Manipulation optogénétique de l’activité neuronale pour moduler le comportement chez les souris en mouvement libre

Résumé

Avec la manipulation optogénétique de populations neuronales spécifiques ou de régions du cerveau, le comportement peut être modifié avec une résolution temporelle et spatiale élevée chez les animaux en mouvement libre. En utilisant différents outils optogénétiques en combinaison avec des fibres optiques implantées chroniquement, une variété de modulations neuronales et de tests comportementaux peuvent être effectuées.

Résumé

La modulation optogénétique des circuits neuronaux chez les souris en mouvement libre affecte le comportement aigu et à long terme. Cette méthode est capable d’effectuer des manipulations de neurones simples et de libération d’émetteurs spécifiques à la région, jusqu’à des circuits neuronaux entiers dans le système nerveux central, et permet la mesure directe des résultats comportementaux. Les neurones expriment les outils optogénétiques par injection de vecteurs viraux porteurs de l’ADN de choix, tels que Channelrhodopsin2 (ChR2). La lumière est apportée dans des régions spécifiques du cerveau par l’intermédiaire d’implants optiques chroniques qui se terminent directement au-dessus de la région cible. Après deux semaines de récupération et une bonne expression d’outil, les souris peuvent être utilisées à plusieurs reprises pour des tests comportementaux avec la stimulation optogénétique des neurones d’intérêt.

La modulation optogénétique a une haute résolution temporelle et spatiale qui peut être accomplie avec une spécificité cellulaire élevée, par rapport aux méthodes couramment utilisées telles que la stimulation chimique ou électrique. La lumière ne nuit pas aux tissus neuronaux et peut donc être utilisée pour des expériences à long terme ainsi que pour de multiples expériences comportementales chez une souris. Les possibilités d’outils optogénétiques sont presque illimitées et permettent l’activation ou le silence de neurones entiers, ou même la manipulation d’un type de récepteur spécifique par la lumière.

Les résultats de telles expériences comportementales avec la stimulation optogénétique intégrée visualisent directement les changements de comportement causés par la manipulation. Le comportement du même animal sans stimulation lumineuse comme ligne de base est un bon contrôle pour les changements induits. Cela permet une vue d’ensemble détaillée des types neuronaux ou des systèmes de neurotransmetteurs impliqués dans des comportements spécifiques, tels que l’anxiété. La plasticité des réseaux neuronaux peut également être étudiée en détail par la stimulation à long terme ou des observations comportementales après la stimulation optique. L’optogénétique aidera à éclairer la signalisation neuronale dans plusieurs types de maladies neurologiques.

Introduction

La modulation des circuits neuronaux dans le système nerveux central et leurs résultats comportementaux sont importants pour comprendre comment le cerveau fonctionne, en particulier dans les maladies psychiatriques et les tâches cognitives telles que l’apprentissage et la mémoire. Avec l’optogénétique, les cellules individuelles ou les populations cellulaires jusqu’à des circuits entiers peuvent être modulées par la lumière. Les outils optogénétiques courants comme Channelrhodopsin2 (ChR2) ou Archaerhodopsin (Arch) sont capables d’activer ou de réduire au silence les neurones, ou d’augmenter ou d’inhiber la libération d’émetteur aux terminaux d’axon qui se projettent vers des régions distinctes du cerveau^1,2,3,4. Cependant, Arch doit être utilisé avec soin car il a été démontré que son activation aux terminaux présynaptiques augmente la libération spontanée de l’émetteur⁵. Arch est une pompe à protons rectifiante vers l’extérieur qui modifie la valeur du pH à l’intérieur de la cellule. Ce milieu alcalin induit l’afflux de calcium et améliore la libération de l’émetteur⁵. Pour moduler spécifiquement les voies de signalisation intracellulaire, les chimères récepteurs composées d’un outil optogénétique activateur léger, comme la rhodopsine ou la cône opsine, en conjonction avec un récepteur couplé à la protéine G adéquat, peuvent être créées^6,,7,8. La quantité et la variation des outils optogénétiques disponibles ont considérablement augmenté au cours de la dernière décennie⁹.

Le but de l’optogénétique est de manipuler les circuits neuronaux pendant le comportement. L’optogénétique permet, par exemple, la mesure des changements comportementaux aigus tels que les changements dans le comportement anxieux. Les outils optogénétiques sont livrés dans les régions cibles du cerveau par l’intermédiaire de vecteurs viraux. Avec l’aide de promoteurs et d’exhausteurs spéciaux, ou du système Cre-loxP, la spécificité du type de cellule peut être assurée pour l’expression d’outils optogénétiques (Figure 1A). Il existe plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées exprimant l’enzyme Cre-Recombinase dans des types de cellules spécifiques seulement. Par exemple, les souris Nex-Cre expriment la Cre-Recombinase dans les neurones pyramidaux du cortex et de l’hippocampe sous le contrôle du Nex-promotor¹⁰. Cette enzyme est capable d’inverser les séquences d’ADN, qui sont flanquées de côtés loxP¹¹. Par conséquent, la séquence d’ADN d’un outil optogénétique à double floxé, qui est inversé et flanqué de côtés loxP, ne peut être transcrite que par des neurones qui possèdent le Cre-Recombinase, mais pas par d’autres types neuronaux^12,13. Dans le cas des souris Nex-Cre, l’outil optogénétique sera uniquement exprimé dans les neurones pyramidaux. La stimulation lumineuse de certaines régions du cerveau est ensuite réalisée par l’implantation chronique de fibres optiques directement au-dessus de la région d’intérêt. Les animaux peuvent alors être couplés à une source de lumière appropriée et se comporter librement dans presque toutes sortes de tests comportementaux.

Figure 1 : Injection et implantation. A) Système Cre-loxP pour ChR2-YFP. Double outil optogénétique floxé est emballé dans un virus adéno associé (AAV) pour l’injection dans le tissu cérébral. B) Vue sagittale de l’injection et de l’implantation d’une interface neuronale optique dans/au-dessus de la région IL du mPFC. L’injection et l’implantation ont été faites d’en haut. Toutes les régions d’intérêt, IL, BLA et DRN, sont présentées. C) Vue détaillée de la fibre optique implantée, de la manche et de la source lumineuse. D) Diffusion de la stimulation de lumière laser bleue et rouge dans le tissu cérébral de matière grise à partir d’une fibre lumineuse de 200 μm (Yizhar et al., 2011). La lumière bleue se propage, au maximum, 0,5 mm dans le tissu, la lumière rouge d’environ 1 mm. Codage de couleur : rouge 50%, jaune 10%, vert 5%, bleu 1% si la lumière atteint cette zone. E) Vue coronale de l’implantation unilatérale directement au-dessus de l’IL gauche avec une fibre optique de 200 μm. La région IL a une largeur de 0,25 mm dans chaque hémisphère et une profondeur de 0,2 mm. Les ampoules bleues et rouges sont le pensionnaire de 5% d’épandage de lumière et sont transférées de Yizhar et al à la bonne taille. LoxP: locus de X-over P1; ChR2: Channelrhodopsin; YFP : protéine fluorescente jaune; dflox: double floxed; IL : cortex infralimbique ; BLA: amygdale basolaterale; DRN: noyaux de raphe dorsal; PrL: région prélimbique. Ce chiffre a été modifié par Berg 2019⁴⁸. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Les approches optogénétiques sont utilisées car elle permet à la fois une haute résolution temporelle et spatiale¹⁴ et une modulation spécifique de type cellulaire. En outre, il est possible d’utiliser de façon répétitive le dispositif implanté sans autre traitement. Après une chirurgie stéréotaxique, où l’injection d’un virus adéno-associé portant l’outil optogénétique et l’implantation de la fibre optique est effectuée, les souris peuvent récupérer pendant deux semaines. Nous avons choisi un temps de récupération de seulement 2 semaines, parce que c’est assez de temps pour récupérer de la chirurgie et pour le virus à exprimer. Comme les expériences comportementales sont suivies par l’immunohistorique, nous devons nous assurer que les souris ne deviennent pas trop vieux pendant l’expérience; sinon, la qualité des tissus est diminuée. Ils ne montrent aucune déficience comportementale évidente de l’implant et s’engagent dans le comportement typique de cage. Bien sûr, l’implantation est accompagnée d’une lésion chirurgicale significative; par conséquent, les souris sont surveillées intensivement. Après la chirurgie, les souris doivent être logées seules, car les souris logées en groupe ont tendance à se blesser mutuellement des blessures et des implants frais. Cependant, les conditions de logement ont un grand impact sur le niveau d’anxiété des souris mâles, comme les souris logées simples montrent des niveaux d’anxiété^{inférieurs 15} et en général moins dépressif-comme des symptômes¹⁶.

