th1, Th2, Th17, et lymphocytes T-régulateurs, et M1, M2, et synovium-tissu-résidents macrophages. Cependant, l’interaction entre la réponse cellulaire inflammatoire synoviale et systémique locale et les changements structurels dans l’articulation est inconnue. Pour bien comprendre comment les lymphocytes T et les monocytes/macrophages contribuent à l’arthrose, il est important de pouvoir identifier ces cellules et leurs sous-ensembles simultanément dans les tissus synoviaux, les organes lymphatiques secondaires et systémiquement (la rate et la moelle osseuse). De nos jours, les différents sous-ensembles de cellules inflammatoires peuvent être identifiés par une combinaison de marqueurs de surface cellulaire faisant de la cytométrie de flux multicolore une technique puissante dans l’étude de ces processus cellulaires. Dans ce protocole, nous décrivons des étapes détaillées concernant la récolte du tissu synovial et des organes lymphatiques secondaires ainsi que la génération de suspensions unicellulaires. En outre, nous présentons à la fois un test de coloration extracellulaire pour identifier les monocytes/macrophages et leurs sous-ensembles aussi bien qu’un test de coloration extra- et intra-cellulaire pour identifier les lymphocytes T et leurs sous-ensembles dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial. Chaque étape de ce protocole a été optimisée et testée, ce qui a donné lieu à un test hautement reproductible qui peut être utilisé pour d’autres modèles chirurgicaux et non chirurgicaux de souris OA.

Introduction

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L’arthrose (OA) est une maladie débilitante et douloureuse impliquant diverses pathologies de tous les tissus associés à l’articulation1. Affectant environ 3,8% de la population mondiale2, l’arthrose est l’une des maladies musculo-squelettiques les plus répandues et elle deviendra la4ème cause d’invalidité dans le monde d’ici 20203. L’arthrose post-traumatique survient après une blessure articulaire et représente au moins 12 % de l’ensemble de l’arthrose et jusqu’à 25 % de l’arthrose dans les articulations sensibles comme le genou4,,5. En outre, les lésions articulaires augmentent le risque de OA à vie de plus de cinq fois6. Toutes les blessures ayant une instabilité apparemment similaire ne développeront pas d’arthrose, et par conséquent, il demeure difficile de définir les facteurs qui déterminent le risque d’arthrose à long terme. Il est crucial de mettre au point des traitements efficaces pour prévenir et/ou traiter l’arthrose post-traumatique, d’étudier et de mieux définir la pathologie, les causes et les mécanismes spécifiques aux blessures qui prédisposent à l’arthrose1.

L’arthrose et sa destruction du cartilage a été précédemment attribuée entièrement au stress mécanique et, par conséquent, l’arthrose a été considérée comme une maladie non inflammatoire2. Cependant, des études plus récentes ont montré une infiltration inflammatoire des membranes synoviales et une augmentation des cellules inflammatoires dans le tissu synovial dans les patients présentant l’OA comparé aux contrôles sains2,jetant la lumière sur un composant inflammatoire comme force motrice potentielle dans l’OA. D’autres études ont indiqué que des anomalies dans le profil de cellules T CD4+ et CD8+ ainsi que dans les monocytes/macrophages du système immunitaire inné peuvent contribuer à la pathogénie de l’OA2,7. Des études détaillées sur ces anomalies ont révélé des rôles pertinents pour divers sous-ensembles de lymphocytes T2, tels que Th18, Th29, Th178 et T régulateur (Treg) populations10,11. Malgré ces preuves convaincantes, la relation causale entre l’altération des réponses des lymphocytes T et le développement et la progression de l’arthrose est encore inconnue2.

En plus des lymphocytes T spécifiques ayant un rôle dans l’arthrose, des études récentes suggèrent que les macrophages polarisés/activés différentiellement peuvent être associés à la pathogénie de l’OA12. En particulier, les macrophages provenant des monocytes sanguins s’accumulent dans le synovium et se polarisent dans les macrophages à activation classique (M1) ou les macrophages activés alternativement (M2) pendant le développement de l’OA, ce qui implique une corrélation entre les macrophages dérivés des monocytes et l’OA13. En revanche, certains sous-ensembles de macrophages peuplent les organes tôt pendant le développement et soutiennent eux-mêmes leur nombre dans une matière indépendante monocyte14. Récemment, une fonction de protection commune médiée par une barrière à jonction serrée a été montrée pour ces macrophages synovial-tissu-résidents (STRMs)14. Ces résultats indiquent que des anomalies dans des sous-ensembles de macrophage particuliers peuvent jouer un rôle crucial pendant le développement de l’OA. Cependant, les interactions entre cette réponse cellulaire inflammatoire et les changements structurels dans l’articulation suivant le trauma sont inconnues.

