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Phénottypage à haute teneur en levures avec séquençage à base d’ARN à base de gouttelette

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DOI :

10.3791/61014

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21 mai 2020

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1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California San Francisco, 2University of California Berkeley-UCSF Graduate Program in Bioengineering, University of California San Francisco, 3Department of Pharmaceutical Chemistry, University of California San Francisco, 4California Institute for Quantitative Biosciences, University of California San Francisco, 5Chan Zuckerberg Biohub

Dans cet article

Résumé

Un goulot d’étranglement dans le cycle de «conception-construction-test» de l’ingénierie microbienne est la vitesse à laquelle nous pouvons effectuer des écrans fonctionnels de souches. Nous décrivons une méthode à haut débit pour le criblage des souches appliquée à des centaines à des milliers de cellules de levure par expérience qui utilise le séquençage à base d’ARN à base de gouttelettes.

Résumé

Les puissants outils disponibles pour modifier les génomes de levure ont fait de ce microbe une plate-forme précieuse pour l’ingénierie. Bien qu’il soit maintenant possible de construire des bibliothèques de millions de souches génétiquement distinctes, le dépistage d’un phénotype souhaité demeure un obstacle important. Avec les techniques de dépistage existantes, il y a un compromis entre la production d’information et le débit, avec un dépistage à haut débit généralement effectué sur un produit d’intérêt. Par conséquent, nous présentons une approche pour accélérer le criblage des souches en adaptant le séquençage d’ARN à cellule unique aux colonies isogéniques de picoliter des souches génétiquement modifiées de levure. Pour relever les défis uniques de l’exécution du séquençage de l’ARN sur les cellules de levure, nous culture des colonies de levure isogéniques dans les hydrogels et le sphéroplast avant d’effectuer le séquençage de l’ARN. Les données de séquençage de l’ARN peuvent être utilisées pour déduire les phénotypes de levure et trier les voies d’ingénierie. L’évolutivité de notre méthode répond à une obstruction critique dans l’ingénierie microbienne.

Introduction

L’un des principaux objectifs de l’ingénierie microbienne est de modifier les microbes pour les inciter à produire des composés précieux1,2. S. cerevisiae a été le principal organisme d’ingénierie microbienne en raison de sa facilité de culture et de l’étendue des outils disponibles pour l’ingénierie de son génome3,4,5. Cependant, un obstacle reste dans l’exécution des écrans fonctionnels sur la levure modifiée: le débit de dépistage est à la traîne derrière l’ingénierie du génome par des ordres de grandeur. Le dépistage consiste généralement à isoler les souches dans les plaques de micro-puits et à les phénotquer en mesurant la production d’un composé spécifique6,,7. Le débit de ce processus est limité par les grandes quantités de réactif nécessaire pour apaiser les souches individuelles en cent réactions microlitres. La microfluidique des gouttelettes fournit une solution attrayante pour augmenter le débit de dépistage de levure par ordre de grandeur en réduisant les réactions normalement effectuées dans les plaques de puits8. Cependant, comme avec les écrans de plaque de puits, les écrans de gouttelette détectent typiquement des composés de produit simple, qui fournit des informations limitées dans la fonction globale de la voie d’ingénierie9,10,11.

Le séquençage de l’ARN (ARN-seq) peut permettre une caractérisation plus complète du fonctionnement de la voie en permettant d’évaluer simultanément les niveaux d’expression de tous les gènes pertinents12,13. En outre, les méthodes de gouttelette permettent à des milliers de cellules d’être profilées par expérience, fournissant le débit nécessaire pour filtrer les bibliothèques des variantes modifiées14,15. Cependant, les méthodes ARN-seq sont optimisées pour les cellules de mammifères; levure, en comparaison, ont moins d’ARNm par cellule et une paroi cellulaire qui est difficile à enlever16, empêchant leur séquençage par les méthodes existantes. Si une méthode de gouttelette à haut débit pouvait être conçue pour permettre la levure ARN-seq, elle fournirait une plate-forme de phénotypage évolutive, rentable et riche en informations pour l’ingénierie de levure.