La manipulation chimique ou électrique des circuits cérébraux n’a pas la spécificité élevée du type cellulaire de l’optogénétique et ont une résolution temporelle et spatiale inférieure^14,17,18. Selon la question expérimentale, la stimulation électrique ou chimique peut avoir des avantages différents. Lorsque les bornes de fibre de passage dans une région spécifique doivent également être stimulées, la stimulation électrique est la meilleure méthode. La stimulation chimique est un bon choix pour quand les récepteurs spécifiques d’émetteur dans toute une région devraient être activés par des agonistes. Un autre grand avantage de l’optogénétique par rapport à la stimulation chimique ou électrique est que endogènement, les neurones ne sont pas sensibles à la lumière, ce qui évite l’apparition d’effets secondaires¹⁹. En effet, les intensités lumineuses élevées pourraient induire des effets de chauffage^8,20, mais en raison des groupes témoins appropriés, les effets comportementaux dus à la manipulation optogénétique peuvent être éliminés.

L’étude du comportement des rongeurs, en particulier en ce qui concerne les maladies psychiatriques, s’est grandement améliorée avec l’optogénétique chez les animaux en mouvement libre, car elle permet la modulation directe des récepteurs uniques jusqu’à des populations cellulaires spécifiques²¹ et circuits²². La possibilité de mesurer les effets aigus de telles modulations, ainsi que les effets comportementaux à long terme après un temps défini²³ ou après la stimulation chronique²⁴, permet une grande flexibilité des conceptions expérimentales et fournit des informations très détaillées sur les circuits cérébraux. La stimulation lumineuse peut être utilisée pour moduler les neurones situés au site d’injection de l’outil optogénétique. Lorsque l’injection et l’implantation s’adressent à la même région du cerveau, les corps cellulaires et le dos projetant des axones de neurones de principe et d’interneurones dans cette région peuvent être ciblés^3,6,8. Cependant, la fibre lumineuse peut également être implantée dans une région différente de celle injectée. Dans ce cas, la stimulation lumineuse peut moduler la libération de l’émetteur dans les terminaux d’axone dans les zones de projection de la région injectée^25,26,27.

Dans l’étude ici, l’optogénétique est utilisé en combinaison avec des expériences pour analyser le comportement lié à l’anxiété. Les maladies psychiatriques liées à l’anxiété touchent plus d’un tiers de la population mondiale^{de 28,29,30} et causent un lourd fardeau économique³¹. Les personnes touchées souffrent d’un sentiment d’excitation, de tension et d’inquiétude suivi d’un comportement d’évitement^32,33. Ces émotions négatives chroniques, qui sont principalement axées sur les événements futurs³⁴, interfèrent fortement avec la vie quotidienne des patients. Les traitements courants comme les benzodiazépines ou les inhibiteurs sélectifs du recaptage de la sérotonine (ISRS) ne sont efficaces que chez certains patients. Un grand nombre de personnes ne répondent pas au traitement à tous les³⁵, montrant que le mécanisme sous-jacent à ces maladies n’est pas encore pleinement compris. Le cortex préfrontal médial (mPFC) est connu pour jouer un rôle important dans le développement et la manifestation de l’anxiété^{21,25,27,36,37,38}. Plus précisément, la suractivation de la région du cortex infralimbique (IL) dans le mPFC pourrait faire partie des troubles liés à l’anxiété^39,40. L’exemple décrit ici pourrait aider à comprendre comment les modulations dans la région IL du mPFC influencent le comportement anxieux. En outre, l’élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les maladies psychiatriques liées à l’anxiété peut également être soutenue.

2-6 mois mâles Nex-Cre souris sont utilisés pour exprimer ChR2 spécifiquement dans les neurones pyramidaux dans la région IL de la mPFC⁴¹. Les souris Nex-Cre ont un fond C57Bl/6 et expriment l’enzyme Cre-recombinase spécifiquement dans les neurones pyramidaux. Au cours d’une chirurgie stéréotaxique, le chR2-ADN à double floxé est injecté dans la région IL par l’intermédiaire de vecteurs viraux associés à l’adéno. L’implant optique est placé directement au-dessus de la région d’intérêt (Figure 1B) et l’implant est fixé avec du ciment dentaire. Les animaux témoins reçoivent une injection de tdTomato-ADN à double floxé dans la même région pour imiter l’expression spécifique à la cellule.

Les animaux sont logés en groupe jusqu’au jour de la chirurgie et sont ensuite logés seuls pour éviter les blessures d’autres souris. Les souris sont logées dans des grilles individuelles en cage ventilée (IVC) dans des cages TypI-L pour les souris seules logées. Le cycle lumière-obscurité suit un rythme de 12:12 h, la phase de lumière à partir de 10 h. Toutes les expériences comportementales sont effectuées dans la phase sombre, qui ressemble à la phase active des rongeurs. De l’eau et des granulés alimentaires standard sont disponibles ad libitum. Après deux semaines de récupération, ce qui assure une expression suffisante de ChR2 dans les neurones pyramidaux, les souris sont utilisées pour des expériences comportementales.

Le champ ouvert (OF) est un labyrinthe de 50 cm x 50 cm carrés avec des murs sablés de 40 cm de haut. Le sol est divisé en 16 carrés où les 4 intérieurs représentent le centre. Le comportement mesuré est : 1) le temps passé dans le centre, 2) le nombre d’entrées centrales, et 3) la distance totale déplacée. Au cours de cette expérience, il y a 4 essais totalisant 20 minutes. Dans les essais 1 et 3, aucune stimulation lumineuse ne se produit, et dans les essais 2 et 4, une stimulation de 20 Hz avec 5 ms d’impulsion lumineuse et 1 mW d’intensité lumineuse de 473 nm est effectuée (Figure 2A). Dans les essais ultérieurs, l’accoutumance à la zone d’essai a été prise en compte, mais l’utilisation d’animaux témoins sous injection simulée indique comment l’accoutumance est exprimée.

Le labyrinthe barnes est une expérience pour l’apprentissage et la mémoire. Il s’agit d’une plate-forme circulaire de 92 cm de diamètre et contient 20 trous d’équidistant autour de la circonférence. 19 des trous sont fermés et sous un trou une boîte d’évacuation est présentée. Pendant 4 jours consécutifs, les souris ont 4 essais de formation pour apprendre l’emplacement de la boîte d’évasion. Le^5ème jour, la boîte d’échappement est enlevée, et les souris sont testées sur combien de temps ils ont besoin pour trouver le trou correct. Le comportement mesuré est : 1) Temps jusqu’à ce que la boîte d’échappement/trou correct soit trouvée, 2) Nombre de visites et d’erreurs cibles, et 3) Distance déplacée jusqu’à ce que dans la zone d’échappement. La stimulation lumineuse dans différents groupes se fait soit lors de l’acquisition ou de la consolidation, qui ont lieu les jours de formation 1-4, ou lors de la récupération le jour d’essai, qui est le jour 5 (Figure 2D).

Figure 2 : Expériences comportementales avec des protocoles optogénétiques. A) Dessin schématique de l’expérience Open Field avec le protocole de stimulation lumineuse correspondant. C) Dessin schématique de l’expérience Elevated-Plus Maze avec le protocole de stimulation lumineuse correspondant. D) Dessin schématique de l’expérience Barnes Maze avec le protocole de stimulation lumineuse correspondant. EPM: Déhéated-Plus Maze; OF: Open Field; BM: Barnes Maze Test. Ce chiffre a été modifié par Berg 2019⁴⁸. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Pour la stimulation optogénétique, l’intensité et la fréquence lumineuses doivent être adaptées à l’outil optogénétique et au type neuronal qui fait l’objet d’une étude. L’intensité lumineuse la plus faible possible devrait être utilisée afin d’éviter des dommages au tissu, car plusieurs études ont montré qu’il y a des effets de chauffage possibles dus à une forte intensité lumineuse^8,,20. Pour chR2, une stimulation de 20 Hz avec une impulsion lumineuse de 5 ms est couramment utilisée². Comme le ChR2 est très sensible à la lumière, 1 mW d’intensité lumineuse est suffisante. Le protocole de stimulation lumineuse alterne entre la lumière éteinte et les essais pour mesurer directement les changements comportementaux. Les conditions extérieures de pièce pour les expériences comportementales devraient rester stables pour tout le groupe d’animaux. Les conditions importantes à considérer sont le bruit (gardez à l’esprit que les appareils eux-mêmes pourraient faire du bruit), l’odeur (toujours nettoyer les configurations comportementales avec de l’éthanol), l’intensité lumineuse, et l’expérimentateur. L’expérimentateur doit toujours être la même personne. En outre, l’heure de la journée des expériences devrait être la même pour tous les animaux d’un groupe, quelques heures après le début de la phase sombre dans l’installation est préférable.