Historiquement, l’analyse des cellules immunitaires dans le tissu synovial a été limitée à l’immunohistorichemisme (IHC) ou à l’expression de l’ARNm par réaction en chaîne de polymérase inverse-transcription (RT-PCR)approches 15,16. Cependant, l’IHC et le RT-PCR n’ont pas la capacité d’identifier plusieurs types de cellules différents et leurs sous-ensembles simultanément, limitant ainsi l’applicabilité de ces méthodes. En outre, iHC est limitée à l’analyse de petits échantillons de tissu et peut manquer des accumulations de cellules inflammatoires focales. Au cours des dernières années, une myriade de marqueurs de surface pour divers types de cellules ont été développés, et des sous-ensembles de cellules immunitaires peuvent maintenant être identifiés de manière fiable par des combinaisons distinctes de ces marqueurs. En raison de progrès techniques réguliers, les cytomètres de flux sont maintenant capables d’identifier une multitude de fluorochromes différents permettant simultanément l’analyse de grands panneaux d’anticorps multicolores.

La cytométrie de flux fournit aux chercheurs une technique puissante qui permet l’identification simultanée et la quantification d’une multitude de cellules immunitaires et de leurs sous-ensembles au niveau des cellules uniques. Nous avons développé et optimisé à la fois un test de coloration extracellulaire pour identifier les monocytes/macrophages et leurs sous-ensembles ainsi qu’un test de coloration extra/intracellulaire pour identifier les lymphocytes T et leurs sous-ensembles dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques et le tissu synovial. Chaque étape de ce protocole a été optimisée et testée, ce qui a donné lieu à un test hautement reproductible qui peut être utilisé pour d’autres modèles chirurgicaux et non chirurgicaux de souris OA17.

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Protocole

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Northern Sydney Local Health District Animal Ethics Committee a approuvé toutes les procédures mentionnées dans ce protocole. Les souris sont logées et soignées conformément au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Health and Medical Research Council of Australia Revised 2010). Pour toutes les expériences 10-12-semaine-vieux, mâle C57BL/6 souris ont été utilisées.

REMARQUE : Pour induire l’OA post-traumatique, la déstabilisation chirurgicale du ménisque médial (DMM) dans l’articulation d’étouffement droite a été exécutée. Des informations détaillées concernant ce modèle animal ont été publiées par Glasson et coll.18. En bref, l’anesthésie générale est induite dans une chambre d’induction à l’aide d’isoflurane et par la suite maintenue à l’aide d’un cône de nez. La jambe chirurgicale est rasée avec une lame de rasoir et le site chirurgical est lavé et tamponné avec de l’éthanol pour minimiser la contamination. L’animal est ensuite déplacé au microscope d’opération et placé sur une serviette stérile et la jambe drapée avec le drapé de papier stérile pour isoler le site chirurgical et minimiser la contamination. À l’aide du microscope, une arthrotomie para-rotella médiale de 0,5 cm est faite, la rotule luxated laterally, et le tampon de graisse d’infra-rotella élevé pour exposer le ligament mésisco-tibial médial, qui est transecté avec des forceps de dissection. L’articulation est rincée avec de la solution saline stérile pour enlever tout sang et la plaie est fermée en trois couches – capsule articulaire, tissu sous-cutané (à l’aide de matériel de suture) et peau (à l’aide de colle de tissu chirurgical). Les méthodes décrites dans ce protocole, cependant, peuvent être appliquées à d’autres modèles et méthodes pour induire l’arthrose. L’arthrose peut être induite de part et d’autre de l’animal, et lors de la récolte des tissus, il est important de récolter les ganglions lymphatiques ipsilateral (drainant).