Nous présentons un protocole détaillé de notre méthode récemment développée pour le séquençage des cellules de levure à l’aide de microfluidiques de gouttelette à haut débit17. Pour surmonter le défi de l’ARN limité, nous encapsulons et culture des cellules de levure unique dans les sphères hydrogel picoliter. La culture reproduit les cellules, donnant des centaines d’exemplaires partageant la même voie d’ingénierie; cela réduit la variation due à l’expression du gène à cellule unique tout en augmentant considérablement la quantité d’ARN disponible pour le séquençage. Après l’amplification basée sur la culture, nous sphéoplast les cellules, en enlevant la paroi cellulaire par digestion enzymatique en vrac. Les membranes cellulaires restent intactes, de sorte que chaque colonie isogénique et son ARNm associé restent encapsulés dans leurs sphères hydrogel. Cela nous permet de jumeler les colonies individuelles avec des réactifs de capture de l’ARNm et tampon de lyse, et l’ARNm à capturer, code à barres et séquencé à la suite du flux de travail Drop-Seq14. Notre méthode permet le dépistage à l’échelle du transcriptome de milliers de colonies de levure isogéniques par expérience.

Protocole

1. Fabrication d’appareils microfluidiques

  1. Su-8 master fabrication
    1. Concevez le masque négatif pour les canaux microfluidiques pour les appareils A et B(Fichier supplémentaire 1 et 2) à l’aide d’un logiciel de conception assisté par ordinateur et faites-les imprimer sur le film de circuit avec au moins 10 m de résolution.
    2. Placez une plaquette de silicium propre de 75 mm sur un manteau de rotation et versez environ 1 ml de SU-8 sur son centre. Allumez le vide pour fixer la plaquette au mandrin.
    3. Pour l’appareil A, manteau de spin SU-8 2150 à 500 tr/min pour 30 s, suivi de 30 s à 2 750 tr/min. Pour l’appareil B, spin-coat SU-8 2100 à 500 tr/min pour 30 s, suivi de 30 s à 2 500 tr/min. Cela donnera DES couches d’épaisseur SU-8 de 200 m et 120 m, respectivement.
    4. Retirer la plaquette du spin-coater et les déposer sur une plaque chauffante à 95 oC pendant 60 minutes au four mou.
    5. Retirer la plaquette de la plaque chauffante et laisser refroidir à température ambiante. Placez le masque sur la plaquette, et exposez sous un collimateur 190 mW, 365 nm UV LED pendant 2 min.
    6. Déposer la plaquette sur une plaque chauffante fixée à 95 oC pendant 5 minutes pour la cuisson par postexposure.
    7. Retirer la plaquette et laisser refroidir à température ambiante. Placer la plaquette dans un bain d’acétate d’éther de monomethyl de propylène glycol (PGMEA) pendant 20 min.
    8. Rincer la plaquette avec PGMEA suivie de l’isopropanol. Si des résidus opaques sont visibles au cours de ce processus, répétez le rinçage avec PGMEA et isopropanol. Aérer la plaquette.
    9. Placer la plaquette sur une plaque chauffante à 95 oC pendant 3 min.
    10. Retirer et placer la plaquette dans un plat Petri de 90 mm de diamètre.
  2. Moudimethylsiloxane (PDMS) coulée sur le maître SU-8
    1. Mélanger ensemble un rapport de masse de 10:1 de base en silicone à l’agent de durcissement. Degas le PDMS après le mélange pendant environ 30 min.
    2. Verser le PDMS dégazé sur le maître SU-8 jusqu’à ce qu’au moins une couche de 5 mm d’épaisseur soit formée au-dessus de la plaquette.
    3. Degas le PDMS sur le dessus de la plaquette pendant environ 30 min.
    4. Placer la plaquette dans un four à 65 oC pendant au moins 80 minutes pour guérir le PDMS.
    5. Découpez la dalle PDMS guérie de la plaquette.
    6. Placez la dalle PDMS avec les caractéristiques microfluidiques orientées vers le haut, et perforez les trous d’entrée et de sortie avec un poinçon de biopsie de 0,75 mm.
    7. Nettoyez une glissière en verre de 50 mm x 75 mm avec de l’isopropanol et retirez toute la poussière du côté microfluidique de la dalle PDMS avec du ruban adhésif.
    8. Exposez la glissière en verre nettoyée et la dalle PDMS avec les caractéristiques microfluidiques face à jusqu’à 100 Pa (1 mbar O2) plasma pendant 1 min.
    9. Placez la dalle PDMS avec les caractéristiques face vers le bas sur la glissière en verre pour permettre la liaison. Placer la lame dans un four à 65 oC pendant au moins 30 minutes pour compléter la liaison.
    10. Traiter tous les canaux microfluidiques en rinçant avec un liquide de traitement de surface fluoré. Cuire l’appareil dans un four à 65 oC pendant au moins 10 minutes pour évaporer le liquide.