Le but de cette expérience est d’augmenter le rapport excitation/inhibition (E/I) dans la région IL grâce à une forte activation des neurones pyramidaux excitateurs. Un ratio E/I amélioré dans cette région spéciale du cortex est connu pour augmenter les niveaux d’anxiété chez les souris^40,42,43,44.

Protocole

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le centre institutionnel de recherche sur les animaux et le « Senatorin für Wissenschaft, Gesundheit und Verbraucherschutz » à l’Université de Brême (#146)

1. Préparation de l’implant optique⁹ (figure 1C)

1. Placer une ferrule en céramique côté plat dans une étau de banc.
2. Dépouillez la couche d’une fibre de verre de 200 μm de diamètre à l’aide d’un outil de décapage de fibres et coupez des morceaux de 2 à 3 cm de long avec un scribe en fibre de céramique.
3. Placez le morceau de fibre de verre dans la ferrule en céramique avec un surplomb uniforme des deux côtés.
4. Déposer une goutte de superglue sur le côté plat de la ferrule en céramique à l’aide d’une canule d’injection.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
5. Retirez le préimplanter de l’étau du banc et sur le côté rond de la ferrule en céramique, coupez la fibre de verre aussi courte que possible avec le scribe en fibre de céramique.
6. Placez le préimplanter à une rondelle de polissage de la ferrule et polir le côté rond sur 4 papiers de polissage différents, en dessinant un 8 20 fois par papier (30 μm de grain, 6 μm de gravier, 1 μm de gravier et enfin 0,02 μm de grain).
7. Retirez le préimplant de la rondelle de polissage de la ferrule et coupez la fibre de verre sur le côté plat de la ferrule en céramique jusqu’à la longueur nécessaire à l’implantation. Commencez à mesurer la longueur derrière la superglue saillante.
   1. Pour une surface de coupe uniforme il suffit de gratter la fibre de verre 2-3 fois, puis le casser.
      REMARQUE : Utilisez l’atlas du cerveau de la souris de Paxinos et Franklin⁴⁵ pour calculer la longueur de l’implant. L’implant doit se terminer directement au-dessus de la région d’intérêt et l’épaisseur du crâne doit être incluse dans le calcul de la longueur. Pour stimuler la région IL, la fibre de verre a une longueur de 1,8 mm (Figure 3).

Figure 3 : Atlas du cerveau de souris (Paxinos et Franklin) avec la longueur représentative de l’implant pour atteindre la région IL. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

8. Désinfectez l’implant fini pendant 10 minutes dans l’éthanol et laissez-le sécher à l’air avant l’implantation.

2. Injection et implantation

1. Transportez une seule souris jusqu’à la salle chirurgicale et pesez-la. Appliquer l’anesthésie avec une injection intrapéritonéale (i.p.) de kétamine/Xylazine (kétamine 0,12 mg/g, Xylazine 0,01 mg/g).
   1. Fixez la souris avec la main gauche et tournez-la sur son dos avec la tête basse.
   2. Ciblez le quadrant inférieur gauche de l’abdomen avec la seringue et entrez dans la canule d’injection 1 cm sous la peau.
   3. Injecter l’anesthésie dans un mouvement lent et constant dans la cavité abdominale.
   4. Placez la souris dans sa cage et attendez qu’elle atteigne un état profond d’anesthésie.
      NOTE: La profondeur de l’anesthésie peut être déterminée par l’absence de clignements et entre les orteils réflexes.
2. Placez la souris sur une plaque chauffante et fixez la tête dans un cadre stéréotaxique. Fixer le nez et les dents à l’avant, et les oreilles des deux côtés.
   REMARQUE : La tête doit être droite sur l’axe gauche-droite et rostral-caudal pour assurer les coordonnées stéréotaxiques correctes.
3. Appliquer l’analgésie avec 2 mg/kg de carprofène sous-cutanéement dans le dos de la souris et appliquer une pommade pour les yeux opaque sur les deux yeux pour les protéger du séchage.
4. Humidifier les cheveux sur le cuir chevelu avec une serviette en papier humide, puis couper à l’aide de ciseaux. Assurez-vous d’enlever tous les cheveux lâches avec le papier essuie-tout humide. Pour désinfecter le cuir chevelu, utilisez un bâton de coton et prenez 0,5 mL d’une teinture contenant de l’iode (Betaisodona 100 mg/mL d’iode povidon et 11 mg/mL d’iode) et laissez sécher à l’air.
   NOTE: Au lieu de ciseaux, également une tondeuse électrique peut être utilisé pour l’épilation appropriée.
5. Soulevez le cuir chevelu au-dessus de la région d’intérêt à l’aide d’une pince à épiler et coupez 1 cm le long de la ligne médiane. Utilisez deux pinces à épiler pour pousser la peau de côté pour exposer le crâne. Assurez-vous également d’enlever la peau mince au-dessus du crâne et laissez le crâne exposé sécher.
6. Roughen le crâne pour l’implantation ultérieure.
   1. Appliquer une goutte d’acide phosphorique de 2 mm x 2 mm (37 %) du kit adhésif (p. ex., Optibound) sur le crâne, distribuez-le avec la pointe de la seringue et laissez-la prendre effet pendant 15 s.
   2. Retirer tout l’acide à l’aide d’un bâton de coton et rincer le crâne avec 1 mL de 0,9% de NaCl deux fois.
   3. Sécher le crâne avec un bâton de coton et de l’air comprimé.
      Attention : L’acide phosphorique est dangereux et doit être complètement enlevé pour éviter les dommages tissulaires.
7. Calculez le facteur F pour les coordonnées individuelles.
   1. Placez une canule de verre dans le cadre stéréotaxique et localisez-la directement au-dessus du bregma.
   2. Zéro le système de coordonnées et déplacer la canule de verre à lambda.
   3. Calculer le facteur F⁴⁶ avec la formule suivante :
      
   4. Multipliez le facteur F avec les coordonnées de l’atlas du cerveau de la souris pour les ajuster à la souris individuelle.
8. Percer un trou dans le crâne pour l’injection.
   1. Utilisez les coordonnées ajustées pour trouver l’emplacement sur le crâne directement au-dessus de la structure d’intérêt et marquez-le à l’aide de la pointe d’une canule d’injection en la grattant au-dessus de la surface osseuse.
   2. Utilisez la canule d’injection pour percer un trou dans le crâne à l’endroit marqué en tournant la canule sur place. Si le sang s’échappe du trou de bavure, rincer avec 1 mL de 0,9% de NaCl et sécher le crâne par la suite.
9. Prenez la solution de virus dans la canule de verre.
   1. Placez une goutte de 100 μL de 0,9% de NaCl sur le crâne et un morceau de parafilm (1 cm x 1 cm) sur le dessus, côté stérile vers le haut.
   2. Placez 1-2 μL de solution virale sur le parafilm et abaissez la pointe de la canule de verre dedans.
   3. Connectez la canule de verre à une seringue, appliquez une pression négative minimale et attendez que la solution virale soit reprise par la canule (en quelques secondes).
      REMARQUE : Il est important d’arrêter l’application de la pression négative, avant que l’air ne soit capté dans la canule. Par conséquent, il y aura toujours un petit vestige de la solution virale.
10. Injecter la solution virale dans la région d’intérêt.
    1. Placez la canule de verre remplie par le virus au-dessus du trou de bavure.
    2. Baissez lentement la canule dans le trou de bavure et zéro le z-coordinate lorsque la pointe de la canule est au niveau du crâne.
    3. Abaissez soigneusement la canule à la position la plus basse du site d’injection.
    4. Concentrez la jumelle sur le ménisque de la solution virale dans la canule.
    5. Appliquer une petite quantité de pression positive avec la seringue jusqu’à ce que le ménisque soit légèrement abaissé.
    6. Laissez le virus se propager pendant 2-3 min avant de déplacer la canule de verre vers le haut à la position suivante.
    7. Appliquez la solution virale tous les 200-300 μm dans toute la région d’intérêt.
    8. Retirer la canule de verre très lentement et la jeter après l’injection finale.
11. Préparer le crâne pour l’implantation avec le kit d’adhérence (p. ex., Optibound^TMFL).
    1. Sécher le crâne avec de l’air comprimé.
    2. Appliquer 5 μL d’amorce (p. ex., Optibond, 1-30% (Éthanol, acide silicique, glycérinphosphatdimethacrylat, 2-(2-(Methacryloyloxy)éthylcarbonyl)benzoesäure, 2-Hydroxyéthylmethacrylat)) avec le bâton correspondant et laisser sécher pendant 15 s.
    3. Appliquer 5 μL de liaison (p. ex., Optibound, 15-20% 2-Hydroxyéthylmethacrylat + 1-2% Alkalihexafluorosilikat(Na)) avec le même bâton et le guérir pendant 20 s avec la lumière UV (420-480 nm).
       REMARQUE : Il est essentiel que le crâne soit sec et que l’amorce et la liaison soient appliquées dans une couche très fine.
       Attention : Ne regardez pas directement la lumière UV, car la lumière UV peut nuire aux yeux.
12. Placez l’implant directement au-dessus de la région d’intérêt.
    1. Fixer l’implant dans le support correspondant.
    2. Sécher le crâne avec de l’air comprimé.
    3. Placez la pointe de la fibre de verre directement au-dessus du trou de bavure et abaissez-la soigneusement.
    4. Arrêtez d’abaisser l’implant lorsque l’ampoule restante de superglue touche le crâne. N’exercez pas de pression sur le crâne !
       REMARQUE : Si l’injection et l’implantation sont effectuées dans différentes régions (p. ex., raphe dorsale et hippocampe),percer tous les trous nécessaires après l’application de l’acide phosphorique, mais avant l’adhérence à 2 composants, suivez les instructions telles que décrites précédemment (étape 2.8-2.14).
13. Répare l’implant.
    1. Vérifiez si le crâne est encore complètement sec.
    2. Appliquer du ciment dentaire liquide (p. ex., Gradia flo direct) autour de l’implant et dans les environs et guérir 20 s avec la lumière UV (420-480 nm).
       REMARQUE : La quantité de ciment dentaire dépend de la zone du crâne libre. Le crâne entier doit être recouvert de ciment dentaire.
    3. Appliquer deux autres couches de ciment et remplir complètement la zone du crâne libre et séché. Soignez chaque couche avec la lumière UV (420-480 nm).
14. Finis l’opération.
    1. Appliquer 0,5 g d’onguent d’iode (Betaisodona 100 mg/mL d’iode povidone et 11 mg/mL d’iode) sur l’ensemble de la plaie.
    2. Injecter 0,1 mL de glucose dissous dans 0,9% de NaCl sous-cutanéement dans le cou pour une récupération rapide.
    3. Relâchez la fixation du nez et de l’oreille, apportez la souris dans une cage fraîche et placez-la sous une lampe chauffante pour éviter la perte de chaleur corporelle.
    4. Lorsque la souris se réveille, ramenez-la dans l’installation.
    5. Vérifiez son état de santé au moins une fois par jour. Prenez les mesures appropriées si les souris affichent de mauvaises constitutions (p. ex., assurez-vous de l’analgésie postopératoire avec du carprofène jusqu’à 3 jours si les souris présentent des signes de douleur).
       NOTE: Après deux semaines de récupération, les souris peuvent être utilisées pour des expériences comportementales.