1. Isolement de la rate, moelle osseuse contralatérale, ganglions lymphatiques ipsilateral drainant le tissu étouffé et synovial

  1. Euthanasier la souris par dislocation cervicale. Placez la souris en position de supination sous un microscope à dissection et essuyez la poitrine, l’abdomen et les jambes avec 70% d’éthanol. Ouvrez soigneusement la peau sur la ligne médiane pour la longueur de l’abdomen à l’aide de ciseaux droits laissant la cavité abdominale intacte.
  2. Tirez doucement la peau sur le côté droit de l’animal loin du muscle sous-jacent laissant le tissu adipeux sous-cutané attaché à la peau. Normalement, la traction douce seule séparera la peau et le tissu adipeux sous-jacent du muscle. Les adhérences sporadiques doivent être coupées à travers avec des ciseaux fins afin de maintenir la tension nécessaire pour séparer les tissus à un minimum et réduire le risque de nuire aux ganglions lymphatiques. Identifiez un croisement de trois vaisseaux en taquinant doucement le tissu adipeux situé à la cuisse à l’aide de deux forceps fins incurvés. Le ganglion lymphatique inguinal est situé au croisement et peut être identifié par sa forme ovoïde et sa couleur légèrement plus foncée.
  3. Retirez le ganglion lymphatique inguinal à l’aide de forceps de dissection fin. Veillez à ne pas rompre la capsule. Retirer le reste de la graisse à la surface du ganglion lymphatique avec les forceps.
  4. Ouvrez la cavité abdominale et identifiez la rate. Découpez la rate avec de beaux ciseaux. Tirez doucement les intestins de côté pour exposer l’aorte et sa bifurcation en prenant soin de ne pas leur nuire, afin de minimiser le risque de contamination. Le ganglion lymphatique iliaque est situé au segment terminal de l’aorte abdominale et à l’origine de l’artère iliaque commune. Retirez le ganglion lymphatique iliaque droit et procédez comme décrit dans 1.3.
  5. Retirez doucement la peau des deux membres postérieurs. Disséquer le fémur gauche en le nettoyant à partir du tissu musculaire à l’aide de la lame et des ciseaux fins. Déconnectez soigneusement l’étouffement et l’articulation de la hanche en laissant l’os entier intact et enlevez le fémur.
  6. Identifier le tendon rotule de l’articulation droite étouffer, puis enlever le tissu musculaire adjacent proximal à ce à l’aide de ciseaux fins jusqu’à ce qu’environ 5mm de tendon quadriceps proximal à la rotule est exposée. Par la suite, couper à travers le tendon du quadriceps environ 3-4mm proximal à la rotule pour former une poignée et en utilisant des forceps fines doucement le tirer loin de l’articulation. Cela rendra visibles les bords de l’attachement de la capsule articulaire au fémur, et à l’aide d’une lame de scalpel soigneusement coupée le long des bords de la capsule articulaire des deux côtés, en commençant par le fémur allant vers le tibia, afin de maximiser la quantité de membrane synoviale qui est récoltée. Lors de la coupe, il est important de maintenir une traction douce sur le tendon du quadriceps et de faire une pause lorsque le bloc tissulaire synovial est seulement attaché au tibia. À ce stade, le tampon de graisse intraarticulaire est maintenant clairement visible distal à la rotule et peut être doucement détaché de l’articulation et l’aspect antérieur des ménisques à l’aide de la lame. Par la suite, couper le long de la partie restante de la capsule articulaire (partie tibiale) pour enlever le bloc tissulaire synovial.
    REMARQUE : Cette étape doit être faite très précisément pour permettre des résultats fiables. Après avoir terminé la dissection, le « bloc de tissu synovial » devrait se composer de la rotule, du tendon de rotule, du tampon de graisse d’infrapatellar, de la doublure synoviale de résécrésure supra- et infrapatellar et de la capsule commune associée antérieure aux ligaments collatéraux. Gardez tous les tissus humides pendant la dissection à l’aide d’une solution saline de 0,9 %.
    REMARQUE : Placez chaque échantillon de bloc tissulaire synovial dans un puits séparé d’une plaque étiquetée de 24 puits contenant 1,5 ml de milieu RPMI 1640. Combinez à la fois l’iliaque et le ganglion lymphatique inguinal en un puits et les tissus de mise en commun de deux souris.