2. Encapsulation de levure dans les hydrogels utilisant l’appareil A

  1. Prenez la levure de plus en plus dans une culture de suspension et compter sur un hémocytomètre.
  2. Résuspendez les cellules dans le phosphate tamponné saline (PBS) à une concentration d’environ 750 k/mL. Cela garantit que 30% des hydrogels auront une cellule de levure en eux. Seulement environ la moitié des cellules de levure se développent en colonies, ce qui conduit à 15 % des hydrogels contenant des colonies de levures.
  3. Mélanger l’agarose ultralow de point de fusion à 2 % w/v dans PBS et chauffer à 90 oC jusqu’à ce qu’elle soit fondue. Cela prend 10 min.
  4. Charger le mélange d’agarose dans une seringue avec un filtre attaché de 0,22 m dans une pompe à seringue devant le chauffe-espace fixé à 80 oC.
  5. Chargez une seringue remplie de la suspension de levure et une seringue contenant de l’huile fluorée avec 2% w/v fluorosurfactant ionique18 dans des pompes à seringues.
  6. Prenez le dispositif de fractionnement de goutte de coflow fait dans la section 1 et connectez le tube des seringues dans l’appareil. Guidez le tube de la sortie dans un tube conique de 15 ml dans un seau à glace pour la collecte des gouttes.
  7. Flux dans les trois solutions dans l’appareil avec les débits suivants:
    1. Flux de la suspension de levure avec le débit de 3 ml/h.
    2. Flux le mélange d’agarose à un débit de 3 ml/h.
    3. Écoulez l’huile fluorée à un débit de 15 ml/h.
  8. Recueillir environ 1 mL d’émulsion. Attendez 5 minutes supplémentaires pour permettre à l’agarose de se régler complètement.

3. Rupture et gel de lavage pour la culture

  1. Ajouter un volume égal de 20% de perfluorooctanol (PFO) dans l’huile fluorée à l’émulsion. Inverser le tube conique à quelques reprises pour permettre le mélange.
  2. Tourner vers le bas l’émulsion cassée à 2.000 x g pendant 2 min. Les gels granuleront au-dessus des phases d’huile et de PFO.
  3. Retirez la phase d’huile et ajoutez 2 ml de tampon TE-TW (10 mM Tris pH , 8,0, 1 mM EDTA, 0,01% Tween-20) pour resspendre les gels. Transférer la suspension dans un nouveau tube conique de 15 ml.
  4. Pelletez les gels comme dans l’étape 3.2 et lavez-les une fois de plus dans TE-TW pour un total de deux lavages.
  5. Retirer les gels supernatants et résuspendants dans 2 ml de supports. Transférer dans un tube de culture de 5 ml.
  6. Incuber à 30 oC pendant la nuit sous secouant.
    REMARQUE : Après l’incubation de nuit, les hydrogels à levures peuvent être maintenus à 4 oC pendant plusieurs jours.

4. lyse de colonie de levure

  1. Transférer les gels dans un tube conique de 15 ml et les hydrogels à granulés à 2 000 x g pendant 2 min.
  2. Laver les hydrogels dans PBS 2x.
  3. Laver dans 1x sphéroplasting tampon 1x.
  4. Effectuer une dilution 2-50x de l’enzyme de sphéroplastisme dans le tampon de sphéroplastisme et ajouter 1 mL aux hydrogels.
  5. Incuber à 37 oC pour 1 h. La levure traitée aura l’air plus transparente(figure 3A).
  6. Prenez le bas 0,8 mL de suspension hydrogel et transférer dans une seringue non plafonnée de 1 mL.
  7. Placez la seringue dans le support de seringue imprimé 3D(fichier supplémentaire 3) et tournez à 2 000 x g pendant 2 min. Cela entraînera les hydrogels de fermer le paquet dans la tête de seringue.