3. Mise en place d’une nouvelle expérience (Exemple de stimulation ChR2 et Open Field)

1. Pulser
   1. Programmez l’impulsion (p. ex., Prizmatix) pour la stimulation lumineuse.
   2. Ouvrez le logiciel et sélectionnez le port COM USB au lequelle la source lumineuse est branchée.
   3. Choisir le mode d’opération select (3) | Exécutez la séquence d’impulsion après le déclenchement HIGH, puis arrêtez-vous lorsque LOW pour permettre à un logiciel externe de contrôler la source lumineuse.
   4. Programmez le protocole de lumière. Pour une stimulation de 20 Hz avec 5 ms d’impulsion lumineuse : choisissez TI = 23 ms, P1D = 5 ms, P1I = 22 ms et P2D = 0 ms.
   5. Appuyez sur Séquence de démarrage. Ce statut restera jusqu’à ce que les expériences soient terminées.
      REMARQUE : Le logiciel d’impulsion (Prizmatix Pulser) doit être lancé avant le logiciel de suivi vidéo; sinon, le logiciel de suivi vidéo ne sera pas en mesure de reconnaître l’appareil.
2. Logiciel de suivi vidéo (p. ex., Ethovision XT)
   1. Créez une expérience à partir d’un modèle prédéfini.
      1. Ouvrez le logiciel, accédezà Fichier , choisissez Nouveau dans le modèle. Sélectionnez Appliquer un modèle prédéfini.
      2. Choisissez suivi en direct et sélectionnez l’appareil photo en appuyant sur Source et confirmez le Basler GenICam connecté.
         REMARQUE : L’image en direct de la caméra s’affiche désormais dans la fenêtre en haut à droite.
      3. Appuyez ensuite et choisissez l’animal qui doit être enregistré (Rongeurs, Souris).
      4. Appuyez sur Suivant et sélectionnez le modèle d’arène Open Field, carré. Sélectionnez le Centre de modèle de zone, Bordure, Coins et confirmez avec Suivant.
      5. Confirmer 1 sujet qui doit être suivi avec Suivant.
      6. Sélectionnez Point central, point de nez et queue-base et confirmez la couleur de l’animal par rapport à l’arrière-plan comme plus sombre avec Next.
      7. Confirmez le taux d’échantillonnage recommandé de 12,5 avec Suivant et terminez l’étape.
      8. Nommez l’expérience appropriée et choisissez un emplacement à enregistrer.
   2. Définissez les paramètres expérimentaux.
      1. Accédez à l’installation et aux paramètres expérimentaux. Choisissez Point central, point de nez et détection de la base de queue comme caractéristiques suivies.
      2. Sélectionnez Utilisation du matériel de contrôle d’essai et accédez à Paramètres.
      3. Sélectionnez la zone USB-IO Noldus et confirmez avec Ok.
      4. Choisissez Matériel personnalisé comme type de périphérique au port TTL, qui a été connecté au périphérique d’impulsion, et confirmez avec Ok.
   3. Définissez les paramètres de l’arène.
      1. Accédez aux paramètres de l’arène et sélectionnez Paramètres de l’arène 1.
         REMARQUE : L’appareil photo ouvre désormais automatiquement une image d’arrière-plan.
      2. Confirmez l’image avec Grab.
      3. Adapter les zones prédéfinis à l’arène réelle en changeant leur taille. Utilisez la flèche et les deux symboles sur sa droite. Si certaines zones ne sont pas nécessaires, supprimez-les.
      4. Appuyez sur 1. Dessinez l’échelle pour calibrer et tirer une ligne d’un coin du labyrinthe à l’autre. Entrez la longueur de la distance réelle en cm.
      5. Répétez cela pour l’autre axe.
   4. Testez si la stimulation lumineuse fonctionne.
      1. Accédez à Arena - Mapping matériel et sélectionnez Test sur la barre grise.
      2. Sélectionnez Sortie de commande 1 Haut et appuyez sur Test.
         REMARQUE : Il devrait y avoir des émissions de lumière à partir de l’extrémité de la fibre optique. Lors de la sélection Sortie 1 Basse et Test, la stimulation doit cesser.
   5. Définissez les paramètres de contrôle d’essai pendant 20 minutes d’expérience. Définir les essais Off1, On1, Off2 et On2 pour chacun être 5 minutes.
      1. Accédez au paramètre de contrôle d’essai et sélectionnez Durée de la piste 30 minutes.
      2. Préparez la règle principale en ajustant la condition : Temps à 20 minutes en sélectionnant paramètres et modifiez 30 à 20 minutes. Confirmer avec Ok.
         REMARQUE : La condition pour la piste de démarrage doit être lorsque le sujet est dans l’arène pendant 2 secondes. De cette façon, le système commencera automatiquement le suivi lorsque la souris est dans l’arène.
      3. Créez une sous-règle pour la stimulation lumineuse : accédez à Structures, plus et sélectionnez Sous-règle.
      4. Donnez-lui un nom tel que le protocole de stimulation lumineuse.
      5. Placez-le en dessous de la règle principale et étalez les deux cases en sélectionnant la zone bleue avec le courseur de souris.
      6. Aller à Conditions, Temps et lui donner un nom comme la lumière sur 1.
      7. Ajuster l’état est satisfait après 5 minutes. Confirmer avec Ok.
      8. Placez la boîte directement derrière la zone Rule Begin de la sous-règle en la tirant vers la ligne noire.
      9. Passer à l’action | Matériel personnalisé et nom : lumière ON 1.
      10. Sélectionnez Action à effectuer en tant que sortie 1 haute et confirmer avec Ok.
      11. Placez la boîte directement derrière la boîte Condition.
          REMARQUE : Maintenant, après 5 minutes de l’expérience, la stimulation lumineuse doit commencer.
      12. Répétez les étapes pour définir l’état de temps après 5 minutes et l’action Sortie 1 Basse pour arrêter la stimulation lumineuse après un autre 5 minutes.
      13. Répétez les étapes à nouveau pour programmer une autre lumière Off et light On trial.
      14. Aller à Structures | Référence de sous-règle et vérifiez que la référence appartient à la sous-règle correcte.
      15. Choisissez Conditions de début comme sans délai et conditions d’arrêt comme exécuter une fois par condition de démarrage. Confirmer avec Ok.
      16. Placez la zone de référence entre la case action 1 et la case de condition 2 de la règle principale et tracez une ligne d’Action - démarrer la piste à la référence.
          REMARQUE : Maintenant, la règle principale démarre directement la sous-règle après le démarrage de la piste.
   6. Définissez les paramètres de détection pour montrer au système ce qu’il doit suivre.
      1. Accédez aux paramètres de détection et sélectionnez Paramètres de détection 1.
      2. Placez une souris de test dans l’arène et sélectionnez Configuration automatisée.
      3. Choisissez Rongeur comme type d’animal et utilisez le curser de souris pour dessiner une boîte autour de la souris dans l’arène. Confirmer les résultats OK? question avec Oui.
   7. Définissez la liste d’essai pour tous les animaux expérimentaux qui doivent être suivis.
      1. Accédez à la liste d’essai et planifiez tous les animaux à enregistrer dès aujourd’hui : sélectionnez ajouter des essais et sélectionner un numéro.
      2. Sélectionnez toutes les conditions définies précédemment pour chaque souris.
      3. Nommez l’Animal-ID et le Traitement correctement pour simplifier ultérieurement l’analyse.
         REMARQUE : L’id animal n’est pas pertinent pour le système et n’est important que pour l’analyse ultérieure des données par l’expérimentateur. Le groupe de regroupement dans le groupe traitement et contrôle est important pour que le système sache se regrouper et comment comparer toutes les pistes dans les étapes ultérieures d’analyse.
   8. Allez à Acquisition et commencez par l’expérience.