2. Génération de suspensions à cellule unique à partir de chaque tissu

REMARQUE : Afin d’assurer un nombre suffisant de cellules pour l’analyse du débit, il faut mettre en commun les tissus synoviaux de deux souris. Dans le protocole actuel, mettre en commun tous les tissus des deux mêmes souris afin de maintenir l’analogie. En outre, des ganglions lymphatiques iliaques et inguinaux ont été combinés pour chaque animal, ce qui a donné lieu à un total de 4 ganglions lymphatiques pour chaque échantillon. En général, les nombres de cellules dans la rate, la moelle osseuse et les ganglions lymphatiques d’un animal sont suffisants pour effectuer l’analyse du débit et le protocole peut être appliqué. Toutefois, lorsqu’on utilise des tissus provenant d’un seul temps de lysage animal, il peut être nécessaire d’ajuster les tissus d’un seul temps de lysage animal.

  1. La rate
    1. Placez les deux rates mises en commun sur une passoire cellulaire de 70 μm sur un tube de 15 ml. Macérer doucement les rates à travers le filtre à mailles à l’aide d’un piston stérile à seringues de 3 mL. Rincer fréquemment la passoire avec un total de 6 mL de RPMI 1640 moyen complété par 10% FBS.
    2. Faites tourner les cellules (500 x g,5 min, RT) et resuspendez le granulé dans 5 mL de tampon de lyse des globules rouges (RBC). Incuber pendant 5 min à RT et arrêter la réaction en diluant le tampon de lyse avec 10 mL de PBS. Faites tourner les cellules (500 x g,5 min, RT) et répétez cette étape une fois ou jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de RBC dans le granulé.
      REMARQUE : Refiltrez la suspension à l’aide d’une passoire à cellules de 30 μm dans un nouveau tube de 15 ml entre les deux séries de lysage pour enlever les cellules coagulées.
    3. Une fois le lysage terminé, faites tourner les cellules (500 x g, 5 min, RT), jeter le supernatant et resuspend le granulé dans 1 mL de PBS. Comptez le nombre de cellules vivantes sur un hémocytomètre à l’aide de l’exclusion bleue de Trypan.
  2. Les ganglions lymphatiques
    1. Placez les quatre ganglions lymphatiques mis en commun sur une passoire cellulaire de 70 μm au-dessus d’un tube de 15 ml. Taquinez doucement les ganglions lymphatiques séparés en une seule suspension cellulaire en appuyant à l’aide d’un piston stérile à seringues de 3 mL. Rincer fréquemment la passoire avec un total de 6 mL de RPMI avec 10% FBS.
    2. Faire tourner les cellules (500 x g, 5 min, RT), jeter le supernatant et resuspend le granulé dans 500 μL de PBS. Refiltrer la suspension à l’aide d’une passoire cellulaire de 30 μm dans un nouveau tube de 15 ml pour enlever les cellules coagulées. Comptez le nombre de cellules vivantes sur un hémocytomètre à l’aide de l’exclusion bleue de Trypan.
  3. La moelle osseuse
    1. Saisissez soigneusement le fémur intact à l’aide d’un pouce de tissu forceps sans le fracturer. Couper l’extrémité du fémur proximal à l’aide d’un ciseaux pointu afin de faciliter le rinçage de l’os. Tournez le fémur autour et placez une aiguille de 23 G au milieu de l’encoche intercondylaire du fémur. Tout en appliquant une pression douce faire pivoter l’aiguille entre le pouce et l’index afin de percer un trou dans l’encoche intercondylaire pour entrer dans la cavité osseuse.
      REMARQUE : Parfois, les particules de l’os peuvent obstruer l’aiguille après avoir percé le trou, afin d’éviter une pression élevée inutile pendant le rinçage d’un changement d’aiguille avant que le rinçage ne soit recommandé.
    2. Rincer l’os avec 6 ml de RPMI avec 10% FBS (ou jusqu’à ce que la chasse d’eau devienne blanche) à l’aide d’une seringue de 10 ml avec une aiguille de 23 G sur une passoire à cellules de 70 μm qui est placée sur un tube de 15 ml. Appuyez doucement sur la moelle osseuse à l’aide d’une soucoupe cellulaire à l’aide d’un piston d’une seringue de 3 mL et rincez la passoire avec 3 autres mL de RPMI.
      REMARQUE : Les os doivent apparaître blancs une fois que toute la moelle a été complètement rincée.
    3. Faites tourner les cellules (500 x g,5 min, RT) et resuspendez le granulé dans 5 mL de tampon de lyse RBC. Incuber pendant 5 min à RT et arrêter la réaction en diluant le tampon de lyse avec 10 mL de PBS.
    4. Faire tourner les cellules (500 x g, 5 min, RT), jeter le supernatant et resuspend le granulé dans 1 mL de PBS. Refiltrer la suspension à l’aide d’une passoire cellulaire de 30 μm dans un nouveau tube de 15 ml pour enlever les cellules coagulées. Comptez le nombre de cellules vivantes sur un hémocytomètre à l’aide de l’exclusion bleue de Trypan.
  4. Le tissu synovial
    1. Couper les deux blocs de tissu synovial en petits morceaux avec un ciseau chirurgical fin. Transférer les échantillons avec un milieu dans un tube de 15 mL. Rincer l’ancien puits avec 0,5 ml supplémentaire de RPMI pour obtenir les cellules restantes et les tissus synoviaux, transfert au tube de faucon (volume final 2 ml).
      CONSEIL : Utilisez une pipette de transfert et coupez la pointe où le diamètre s’élargit à cette étape.
    2. Reconstituer l’enzyme et l’aliquot selon les instructions du fabricant (p. ex., Liberase). Ajouter suffisamment d’enzymes pour obtenir une concentration finale de 1 unité/mL (un total de 2 unités par échantillon). Digèrez à 37 °C pendant 2 h à l’aide d’un rotateur MACS.
    3. Arrêter la digestion en ajoutant 8 ml de RPMI avec 10% FBS et suspension de cellules filtrantes à travers une passoire cellulaire de 70 μm dans un nouveau tube de 15 mL. Rincez l’ancien tube de 15 ml avec un autre 5 ml de RPMI avec 10% de suspension de cellules de 40% et de cellules filtrantes à travers la même passoire cellulaire dans le nouveau tube (volume final de 15 mL).
    4. Faire tourner les cellules (500 x g, 10 min, RT), jeter le supernatant et resuspend le granulé dans 500 μL de PBS. Comptez le nombre de cellules vivantes sur un hémocytomètre à l’aide de l’exclusion bleue de Trypan.