5. capture d’ARNm des colonies de levure lysed utilisant l’appareil B

  1. Prenez 240 000 perles Drop-Seq et transférez-les dans un tube conique de 15 ml.
  2. Gran Drop-Seq perles en tournant vers le bas à 1.000 x g pendant 1 min.
  3. Retirer les perles supernatantes et résuspendantes dans 2 ml de tampon de lyse de levure de 0,9x avec 500 mm de chlorure de sodium pour une concentration de suspension de perle de 120 000 perles/mL.
  4. Transférer la suspension de perle dans une seringue de 3 ml avec une barre de remuer insérée.
  5. Préparer une seringue contenant plusieurs millilitres de 2% w/v perfluoropolyether-polyethylene glycol (PFPE-PEG) surfactant dans l’huile fluorée.
  6. Évacuer toute la tête aqueuse de la seringue contenant des hydrogels serrés et couronner la seringue.
  7. Insérez l’hydrogel, la suspension de perle et les seringues à huile dans les pompes à seringue et connectez-vous par tuyauterie dans le dispositif d’encapsulation fabriqué à la section 1.
  8. Connectez-vous à partir de la sortie tubing dans un tube conique de 50 mL sur la glace.
  9. Flux dans les trois solutions dans l’appareil avec les débits suivants:
    1. Flux les hydrogels à 0,4 mL/h.
    2. Flux de la suspension de perle à 0,4 mL/h.
    3. Flux de l’huile fluorée à 1,6 mL/h.
  10. Recueillir 1 mL d’émulsion ou faire fonctionner l’appareil jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’hydrogels à gauche.

6. génération d’ADNC, préparation de bibliothèque de séquençage, et séquençage

  1. Ajouter 30 ml de tampon SSC 6x et 1 ml de PFO à l’émulsion recueillie comme indiqué dans le protocole Drop-Seq14.
  2. Continuez à suivre le protocole Drop-Seq pour générer l’ADNM à partir de l’ARNm capturé sur les perles, la préparation de la bibliothèque de séquençage et l’analyse des données de séquençage.

Résultats

Nous avons adapté le flux de travail Drop-Seq14 déjà publié pour le séquençage isogénique de colonie (ICO-seq) pour effectuer le profilage d’expression génique des colonies de levure isogéniques. Nous avons isolé des cellules de levure unique et les avons encapsulées en microgels agaroses (figure 1A). Après l’incubation de nuit des microgels, ces cellules de levure encapsulées se sont développées en colonies isogéniques. Avant de charger des gels dans un deuxième dispositif microfluidique pour la capture de l’ARNM, nous avons digéré la paroi des cellules de levure pour rendre l’ARNm plus accessible(figure 1B, à gauche). Nous avons emballé ces microgels et fusionné les perles de capture de l’ARNm et tampon de lyse. Certaines gouttelettes contenaient exactement une perle jumelée à une colonie de levures lysed. Toutes les perles de l’émulsion ont été recueillies et l’ADP synthétisée et séquencée suivant le protocole Drop-Seq.

Nous avons généré des colonies de levure isogéniques par l’encapsulation de cellules de levure unique dans les microgels agaroses utilisant un dispositif microfluidique de coencapsulation avec un splitter de huit gouttes attaché (figure 2A). Nous avons dilué la suspension de levure d’entrée à une concentration de 750 000 euros/mL de sorte que 30 % des microgels ont exactement une levure en eux. Avant d’insérer l’agarose de température de fonte ultralow dans l’appareil, nous l’avons dissoute à une température élevée et maintenu la seringue à cette température pour prévenir la gélification prématurée. À la jonction de la génération de gouttes(figure 2B), les cellules de levure ont d’abord été encapsulées en gouttelettes de 160 m. Après la jonction de la génération de gouttes, un diviseur à huit reprises a divisé ces gouttelettes en huit gouttelettes de 80 m(figure 2C). Un filtre à seringue a été fixé à l’agarose fondue pour empêcher les sabots de se former dans les canaux, qui peuvent être aussi étroits que 37 m pendant le drop-splitting. Nous avons recueilli l’émulsion sur la glace, qui a immédiatement commencé le processus de gélification de l’agarose. Nous avons calculé la polydispersité d’une émulsion typique à 6 %(figure supplémentaire 1), bien que les valeurs de polydispersion jusqu’à 10 % soient acceptables. Une fois les gels d’agarose réglés, nous avons cassé l’émulsion et enlevé la phase d’huile. Les gels ont été lavés dans un tampon aqueux avant l’immersion dans les médias de croissance. L’incubation nocturne des microgels a entraîné la croissance de colonies isogéniques dans certains microgels(figure 2D). Le pourcentage d’hydrogels contenant des colonies d’au moins 20 cellules dépendait des conditions culturelles, y compris le temps d’incubation et la composition des médias. Dans notre démonstration à l’aide de C. albicans, nous avons déterminé qu’environ 15 % des hydrogels contenaient une colonie après 20 h de culture de suspension.