4. Expérience open field (anxiété)

1. Apportez la souris expérimentale à la salle comportementale juste avant l’expérience pour assurer un niveau approprié d’anxiété.
   REMARQUE : Les expériences comportementales doivent être effectuées pendant la phase sombre lorsque les souris sont éveillées, et toujours dans le même créneau horaire pour assurer la comparabilité.
2. Couplez la souris à l’aide d’une manche jusqu’à la source lumineuse en la pressant doucement sur la grille de la cage.
3. Placez-le dans une cage d’attente avec de la litière fraîche pendant 10 min pour vous acclimater au câble lumineux.
4. Commencez l’acquisition en appuyant sur le bouton Démarrer dans le logiciel de suivi vidéo (par exemple, Ethovision XT).
5. Transférer la souris de la cage d’attente dans le coin supérieur gauche du champ ouvert. Retirez le bras dans les 2 secondes pour éviter de suivre un bras au lieu de la souris.
6. Laissez le champ visuel de la souris pendant l’expérience et restez calme.
7. Après 20 minutes, lorsque l’expérience est terminée, retirez la souris du labyrinthe, déconnectez le câble lumineux et remettez-le dans sa cage d’origine.
8. Ramenez la souris dans l’installation.

5. Barnes Maze (apprentissage)

1. Apportez toutes les souris expérimentales dans la salle comportementale environ 1 heure avant l’expérience.
2. Préparez le labyrinthe Barnes en fermant tous les trous sauf un, sous lequel une boîte d’évacuation est placée. Placez un mur de carton au milieu de la plate-forme, qui est la zone de départ pour la souris.
3. Connectez une souris à la source lumineuse (manche sur un câble lumineux) aux deux implants.
4. Placez la souris directement au milieu du labyrinthe Barnes dans le mur du carton, ce qui empêche la souris de courir avant le début de l’expérience.
5. Appuyez sur Démarrer dans le logiciel de suivi vidéo (par exemple, Ethovision XT) et retirez le carton.
   REMARQUE : Le logiciel suit la souris jusqu’à ce que le trou correct soit atteint, mais soyez prêt à arrêter l’essai manuellement juste au cas où le logiciel ne reconnaîtrait pas la transition de trou.
6. Sortez la souris du labyrinthe et retirez la connexion au câble lumineux.
   REMARQUE : S’il s’agit d’une journée d’entraînement avec plusieurs essais par souris, laissez la souris dans la salle d’attente à côté de la salle de comportement jusqu’au début de la prochaine séance d’entraînement. Si c’était le jour de test avec un seul essai par souris, ramener la souris à l’installation.

6. Analyse des données (Exemple de données open field avec 4 essais distincts)

1. Logiciel de suivi vidéo (p. ex., Ethovision XT)
   1. Définissez les groupes expérimentaux et les essais dans le profil de données.
      1. Accédez à Profils de données à gauche et choisissez Treated vs Control.
      2. Accédez à Imbrication dans la nouvelle fenêtre du milieu gauche et sélectionnez État de contrôle d’essai.
      3. Choisissez l’intervalle d’état de l’action élément : démarrer Track to the Element Action: light goes ON 1.
      4. Placez l’boîte de nidification entre la zone Filtre Traitement et la zone de résultats correspondante.
         REMARQUE : Cet intervalle défini est Off1, qui décrit les 2,5 premières minutes de l’expérience où aucune stimulation lumineuse n’est présente.
      5. Répétez les étapes pour les intervalles On1 (de l’élément Action: la lumière s’allume 1 à l’élément Action: la lumière s’éteint 1), Off2 (de l’élément Action: la lumière s’éteint 1 à l’élément lumière passe sur 2) et On2 (de l’élément Action: la lumière s’éteint 2 à l’élément Action: stop track).
      6. Répétez les 4 intervalles du groupe de filtres de contrôle.
         REMARQUE : Chaque nichoir a besoin de sa propre boîte de résultats avec les noms Off1, On1, Off2, On2. Maintenant, le traitement et le groupe témoin sont divisés en 4 essais différents de stimulation lumineuse qui sont analysés séparément.
   2. Définissez les paramètres à analyser dans le profil d’analyse.
      1. Accédez à Profils d’analyse à gauche et sélectionnez Dans les zones.
      2. Sélectionnez la variable dépendante dans la zone et sélectionnez Centre comme zone.
      3. Double-cliquez sur Dans le centre et choisissez l’un des points sélectionnés et sélectionnez uniquement au centre.
      4. Avant de quitter la fenêtre, accédez aux statistiques d’essai et sélectionnez Fréquence, Durée cumulative et la latence à la première.
      5. Ajouter la distancevariable dépendante déplacée .
         REMARQUE : Dans les statistiques de groupe, choisissez d’utiliser l’erreur standard ou l’écart type comme erreur. Avec ce profil, les données du temps passé dans le centre, les entrées du Centre et la distance totale déplacée sont disponibles.
   3. Extraire des données
      1. Accédez aux résultats et sélectionnez Statistiques et graphiques.
      2. Appuyez sur Calculer pour afficher les données analysées.
         REMARQUE : Les statistiques d’essai donnent des informations sur chaque souris et les statistiques de groupe analysent la moyenne et l’erreur des deux groupes, divisés en 4 essais avec la parcelle de barre correspondante.
      3. Appuyez sur Exporter les données et sélectionnez les statistiques d’évaluation et l’emplacement à enregistrer.
         REMARQUE : Les données exportées sont enregistrées en tant que fichier Excel et avec des valeurs individuelles pour chaque souris. Dans ce fichier Excel, animal-ID aide à identifier les souris.
      4. Accédez à Heatmap Visualization et appuyez sur Plot Heatmaps.
      5. Sélectionnez Essais sur le droit de voir des cartes thermiques individuelles pour chaque souris et chaque essai.
      6. Faites un clic droit sur la souris et exportez des cartes thermiques en tant qu’images.
2. Tracé
   1. Ouvrez le fichier feuille de calcul à l’ordinateur et calculez les moyens et les erreurs standard (SEM) pour les 4 essais dans chaque état et groupe mesurés.
   2. Générer des graphiques dans un programme de statistiques (p. ex., Sigma Plot).
      1. Copiez les moyens et sem dans l’ordre correct du fichier feuille de calcul à Sigma Plot. Les lignes doivent contenir les données pour Off1, On1 etc. et les colonnes contiennent l’essai, la moyenne et la SEM en tant que têtes.
      2. Sélectionnez les trois colonnes et accédez à Créer un graphique.
      3. Sélectionnez la zone Barre et choisissez barres non regroupées avec erreur (ligne supérieure, troisième zone).
      4. Confirmez avec Terminer pour ouvrir une nouvelle page graphique.
      5. Étiquettez l’ensemble du graphique, puis accédez à Accueil, sélectionnez la zone Graphique à gauche et appuyez sur Exporter. Sélectionnez un dossier de destination et choisissez MetaFile (*.wmf) comme format.
         REMARQUE : Le format .wmf peut être traité ultérieurement dans un logiciel graphique comme CorelDraw.
   3. Calculer les statistiques pour les données obtenues.
      1. Copiez les données brutes de la feuille de calcul (Off1, On1, etc.) en colonnes simples de Sigma Plot.
      2. Marquez les colonnes pour comparer et aller à Analyse, choisissez t-test et appuyez sur Exécuter.
      3. Confirmez le format de données Raw avec Suivant et exécutez le test avec Finish.