3. Répartition des cellules

  1. Étiqueter deux plaques de 96 puits (forme u-fond) avec le type de tissu, l’identification animale, et le panneau d’anticorps désigné. Un total de deux panneaux d’anticorps sont utilisés dans ce protocole : panneau de sous-ensemble de monocytes (coloration extracellulaire) et panneau de sous-ensemble de cellules T (coloration extra- et intracellulaire).
  2. Fournir 5 x 105 cellules par puits en utilisant les suspensions à cellule unique respectives.
    REMARQUE : Lors de la mise en place de l’expérience, évaluez le nombre absolu de cellules attendues par groupe et par type de tissu (les animaux traités ont un nombre de cellules plus élevé dans les tissus que les animaux témoins). Lorsque vous resuspendez le granulé cellulaire au cours de la dernière étape de la génération de suspensions à cellule unique, choisissez une quantité appropriée de PBS afin de vous retrouver avec une concentration de 5 x 105 pour 200 μL. La plaque de 96 puits utilisée ici peut contenir un maximum de 300 μL et, en général, 200 μL est idéale pour minimiser le risque de contamination croisée due aux déversements.
  3. Pour chaque type de panneau et de tissu, distribuez au moins 5 x 105 cellules sous forme de contrôles non tachés dans des puits clairement marqués.