Un deuxième dispositif de coencapsulation a extrait l’ARNm des colonies isogéniques(figure 3A). Avant de charger les microgels de levure dans le dispositif microfluidique, nous avons lavé et immergé les gels dans une solution pour digérer les parois des cellules de levure. Une bonne digestion des cellules de levure a été vérifiée par microscopie, avec la levure traitée ayant une morphologie plus réfléchissante(figure 3B). Nous avons emballé les microgels dans une seringue et accordé le taux de débit d’entrée gel de telle sorte qu’un gel était dans chaque goutte. Un flux de perles de capture d’ARNm dans un tampon de lyse mélangé avec le flux de gel à emballage étroit avant la jonction de chute(figure 3C). Nous avons recueilli une émulsion résultante de 160 gouttelettes de m, et les colonies ont commencé à lyse et libérer leur contenu cellulaire. Nous avons chargé des perles à une dilution limitante pour minimiser le nombre de gouttes contenant plusieurs perles, mais l’emballage rapproché des gels pendant la fabrication des gouttes a entraîné environ 10% des gouttes collectées contenant une perle avec une colonie lysed(figure 3D).

Nous avons analysé l’expression génique de C. albicans, une espèce de levure présente dans le microbiome intestinal humain, en utilisant le flux de travail ICO-seq. C. albicans est noté pour sa capacité à basculer entre deux états cellulaires différents, appelés blancs etopaques 19. Nous utilisons une souche d’albicans C, souche RZY122, qui remplace une copie du gène WH11, uniquement active dans les cellules blanches avec YFP20. Nous avons obtenu un ensemble de profils d’expression génique en utilisant le flux de travail et les avons utilisés pour l’analyse des colonies exprimant au moins 300 gènes uniques. En tant qu’ensemble de données de référence, nous avons utilisé des données d’expression C. Albicans obtenues à partir d’une étude antérieurement publiée17 et filtré des colonies exprimant moins de 600 gènes uniques. Après avoir effectué l’analyse principale de composant (PC) et une réduction de dimensionnalité t-stochastic de voisin (tSNE)21, nous avons trouvé la concordance générale entre notre jeu de données d’échantillon et la référence(figure 4A). L’analyse de PC a révélé que YFP et WH11 ont contribué de manière significative aux deux premiers PC. De plus, l’analyse de tSNE a révélé trois grappes(figure 4B). Tandis que le cluster 2 était principalement composé des cellules du jeu de données d’échantillon, les grappes 0 et 1 étaient composées des cellules des deux échantillons. En superposant l’expression WH11 sur le tSNE(figure 4C, panneau supérieur), nous avons déterminé que l’amas 1 contenait probablement des colonies blanches. Nous avons également constaté que l’expression STF2 a augmenté dans le cluster 1(figure 4C, panneau inférieur), compatible avec les données précédemment obtenues17. Dans les grappes 0 et 2, WH11 et STF2 ont été considérablement réglementés par rapport au cluster 1(figure 4D). Les gènes impliqués dans la fermentation, tels que ADH1, ont été régulés en cluster 0, compatibles avec les études précédentes des cellules opaques22. Nous avons constaté que les colonies dans le groupe 2 avaient diminué l’ARN ribosomal comparé aux colonies dans les grappes 0 et 1. Bien que l’échantillon et les ensembles de données de référence aient été obtenus à l’aide du même stock de cellules, ce résultat suggère que même des différences subtiles dans la manipulation expérimentale peuvent affecter l’expression des gènes.