Résultats

Le but de ce protocole est de mesurer les changements dans le comportement des souris génétiquement modifiées au cours d’une expérience optogénétique. La manipulation optogénétique se fait par injection d’un vecteur viral associé à l’adéno. La stimulation lumineuse chez les souris en mouvement libre est possible par l’implantation d’une fibre lumineuse directement au-dessus de la région d’intérêt.

Dans la figure 4, les résultats d’une expérience optogénétique sont présentés. Une forte activation des neurones pyramidaux excitateurs dans la région IL via ChR2 a augmenté le comportement lié à l’anxiété dans le champ ouvert. ChR2 a été injecté dans la région IL du mPFC chez les souris Nex-Cre pour l’expression dans les neurones pyramidaux (Figure 4A). Au cours de deux tests d’anxiété, le champ ouvert (figure 4B,C) et le test d’alimentation de nouveauté-supprimée (figure 4F,G), ChR2 est stimulé avec la lumière bleue et active les neurones pyramidaux. Comme contrôle, un autre groupe de souris a reçu une injection de la fluorophore tdTomato au lieu de ChR2 (Figure 4D,G). Dans une telle expérience, l’anxiété est définie comme l’évitement de la zone centrale plus lumineuse. Les souris montrent une évitement intrinsèque des zones ouvertes parce qu’elles sont anxieuses des prédateurs.

Dans l’expérience Open Field, présentée à la figure 4B, les souris ont exécuté 4 essais de 5 minutes chacun. Dans les essais 1 et 3, aucune stimulation lumineuse ne s’est produite (Off1,2) et dans les essais 2 et 4, la stimulation de la lumière bleue avec 20 Hz (5 ms d’impulsion lumineuse) et 1 mW d’intensité a été effectuée (On1,2). Les cartes thermiques montrent que, dans le groupe expérimental, la durée du centre différait entre les essais Off et On. Pendant la stimulation lumineuse, les souris restent de préférence dans la zone frontalière. Les animaux témoins préfèrent également la frontière, mais ne changent pas leur comportement lors de la stimulation lumineuse. Dans la figure 4C, les principales mesures comportementales au cours de l’expérience Open Field sont affichées pour le groupe expérimental. Si les données ont réussi le test Shapiro-Wilk pour la normalité, les statistiques ont été faites avec un test t indépendant à deux queues. Si le test de normalité a échoué, le test Mann-Whitney-Rank Sum a été utilisé comme alternative non paramétrique. Pour ce genre d’expériences, une comparaison au sein du groupe a été choisie pour étudier si la stimulation lumineuse peut changer directement le comportement anxieux au fil du temps, indépendamment de l’anxiété de base des animaux expérimentaux et témoins. La durée du centre a diminué de manière significative pendant les deux essais de stimulation lumineuse, indiquant des niveaux accrus d’anxiété. La distance totale déplacée n’a pas été modifiée, ce qui montre que le comportement locomoteur n’a pas été affecté. Le nombre d’entrées centrales a été augmenté, mais pas de manière significative. Dans la figure 4D, les données du groupe témoin sont affichées. Les animaux témoins n’ont montré aucun changement de comportement entre les essais Off et On dans l’un des paramètres analysés, montrant que la stimulation lumineuse ou l’implantation n’a pas causé les effets observés. En somme, ce test montre une anxiété accrue lors de la stimulation lumineuse des neurones pyramidaux IL via ChR2.

Dans la figure 5, les données d’une expérience optogénétique infructueuse sont affichées pour le labyrinthe Elevated-Plus. Au cours de l’expérience Elevated-Plus Maze, qui est présentée à la figure 5A,les souris ont terminé 6 essais de 3 minutes chacun. Dans les essais 1, 3 et 5, aucune stimulation lumineuse n’a été effectuée (Off1, Off2, Off3) et dans les essais 2, 4 et 6, stimulation de la lumière bleue avec 20 Hz (5 ms d’impulsion légère) et 1 mW d’intensité a été effectuée (On1, On2, On3). Dans ces résultats exemplaires, la longueur du protocole optogénétique et la construction du labyrinthe lui-même ne convenaient pas à la ligne de souris transgénique. Dans la figure 5B, on peut voir, que plusieurs souris ont glissé hors du labyrinthe avec leurs pattes arrières ou même tombé. Lorsque cela s’est produit, les souris ont eu une deuxième chance d’effectuer l’EPM un jour plus tard. S’ils tombaient à nouveau, ils étaient exclus de l’analyse. Lorsque les souris ont glissé à plusieurs reprises, mais ont réussi à rester sur le labyrinthe, les données ont été analysées normalement. Néanmoins, les données doivent être interprétées avec beaucoup de soin et les animaux témoins deviennent plus importants. Les souris Nex-Cre avaient des difficultés motrices pour rester sur les bras ouverts étroits. Pour éviter cela, les petits murs, d’une hauteur de 1 cm, auraient aidé à une prise sûre des pattes arrière sur les bras du labyrinthe. Les cartes thermiques et les graphiques montrent que les souris expérimentales, ainsi que les souris témoins, ont commencé à éviter les bras ouverts de l’essai 2 (On1) sur (Figure 5C-E). Le temps passé à bras ouverts est considérablement réduit pour les deux groupes, tout comme les entrées de bras ouverts. L’analyse du groupe expérimental n’a obtenu que des données impliquant un grand effet anxiogène de la stimulation lumineuse, car le temps sur le bras ouvert et les entrées de bras ouverts sont significativement diminués au cours de l’essai On1. Cependant, en comparant ces données au groupe témoin, qui montrent le même comportement, il devient clair que le comportement observé n’est pas médié par la stimulation optogénétique, mais par l’évitement des bras ouverts en général en raison de l’accoutumance au labyrinthe. Ces données soulignent l’importance d’un groupe témoin approprié pour distinguer les effets comportementaux médiés par la stimulation optogénétique et l’adaptation comportementale possible. En outre, ces données mettent en lumière l’importance d’adapter correctement une configuration expérimentale en fonction de la ligne de mousse spécifique et de la question expérimentale.

Pour valider et renforcer les données comportementales recueillies, les cerveaux de souris sont retirés après la dernière expérience pour contrôler l’injection et l’implantation correctes (Figure 6). Les cerveaux sont fixés dans 4% de paraformaldéhyde et retirés du crâne. Les cerveaux sont déshydratés dans 30% de saccharose pendant 1-2 jours et cryoslicés par la suite. Les tranches cérébrales coronales de 40 μm d’épaisseur sont lavées et montées sur des lames objectives de superfrost avec un milieu de montage contenant DAPI, qui tache les noyaux cellulaires. Cela permet d’identifier les zones cibles dans les tranches coronales. La fluorescence de l’étiquette YFP ou tdTomato elle-même indique l’emplacement de l’injection de virus. Dans la figure 6B, les sites d’injection exemplaires de ChR2-YFP à gauche (jaune) et tdTomato à droite (rouge) sont présentés. À l’aide d’un modèle, adapté de l’atlas du cerveau de la souris Paxinos et Franklin^45, la région IL peut être identifiée. Dans les deux diapositives, l’outil optogénétique est exprimé dans la région IL, mais aussi dans les régions adjacentes du cerveau. Pour une interprétation appropriée, la diffusion de la lumière bleue dans les tissus cérébraux est consultée⁸ (Figure 1D,E). Il peut être vu que la lumière bleue atteindra la région DP en dessous de l’IL avec seulement moins de 5% de l’intensité lumineuse initiale de 1 mW à la pointe de la fibre (Ligne bleue dans la figure 1D)⁸. En outre, une petite quantité de lumière peut aller vers le haut à la région PrL en raison de la rétro-dispersion⁴⁷. Par conséquent, on peut dire que la région de l’IL est la plus fortement éclairée, mais les régions adjacentes comme le DP et la région prL peuvent également être légèrement stimulées. Par conséquent, la stimulation spécifique aux cellules IL n’est pas garantie et l’analyse immunohistochimique des régions adjacentes devrait être effectuée, pour voir si l’activité des cellules PrL et DP est modulée par la lumière. Dans la figure 6C, un autre contrôle important est indiqué : la spécificité de la ligne de souris Nex-Cre. Par l’intermédiaire de la coloration d’anticorps contre les deux types de cellules dans la région il, les neurones de principe glutamatergiques et les interneurones GABAergic, on peut voir, que l’expression chR2-YFP se produit seulement dans les neurones glutamatergiques et non avec les GABAergic.