4. Panneau de sous-ensemble de monocytes

  1. Effectuer la coloration de viabilité : Cellules de spin (500 x g, 5 min, 4 °C) à l’aide d’un fileur de plaque et laver les cellules une fois avec 200 μL de 1x PBS. Préparer une solution de stock de colorant amine-réactif (tache de viabilité) dilué 1:50 dans 1x PBS. Par la suite, resuspendez les granulés cellulaires à 100 μL de cette solution de stock, ce qui entraîne un volume absolu de 2 μL de tache de viabilité par puits. Incuber pendant 15 min à 4 °C à l’abri de la lumière.
    REMARQUE : La quantité optimale de tache de viabilité nécessaire doit être déterminée en effectuant une courbe de titration de dose. En outre, la solution de stock de taches de viabilité diluée doit être utilisée en une seule journée et ne pas être stockée. Consultez les instructions du fabricant pour obtenir plus d’informations sur la façon de reconstituer, diluer et stocker la tache de viabilité.
  2. Pendant l’incubation, préparer le cocktail d’anticorps dans un volume approprié de tampon FACS (PbS gratuit Ca2+ et Mg+ contenant 0,1%BSA et 0,02% d’azide de sodium). Laver les cellules deux fois avec 200 μL de tampon FACS, la centrifugeuse (500 x g, 5 min, 4 °C) et résuspender chaque granulé avec 100 μL du mélange d’anticorps ou le mélange témoin approprié. Incuber pendant 30 min à 4 °C à l’abri de la lumière.
    REMARQUE : Veuillez noter que l’azide de sodium est toxique pour les cellules. Dans le protocole actuel, la concentration d’azide de sodium dans la réserve de débit est très faible (0,02 %) et les échantillons sont exécutés immédiatement après la coloration ainsi, ne causant aucun problème. Si des tests fonctionnels en aval de cellules triées sont prévus, il pourrait être avantageux de constituer un tampon FACS frais chaque jour d’expériences et de ne pas utiliser d’azide de sodium. Lors de l’utilisation d’une multitude d’anticorps, il est conseillé d’ajouter une quantité appropriée de « Brilliant Stain Buffer » au cocktail d’anticorps pour améliorer les résultats.
  3. Laver les cellules deux fois avec 200 μL de tampon FACS et resuspend les cellules dans 250 μL de tampon FACS + EDTA (tampon FACS contenant 1 mM EDTA). Transférer les échantillons dans des tubes FACS étiquetés. Conserver les échantillons à 4 °C et les protéger de la lumière jusqu’à l’acquisition.
    REMARQUE : Les cellules immunitaires ont tendance à être collantes. Afin de minimiser à la fois le risque de blocage et le nombre de doublets, il est recommandé d’ajouter 1 mM EDTA à la mémoire tampon de flux final.

5. Panneau de sous-ensemble de cellules T

  1. Effectuer la coloration de viabilité : Cellules de spin (500 x g, 5 min, 4 °C) à l’aide d’un fileur de plaque et laver les cellules une fois avec 200 μL de 1x PBS. Préparer une solution de stock de colorant amine-réactif (tache de viabilité) dilué 1:50 dans 1x PBS. Par la suite, resuspendez les granulés cellulaires à 100 μL de cette solution de stock, ce qui entraîne un volume absolu de 2 μL de tache de viabilité par puits. Incuber pendant 15 min à 4 °C à l’abri de la lumière.
  2. Tout en couveant les échantillons, préparer le cocktail d’anticorps de coloration extracellulaire dans un volume approprié de tampon FACS 1x. Laver les cellules deux fois avec 200 μL de tampon FACS 1x, les faire tourner vers le bas (500 x g,5 min, 4 °C) et resuspend chaque granulé avec 100 μL du mélange d’anticorps ou mélange de contrôle approprié. Incuber pendant 30 min à 4 °C à l’abri de la lumière.
  3. Effectuer la coloration intracellulaire avec un kit de fixation et de perméabilisation suivant les instructions du fabricant. Laver les cellules deux fois avec 200 μL de tampon FACS 1x et resuspender dans 200 μL de tampon de fixation. Incuber pendant 40 min à 4 °C à l’abri de la lumière.
  4. Pendant l’incubation, préparer le cocktail d’anticorps (coloration intracellulaire) dans un volume approprié de 1x permeabilisation et tampon de lavage. Recueillir les cellules en tournant (750 x g, 5 min, 4 °C) et laver les cellules deux fois avec 200 μL de tampon de 1x perm/lavage.
    REMARQUE : La fixation et la perméabilisation donnent des résultats dans les cellules qui ont tendance à être un peu plus difficiles à faire correctement. Afin de minimiser la perte de cellules au cours des étapes de lavage suivantes, augmenter la force centrifuge à 750 x g. Alternativement, un cycle de rotation plus long pourrait également être appliqué. Cependant, cela se traduirait par un temps beaucoup plus long qui est nécessaire pour préparer les cellules.
  5. Les cellules de spin (750 x g, 5 min, 4 °C) et resuspendent chaque granulé avec 100 μL du mélange d’anticorps ou du mélange témoin approprié. Incuber pendant 40 min à 4 °C à l’abri de la lumière.
  6. Laver les cellules deux fois avec 200 μL de tampon de 1x perm/lavage et resuspend les cellules dans 250 μL de tampon FACS + EDTA. Transférer les échantillons dans des tubes FACS étiquetés. Conserver les échantillons à 4 °C et les protéger de la lumière jusqu’à l’acquisition.
    REMARQUE : Pour chaque anticorps, la concentration optimale doit être déterminée en effectuant une courbe de titrage de dose. La concentration entre les anticorps peut différer considérablement : le CD3 et le CD80 ont été utilisés avec un facteur de dilution de 1:1, tandis que le CD11b et le CD4 ont été utilisés avec un facteur de dilution de 1:6400. Lors de la titration de la concentration d’anticorps utiliser le même nombre de cellules qui seront utilisés au cours des expériences.