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Figure 1 : Aperçu du flux de travail ICO-seq. (A) La levure de culture dans une culture de suspension ont été diluées dans le tampon et coencapsulées avec l’agarose fondue dans un dispositif de générateur de gouttelettes de débit-focalisé pour permettre le chargement de Poissons des microgels agarose avec des cellules de levure simples. Les gels réglés lorsque l’agarose s’est refroidie, la suspension huile/eau a été cassée, et l’huile a été enlevée, ce qui a donné une suspension de perles de gel dans l’eau. Après la culture du jour au lendemain, les cellules de levure sont devenues des colonies isogéniques dans les microgels. (B) Les colonies ont été soumises à un tampon de dégradation de la paroi cellulaire, après quoi ils ont été emballés à proximité et coencapsulés avec des perles de capture d’ARNm dans un deuxième dispositif microfluidique. L’emballage rapproché des microgels a permis à chaque goutte d’avoir un gel, tandis que le chargement des perles par Poisson réduisait le risque de perles multiples en une seule goutte. Des gouttes collectées ont été traitées pour la synthèse de l’ADN et la génération d’une bibliothèque de séquençage. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 2 : Génération de colonies de levure isogéniques à l’intérieur de microgels agaroses utilisant l’appareil A. (A) Schéma de dispositif microfluidique, montrant l’emplacement des trois intrants et ports de sortie. La jonction de drop-making est mise en évidence en rouge. (B) Plan rapproché de la jonction de drop-making pendant le fonctionnement normal de l’appareil. (C) Micrographe de gouttelettes collectées, avec un gros plan d’une gouttelette contenant une cellule encapsulée (encart). (D) Micrographe des colonies de levure isogéniques dans les microgels agaroses après une incubation de 24 heures, avec un gros plan de deux colonies (encart). Toutes les barres d’échelle à 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 3 : Capture de Lysis et d’ARNm des colonies isogéniques utilisant l’appareil B. (A) Schéma de dispositif microfluidique, montrant l’emplacement des trois intrants et ports de sortie. La jonction de drop-making est mise en évidence en rouge. (B) Micrographe des colonies de levures suivant la digestion de mur cellulaire, avec un gros plan d’une colonie (encart). (C) Plan rapproché de la jonction de drop-making pendant le fonctionnement normal de l’appareil. (D) Micrographe des émulsions recueillies suivant le jumelage de microgel et de perles, avec un gros plan montrant une goutte avec une perle et une colonie lysed (encart). Toutes les barres d’échelle à 100 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 4 : Analyse de la réponse de commutation blanc-opaque dans C. albicans. (A) tSNE parcelle d’un ensemble de données d’échantillon combiné avec un jeu de données de référence de Liu17. (B) Le regroupement des transcriptomes révèle trois clusters visualisés sur une parcelle tSNE. (C) Les gènes clés impliqués dans la réponse de commutation blanc-opaque ont contribué à la variation déterminée par l’analyse principale des composants. (D) Parcelles de violon des niveaux d’expression normalisés de YFP et WH11 par des grappes marquées sur la parcelle tSNE. indique p 'lt;lt;'lt; 0.05 et ' indique p 'lt;lt; 0.05. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Chiffres supplémentaires 1 et 2. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ces filgures.

Fichiers supplémentaires 1-3. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ces fichiers.

Discussion

Notre méthode pour le séquençage isogénique de l’ARN de colonie de levure (ICO-seq) adapte une plate-forme publiée de séquençage d’ARN à cellule unique, Drop-Seq, pour le criblage à haut débit des souches de levures d’ingénierie. Les cellules de levure contiennent moins de 10% des copies de l’ARNm d’une cellule typique de mammifères et ont une paroi cellulaire qui doit être dégradée avant la capture de l’ARNm16. Ces deux facteurs empêchent l’application directe de la levure à Drop-Seq ou à d’autres plates-formes scRNA-seq à base de gouttelettes. Pour résoudre ces problèmes, nous encapsulons des cellules uniques dans les hydrogels et les cultivons en colonies pour fournir suffisamment de matériel d’entrée pour le séquençage de l’ARN et nous digérons la paroi des cellules de levure pour générer des sphéoplastes avant la lyse et la capture de l’ARNm. Ces changements ajoutent une complexité supplémentaire dans le flux de travail ICO-seq par rapport au flux de travail Drop-Seq d’origine et sont des étapes critiques que les utilisateurs doivent s’assurer de procéder en douceur.