Dans l’ensemble, nos expériences montrent qu’avec la manipulation optogénétique pendant les tests comportementaux, des changements dans le comportement lié à l’anxiété pourraient être observés. En utilisant plus d’un test pour le même comportement, une conclusion fiable peut être tirée. En outre, l’analyse immunohistochimique confirme les données obtenues. Nos expériences suggèrent que l’activation spécifique des neurones pyramidaux dans le cortex infralimbique a augmenté le comportement lié à l’anxiété dans certains tests.

Figure 4 : L’activation optogénétique des neurones pyramidaux il augmente le comportement anxieux. Stimulation lumineuse pendant les expériences : 473 nm, 1 mW, stimulation de 20 Hz. A) Dessin schématique du site d’injection et d’implantation pour ChR2-YFP ou tdTomato dans l’IL. Pendant l’expérience, les neurones pyramidaux de la région IL du mPFC sont activés par ChR2. Tranches cérébrales saggitales adaptées de l’atlas du cerveau de la souris Paxinos et Franklin, saggitale : alignaux latéraux o,6. B) Labyrinthe de champ ouvert avec protocole de stimulation de la lumière (20 min avec 4x5 min alternant off et on essais; à gauche) et des cartes thermiques des souris exemplaires chR2-injectées (EXP) et tdTomato -injectées (CT) dans tous les 4 essais de l’expérience (à droite). Exp animaux passent moins de temps dans le centre de l’OF lorsqu’il est stimulé avec la lumière laser bleue. Pour les animaux ct, le temps passé dans le centre ne diffère pas entre la lumière Off et on essais. C) Données de groupe pour les animaux EXP dans l’OF, n=11. Les souris passent beaucoup moins de temps au centre de l’OF lorsqu’elles sont stimulées avec de la lumière bleue (Off1 39,49±6,9 s, Le 1 19.87±4.47 s, Off2 28.13±8.55 s, On2 23.42±9.32 s, Off1:On1, t-test, p = 0.033, *; Off1:On2, MDRS, p=0,049, *). La distance déplacée n’est pas affectée (Off1 2703.09±292.65 cm, On1 3113.4±491.15 cm, Off2 3331.86 ±482.62 cm, On2 3082.17±658.61 cm). # des entrées centrales diminuent avec le temps, mais ne montrent pas de différences significatives (Off 1 22.36±3.78, On1 18.45±3.95, Off2 17.36±1.99, On2 13.27±2.64). D) Données de groupe pour les animaux CT dans l’OF, n=15. Temps que les souris passent au centre de l’OF, la distance déplacée, # des entrées centrales ne change pas entre la lumière On et Off trials (Time in center Off116.73±2.65 s, On1 16.02±1.89 s, Off2 12.02±1.76 s, On2 13.04±2.58 s; Distance Off1 3399.69±296.77 cm, On1 3210.6±446.9 cm, Off2 3030.28±513.83 cm, On2 2955±617.7 cm; # des entrées centrales Off1 14.2±1.98, On1 13.6±2.02, Off2 10.8±1.88, On2 11.67±2.5). Les souris ct montrent une anxiété de base significativement plus élevée (Off1 EXP:CT, MVRS, p=0,005, **). Les valeurs sont moyennes±S.E.M. * indiquent des différences significatives (p≤0.05), ** indiquent des différences significatives (p≤0.01). t-test toujours à deux queues, MVRS: Mann-Whitney Rank Sum test; IL : cortex infralimbique ; BLA: amygdale basolaterale; DRN: noyaux de raphe dorsal; OF: Open Field; CT: animaux témoins; EXP: animal expérimental; L: lumière. Ce chiffre a été modifié de Berg et coll. 2019, PLoS One⁴³ et de Berg 2019⁴⁸. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : L’expérience EPM n’a pas montré d’effets comportementaux chez les souris Nex-Cre. Stimulation lumineuse pendant les expériences : 473 nm, 1 mW, stimulation de 20 Hz. A) Labyrinthe surélevé-plus avec protocole de stimulation lumineuse (18 min, 6x3 min, alternant off et on essais). B) Données de groupe pour les souris qui « glissent » sont incluses dans les données, total n=23. Les souris Nex-Cre avaient tendance à glisser hors du bras ouvert avec leurs pattes arrière, indépendamment du groupe expérimental (à gauche). Seules les souris qui sont restées dans le labyrinthe pour les 6 essais ont été prises en compte dans des analyses ultérieures. Slip off dans la première phase Off1 sont des raisons pour éviter plus tard les bras ouverts (Off1 EXP 1.63±0.6, CT 2.2±0.79, Off2+3 EXP 0.125±0.125, CT 0±0, On1+2+3 EXP 0.625±0.26, CT 0.1±0.1). Le graphique à secteurs (à droite) montre des souris tombant du labyrinthe pendant les 18 min avec 42,42 %. Seulement 57,57% ont terminé l’expérience. C) Cartes thermiques des souris EXP et CT exemplaires dans les 6 essais de l’expérience. Les deux groupes montrent une diminution de la durée du bras ouvert après l’essai Off1. D) Données de groupe pour les animaux EXP dans l’EPM, n=12. Le temps passé à bras ouverts a diminué de façon significative au cours des deux premiers essais et constamment après (Off1 73.91±12.22 s, On1 36.15±14.65 s, Off2 15.61±6.23 s, On2 19.49±7.51 s, Off3 9.36±4.44 s, On3 7.96±3.47 s. Off1:On1, t-test, p=0,041, *). La distance déplacée n’est pas affectée (Off1 679.96±71.63 cm, On1 712.24±112.82 cm, Off2 717.49±97.39 cm, On2 782.51±81.11 cm, Off3 722.11±68.60 cm, On3 663.90±106.57 cm). Le nombre d’entrées de bras ouverts diminue considérablement de Off1 à On1, puis reste constant (Off1 8.08±1.08, Le 13.33±0.76, off2 2.16±0.69, on2 2.91±1.09, off3 1.73±0.75, on3 1.73±0.66. Off1:On1, t-test, p=0,002, **). Le temps passé au centre de l’EPM diminue le long des essais, mais ne montre aucune différence significative de Off to On trial (Off1 41.71±5.34 s, Le 1 31.2±4.59 s, Off2 19.8±3.44 s, On2 24.49±3.38 s, Off3 20.37±4.77 s, On3 18.85±4.07 s). E) Données de groupe pour les animaux ct dans l’EPM, n=11. Les données CT montrent les mêmes diminutions significatives que les données EXP, ce qui indique que l’expérience n’a pas fonctionné correctement (Temps à bras ouverts Off1 86,92±12,74 s, On1 33.78±14.38 s, Off2 18.01±11.61 s, On2 16.41±9.61 s, Off3 11.36±4.01 s, On3 5.43±2.07 s. Off1:On1, MVRS, p=0.009, **; Distance Off1 705.11±88.36 cm, On1 789.45±77.53 cm, Off2 724.74±80.49 cm, On2 676.57±111.99 cm, Off3 716.99±132.47 cm, On3 663.03±132.46 cm; Open arm entries Off1 7.09±1, On1 3.72±1.17, Off2 1.45±0.47, On2 1.36±0.58, Off3 0.91±0.43, Off3 1.64±0.59. Off1:On1, MDRS, p=0,01, *; Temps passé dans le centre Off1 35.89 s, Le 1 29.25±3.96 s, Off2 22.17±3.58 s, On2 15.9±2.57 s, Off3 13.86±4.2 s, On3 16.89±5.75 s). Les valeurs sont moyennes ± S.E.M. * indiquent des différences significatives (p≤0,05), ** indiquent des différences significatives (p≤0.01). t-test est toujours à deux queues, MVRS: Mann-Whitney Rank Sum test; EPM: Déhéated-Plus Maze; CT: animaux témoins; EXP: animal expérimental; OA: bras ouverts. Ce chiffre a été modifié de Berg et coll. 2019, PLoS One⁴³ et de Berg 2019⁴⁸. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Côté injection de ChR2 et tdTomato dans la spécificité IL et Nex-Cre. A) Dessin schématique du site d’implantation sur tranches cérébrales coronales à AP + 1,66 mm, mL 0,3 mm, DV -1,8 mm, avec injection unilatérale et implantation (adapté de l’atlas du cerveau de la souris, Paxinos et Franklin, Bregma +1,54 mm). B) Les sites d’injection exemplaires de ChR2-YFP (gauche, jaune) et tdTomato (droite, rouge) ont fusionné avec des noyaux cellulaires tachés DAPI (bleu) chez les souris Nex-Cre. Barre d’échelle 1 mm. Les encarts montrent un grossissement élevé de la région IL. Barre d’échelle 150 μm. Les boîtes blanches indiquent l’emplacement des insets. C) Rangée supérieure : images confocales de la région IL gauche d’une souris Nex-Cre tachée de CamKII comme marqueur pour les neurones glutamatergiques (bleu), et ChR2-YFP (jaune) ou Gad67 comme marqueur pour les neurones GABAergic (vert), d’une souris Nex-Cre. Rangée inférieure : colocalisation du ChR2-YFP (jaune) avec CamKII (gauche, bleu), mais pas avec Gad67 (droite, vert), montrant la spécificité des souris Nex-Cre pour les neurones glutamatergiques. Barre d’échelle 50 μm. PrL : cortex prélimbique ; IL : cortex infralimbique ; DP : cortex pédunculaire dorsal. Ce chiffre a été modifié de Berg et coll. 2019, PLoS One⁴³ et de Berg 2019⁴⁸. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

L’utilisation de la lumière pour manipuler la signalisation neuronale est la méthode de choix depuis près d’une décennie maintenant. Depuis 2005, le nombre d’articles publiés sur le développement de nouveaux outils optogénétiques^{4,6,8,14,49,50,51} et les études où ces outils sont utilisés pour étudier les circuits cérébraux^{21,23,40,43,52}, fortement augmenté. D’une part, avec l’énorme diversité des outils optogénétiques injectables, des variantes d’implantation, des lignes de souris transgéniques et des expériences comportementales, la possibilité d’expériences est multiple et illimitée. D’autre part, la possibilité de faire des défauts dans le choix des conditions expérimentales est très élevée et les expériences sont si spécifiques, que souvent la comparabilité à d’autres études est difficile.