6. Indemnisation, contrôles appropriés et gating

  1. Configuration de l’expérience
    1. Une fois que la concentration optimale d’anticorps a été déterminée, les commandes non tachées et individuelles pour compenser le chevauchement spectral.
      REMARQUE : Exécutez tous les contrôles de compensation avec les cellules et les perles de compensation. Utilisez ce qui génère les résultats les plus brillants (l’IMF le plus élevé d’événements positifs) pour la rémunération. L’IMF signifie l’intensité moyenne de fluorescence et est souvent utilisé pour décrire et définir l’intensité moyenne du signal généré et, par conséquent, le niveau d’expression des anticorps.
    2. Exécutez des contrôles de fluorescence moins un (FMO) et des contrôles d’isotype lors du démarrage d’une nouvelle expérience multicolore. Plus de détails concernant FMO ont déjà étépubliés 19.
    3. Déterminer la tension optimale de la zone de dispersion avant (FSC-A) et la tension de la zone de dispersion latérale (SSC-A) afin de détecter la population de leucocytes dans les commandes non tachées de chaque type de tissu.
      REMARQUE : Le processus de fixation et de perméabilisation modifie les dimensions de la cellule. Ainsi, les tensions FSC-A et SSC-A pour le panneau sous-ensemble monocyte et le panneau de sous-ensemble de cellules T diffèrent considérablement. Afin de trouver les tensions optimales pour le panneau sous-ensemble de cellules T, utilisez des cellules qui ont été tachées seules avec cd3 et porte arrière vers les populations de leucocytes tout en ajustant les valeurs FSC-A et SSC-A.
  2. Stratégie de gating
    1. Une fois que la tension optimale FSC-A et SSC-A a été déterminée, installez une barrière primaire sur la population de leucocytes.
      REMARQUE : Avant chaque expérience, calibrez le cytomètre à l’aide de perles d’étalonnage selon les instructions du fabricant et exécutez des perles non tachées. Les populations de leucocytes de différents points de temps devraient avoir des propriétés FSC et SSC comparables (de légères différences entre les types de tissus sont attendues et normales). Si FSC et SSC varie des difficultés considérables tirer le cytomètre et la génération d’échantillons.
    2. Exclure les doublets : Plot FSC-A (y-axe) et FSC-H (x-axe). Les singlets apparaissent comme une diagonale de cette intrigue. Porte sur singlets.
    3. Exclure les cellules mortes : Parcelle FVS510 (tache de viabilité) (axe x) et FSC-A (axe y). Les cellules mortes apparaîtront comme des événements positifs, donc la porte sur les cellules vivantes.
      REMARQUE : Les vraies cellules négatives seront visibles dans les contrôles non tachés. Ainsi, réglez cette porte pour chaque ensemble d’échantillons lors de l’exécution des contrôles non tachés avant les échantillons tachés. D’autres gating dépend du panneau d’anticorps et du type de cellule qui est étudié. Les stratégies de gating pour chaque panneau utilisé dans ce protocole se trouvent respectivement à la figure 1 et à la figure 4.