Un bon fonctionnement de l’appareil A est nécessaire pour encapsulant des cellules à levures uniques dans des hydrogels agaroses. Un bon comptage de la suspension de levure d’entrée doit être suivi pour minimiser le nombre d’hydrogels avec plus d’une cellule de levure, tout en veillant à ce que suffisamment d’hydrogels contiennent une seule cellule pour assurer une efficacité raisonnable de capture cellulaire pendant la capture de l’ARNm. Pendant le fonctionnement de l’appareil microfluidique, le mélange de gel d’agarose doit être bien dissous et passé par un filtre de seringue pour minimiser les risques de colmatage de l’appareil. Le mélange de gel d’agarose est visqueux et la région dans laquelle un seul canal se divise en huit est particulièrement sujette à l’engorgement. En centré une caméra haute vitesse pour visualiser le fonctionnement de l’appareil dans cette région de l’appareil, les utilisateurs peuvent surveiller l’uniformité des gouttelettes émergeant de chacun des huit canaux et réagir rapidement si l’uniformité change en raison de sabots dans l’un des canaux. L’inspection d’une petite quantité d’émulsion recueillie sous le microscope fournit une méthode secondaire pour confirmer une émulsion de haute qualité.

Suite à la croissance des colonies de levures à l’intérieur des hydrogels, plusieurs précautions sont nécessaires pour assurer l’extraction de qualité de l’ARNm au niveau de la colonie unique. Il est important d’optimiser le temps que la levure est dans la culture hydrogel, parce que si la levure sont laissées dans la culture pendant trop longtemps, beaucoup échapperont aux limites des hydrogels, conduisant à un signal de fond plus élevé pendant le séquençage de l’ARN et une sensibilité plus faible lors de la discrimination entre les types de cellules. Une bonne génération de sphéoplastes à l’aide de Zymolyase garantit que l’ARNm sera libéré après l’exposition cellulaire au tampon de lyse. L’inspection visuelle des colonies de levure suivant Zymolyase devrait donner des cellules de levure plus brillantes. Une mauvaise digestion des parois cellulaires entraînera une efficacité de capture d’ARN plus faible. Enfin, les hydrogels doivent être emballés à proximité lorsqu’ils sont injectés dans l’appareil B. La surveillance de l’entrée hydrogel avec une caméra à grande vitesse permettra la fin de la collecte d’émulsion une fois que les hydrogels ne seront plus emballés sur l’entrée dans l’appareil, sinon l’efficacité de capture sera affectée.

Une préoccupation potentielle avec notre méthode est que la culture microgel de levure peut modifier considérablement l’expression des gènes. Les travaux précédents d’étude de l’expression de gène de levure dans les microgels et sur l’agar démontrent des différences dans les moyennes d’expression de gène mais dans l’ensemble une corrélation positive17, bien que l’étude plus poussée de cette réclamation sur une série de souches de levure est prudente. La méthode a également une efficacité limitée de capture cellulaire due à la charge stochastique des perles de capture d’ARNm suivant les statistiques de Poisson14. Actuellement, environ 10 % des gouttes contiennent une perle et une colonie, et le taux de double encapsulation devrait être inférieur à 1 %. Les doubles encapsulations conduisent à confondre les éléments lors de l’analyse des données RNA-seq et leur filtrage reste difficile23; un taux de capture de 25 % entraînerait une augmentation correspondante des doubles encapsulations à 5 %(figure supplémentaire 2). Bien que nous démontrons ICO-seq en utilisant la plate-forme Drop-Seq, il existe d’autres plates-formes RNA-seq gouttelettes qui introduisent des perles de capture de l’ARNm déterministiquement plutôt que statistiquement, telles que la plate-forme Chromium15,24de Génomique 10x disponible dans le commerce. L’intégration de ces plates-formes avec ICO-seq pourrait accroître l’efficacité de capture au-delà de ce que les statistiques de Poisson permettent. Enfin, une limitation fondamentale de l’ARN-seq gouttelette est l’incapacité de récupérer les cellules d’intérêt après le séquençage. Cette limitation doit être prise en compte lors de l’examen des types de bibliothèques de levures à analyser à l’aide de cette méthode.

L’hétérogénéité de cellule à cellule a été démontrée au niveau clonal pour des microbes tels que E. coli25 et S. la 26erévélant une nouvelle cellule indique qu’une analyse au niveau de la masse masquerait autrement. Les analyses d’ARN-seq en vrac effectuées sur C. albicans ont tendance soit à examiner les changements de transcriptome à l’échelle de la population, soit les cellules blanches et opaques comme deux populations distinctes27,28. L’application de l’ICO-seq pourrait conduire à la découverte de sous-états supplémentaires et fournir un cadre analytique pour la découverte de nouveaux états cellulaires au sein d’autres espèces de levures. Cependant, la croissance des cellules dans les hydrogels ne se limite pas à la levure: d’autres types de cellules, tels que les mammifères, bactériennes, et d’autres cellules fongiques peuvent également être cultivés dans les hydrogels29,30. Le séquençage des colonies isogéniques par rapport aux cellules individuelles conduit à la moyenne du bruit biologique dû à la variation de cellule à cellule, améliorant la discrimination entre les types de cellules. Cela peut aider lors de l’analyse des cellules où la diversité génétique se concentre sur des voies de synthèse spécifiques. Les possibilités élargies d’entrée de type cellulaire à ICO-seq et son intégration potentielle avec les plates-formes d’ARN-seq de gouttelettes disponibles dans le commerce positionne ICO-seq comme une plate-forme prometteuse pour disséquer l’hétérogénéité cellulaire au niveau génétique.

Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce projet a été soutenu par le National Science Foundation Career Award DBI-1253293, national Institutes of Health New Innovator Award DP2AR068129 et la subvention R01HG008978, la National Science Foundation Technology Center subvention DBI-1548297, et l’UCSF Center for Cellular Construction. ARA et ZJG sont des enquêteurs de Chan-Zuckerberg Biohub.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Filtre à seringue de 0,22 umMilipore SigmaSLGP033RS
0,5M EDTA, pH 8,0Thermo-Fisher15575020Utilisé pour fabriquer un tampon TE-TW
Poinçon de biopsie de 0,75 mmWorld Precision Instruments504529
Seringues de 1 mLBD309628
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)Sigma-Aldrich370533
1M Tris-HCI, pH 8.0Thermo-Fisher15568025Utilisé pour fabriquer des aiguilles de calibre 27 tampon TE-TW
des seringues de 3 mL
des plaquettes de silicone de 3 po, de type P, vierge de qualité d’essaiUniversity Wafers447
porte-seringue centrifuge imprimé en 3D(personnalisé)(personnalisé)Voir les fichiers supplémentaires pour fichier d’impression 3D
Agarose, basse température de gélificationSigma-Aldricha9414
Aquapel (traitement hydrophobe du verre)Pittsburgh Glass Works47100
Drop-Seq BeadsChemGenesMACOSKO-2011-10
Lames de microscope en verre (75 mm x 50 mm)Corning294775X50
Tensioactifionique KrytoxInstructions de synthèse en réf 14. Peut être remplacé par un tensioactif PEG-PFPE.
IsopropanolSigma-Aldrich109827
NaClSigma-AldrichS9888
Novec 75003M98-0212-2928-5Communément appelé HFE 7500
PBSFisher ScientificBP243820
PE-2 tube en polyéthylèneScientific CommoditiesB31695-PE/2
PEG-PFPE tensioactifRan Biotechnologies008-FluoroSurfactant
PGMEA développeurSigma-Aldrich484431
PhotomasksCadArt Servcies(custom)Voir les fichiers supplémentaires pour les conceptions de masques
Spin coaterSpecialty Coating SystemsG3P-8
SSC BufferSigma-AldrichS6639
SU-8 2100MicroChem
SU-8 2150MicroChemY111077
Sylgard 184 kit d’élastomère de siliconeKrayden4019862
Tween-20Sigma-AldrichP1379Utilisé pour la fabrication du tampon TE-TW
YR Tampon de digestionZymo ResearchR1001-1Tampon de shérosablage
YR Tampon de lyseZymo ResearchR1001-2
ZymolyaseZymo ResearchE1005Mélange d’enzymes de sphhéroslasting
305109 BD 309657 Y111075

Références

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Mots-clés

S quen age de l ARN par gouttelettesCriblage haut d bitEncapsulation dans un hydrogelSph roplastie de la levureDispositif microfluidiqueProtocole Drop seqSynth se d ADNcAnalyse en composantes principalesR duction de la dimensionnalit tSNE

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