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Résultats

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Les résultats représentatifs du panneau de sous-ensemble de monocytes et du panneau de sous-ensemble de cellules T sont décrits ci-dessous.

La figure 1 illustre la stratégie hiérarchique de gating pour le panneau de sous-ensemble de monocytes sur les cellules immunitaires recueillies à partir de la moelle osseuse des animaux traités par DMM. La même stratégie a été utilisée et vérifiée dans tous les autres types de tissus. Lors de la mise en place de l’expérience,...

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Discussion

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Les méthodes décrites dans ce protocole ont été conçues et testées pour identifier de manière fiable divers sous-ensembles des monocytes/macrophages et des lymphocytes T dans la rate murine, la moelle osseuse, les ganglions lymphatiques, et le tissu synovial dans un modèle murin de l’arthrose (OA). Le protocole actuel peut facilement être modifié pour étudier différents types de tissus, ou d’autres types de cellules en échangeant des anticorps, et peut être utilisé pour d’autres modèles muriniques de l’arthrose. Lors de ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à révéler.

Remerciements

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Nous tenons à remercier Andrew Lim, Ph.D. et Giles Best, Ph.D. pour leur aide dans la mise en place du cytomètre de flux. Ce projet a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) (DFG-HA 8481/1-1) décernée à PH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
APC anti-souris CD194 (CCR4)BioLegend131212T-Cell
Panel Tampon de Teinture Brillant Plus 1000TstBD566385Tampons
De Viabilité Fixable Teinture 510, 100 µ ; gBD564406Panneau T-Cell
Fixable Vitability Stain 510, 100 & micro ; gBD564406Monocyte
Panel Liberase, Research GradeRoche5401127001Enzyme pour le tissu synovial
Ms CD11b APC-R700 M1/70, 100 & micro ; gBD564985Panneau monocytaire
Ms CD11C PE-CF594 HL3, 100 µ ; gBD562454Panneau Monocyte
Ms CD183 BB700 CXCR3-173, 50 µ ; gPanneau T BD742274
Ms CD206 Alexa 647 MR5D3, 25 µ ; gBD565250Panneau monocytaire
Ms CD25 BV605 PC61, 50 µ ; gBD563061Panneau T-Cell
Ms CD3e APC-Cy7 145-2C11, 100 & micro ; gBD557596Panneau T-Cell
Ms CD4 PE-Cy7 RM4-5, 100 & micro ; gPanneau àcellules T552775
Ms CD44 APC-R700 IM7, 50 & micro ; gBD565480Panneau T-Cell
Ms CD62L BB515 MEL-14, 100 µ ; gPanneau T BD565261
Ms CD69 BV711 H1.2F3, 50 & micro ; gBD740664Panneau T-Cell
Ms CD80 BV650 16-10A1, 50 & micro ; gBD563687Panneau monocytaire
Ms CD8a BV786 53-6.7, 50 & micro ; gBD563332Panneau T-Cell
Ms F4/80 BV421 T45-2342, 50 & micro ; gBD565411Panneau monocytaire
Ms Foxp3 PE MF23, 100 µ ; gBD560408Panneau T-Cell
Ms I-A I-E BV711 M5/114.15.2, 50 µ ; gBD563414Panneau Monocyte
Ms Ly-6C PE-Cy7 AL-21, 50 µ ; gBD560593Panneau monocytaire
Ms Ly-6G APC-Cy7 1A8, 50 µ ; gBD560600Panneau monocyte
Ms NK1.1 BV650 PK136, 50 µ ; gBD564143Panneau T-Cell
Ms ROR Gamma T BV421 Q31-378, 50 µ ; gBD562894T-Cell Panel
Tampon de lyse des globules rouges/ATampons/A
Tampons de facteur de transcription 100TstBD562574Buffers
BD NN

Références

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Mots-clés

Suspension de cellules uniquesmarquage extracellulairemarquage intracellulaire

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