Étapes critiques
Une étape essentielle importante de ce protocole est une bonne planification. Le choix de l’outil optogénétique doit correspondre à la question scientifique. Est-il seulement nécessaire de manipuler l’activité globale d’un neurone ou de la synapse? Ensuite, les outils fournis commercialement comme ChR2^21,25,,27 et Arch³⁷ sont un bon choix. Mais en dehors de cela, si un système de neurotransmetteur spécial ou même un seul récepteur doit être manipulé, une chimère récepteur individuel est souvent le meilleur choix^3,6. Plusieurs chimères de récepteur avec gpcrs, les soi-disant Opto-XRs, et les lignes directrices pour les produire sont déjà disponibles^4,50. Outre le choix des outils optogénétiques, la ligne de souris en combinaison avec l’expérience comportementale est également critique. Différentes souches de fond, comme par exemple C57Bl/6 et BALB/cByJ, affichent différents phénotypes comportementaux à certains égards^53,54. Les souris C57Bl/6 ont une faible anxiété de base et peuvent être utilisées pour la manipulation anxiogène, tandis que les balb/cByJ montrent des niveaux d’anxiété plus élevés et sont donc plus sensibles aux médicaments anxiolytiques. En outre, les variantes transgéniques de ces souches de fond peuvent également varier dans leur phénotype⁴⁸. Avec une bonne combinaison de promoteurs spécifiques en conjonction avec un outil optogénétique et la ligne de souris transgénique, presque toutes les populations cellulaires désirées peuvent être ciblées.

Une étape critique pendant la chirurgie vise l’emplacement correct. Avec l’aide de l’atlas du cerveau de la souris, les coordonnées appropriées pour l’axe antérieur-postérieur, et l’axe médial-latéral, et la profondeur de la structure peut être établie⁴⁵. En réalité, chaque crâne a une forme et une taille légèrement différentes. Ainsi, le facteur F⁴⁶ pour ajuster les coordonnées stéréotaxiques est très important, tout comme la fixation correcte du nez et de l’oreille pendant la chirurgie stéréotaxique. Si la tête de la souris est inclinée, la canule d’injection ne ciblera pas la région d’intérêt souhaitée.

En outre, le diamètre de la canule d’injection est également critique. S’il est trop petit, aucun virus ne peut être libéré dans le tissu, s’il est trop large, la canule va fuir la solution virale sur son chemin vers la région d’intérêt. Si la fibre optique implantée se termine directement au-dessus de la région cible, l’expression du virus dans les régions du cortex ci-dessus n’a pas d’importance. Mais si l’implant est placé au-dessus d’autres régions pour stimuler les terminaux d’axone, les axones des régions du cortex supérieur seront également activés par la lumière et falsifient les données obtenues. À titre d’exemple : La région IL et la région prélimbique (PrL) projettent tous deux l’amygdale basale⁵⁵,^56, mais ont des fonctions et des rôles complètement différents dans la modulation de l’anxiété^26,57.^, Si l’implant est placé au-dessus de l’amygdale pour activer les terminaux d’axone de la région IL, et pendant la solution de virus d’injection a également été placé dans le PrL en raison de la canule d’injection mauvaise, le risque d’activer également les terminaux d’axone de la PrL est très élevé.

Pendant la préparation du crâne pour la fixation de l’implant, l’utilisation clairsemée de l’amorce et du lien est cruciale pour une fixation fiable et durable. Si le système d’adhérence à 2 composants n’est pas appliqué finement, le ciment dentaire pourrait se détacher du crâne après quelques jours ou semaines. En outre, le crâne doit également être complètement séché avant de fixer l’implant, sinon le ciment ne sera pas attacher correctement au crâne.

Des étapes critiques existent également dans la partie comportementale de ce protocole. Tout d’abord, la construction du labyrinthe est très importante. Dans chaque configuration comportementale, plusieurs variantes existent dans la littérature concernant la taille et la forme, ainsi que pour la procédure elle-même^58,59,60. Il est important de choisir une variante qui rend les données comparables et reproductibles. En outre, les exigences spéciales pour les lignes de souris utilisées doivent être prises en compte^43,48. Dans les données représentatives de l’EPM, on peut voir que plusieurs souris Nex-Cre sont tombées du labyrinthe ou ont glissé plusieurs fois (figure 2b). Pour ces souris, un labyrinthe avec un petit mur autour des bras ouverts aurait été une meilleure alternative.

Deuxièmement, il est essentiel de maintenir toutes les conditions de pièce externes^{constantes 61}, sinon différents groupes de souris ne seraient pas comparables du tout. À cet égard, il est très important de choisir le moment de l’expérience comme celui où la configuration expérimentale est vacante et l’expérimentateur est toujours présent. En outre, des événements dans le bâtiment, tels que les travaux de construction, l’essai de tout système (alarme incendie) ou le jour de nettoyage de l’installation de souris, devraient être pris en considération afin d’éviter toute interférence avec les données obtenues.

Enfin, les conditions de manipulation et de logement sont essentielles pour les expériences comportementales. Lorsqu’une implantation est effectuée, les souris doivent être logées seules en raison du risque de blessure d’autres souris. Pour assurer une bonne comparabilité entre les groupes et une faible erreur au sein d’un groupe, chaque souris doit avoir la même taille de cage et l’enrichissement. Pour les expériences liées à l’anxiété, le logement unique a quelques avantages que les souris mâles maison chantent un niveau d’anxiété de base inférieur, moins de variation dans leur niveau d’anxiété, et moins dépressif-comme des symptômes^15,16. Groupe logé souris mâles pourraient fortement différer dans leur niveau d’anxiété en raison de la hiérarchie parmi les souris. Outre le logement, une manipulation constante et égale de toutes les souris et groupes est également importante. Saisir la souris afin de connecter la fibre lumineuse sur l’implant est très stressant. Par conséquent, cette procédure doit être la même pour chaque souris, ce qui signifie la même technique et le même expérimentateur. En outre, le temps d’accoutumance dans la cage d’attente, qui est destiné à calmer la souris à partir de la procédure de connexion stressante, doit également avoir des conditions égales dans la durée, la litière et la position au labyrinthe. La manipulation à l’intérieur de l’installation de souris est également critique pour les performances comportementales ultérieures. Les animaux expérimentaux et témoins ne doivent pas être nettoyés à différents jours ou par des personnes différentes, car c’est aussi stressant pour les souris. En outre, la journée de nettoyage ne devrait pas être le jour expérimental pour éviter les différences de comportement.

Dépannage
Il y a plusieurs problèmes qui peuvent se produire pendant le protocole. Par exemple, le forage d’un tout dans le crâne pendant la chirurgie stéréotaxique pourrait endommager les vaisseaux sanguins. Habituellement, des saignements forts se produisent, en particulier au-dessus de bregma et lambda. Si cela se produit, n’essayez pas d’arrêter le saignement avec des bâtonnets de coton car ils ont tendance à étendre encore plus de saignements hors du navire en raison de leur absorption, au lieu de cela, rincer directement avec NaCl.

Il peut également arriver que l’injection de pression de la solution du virus ne fonctionne pas. Dans ce cas, il se pourrait que le parafilm, une croûte du trou de bavure ou du tissu cérébral, obstrue la pointe de la canule. Dans ce cas, retirez lentement la canule du cerveau sans changer l’axe x ou y et utilisez une pince à épiler pour enlever 1-2 mm de la partie avant de la pointe de la canule. Avant d’abaisser à nouveau la canule, testez la fonctionnalité en appliquant une petite pression pour voir si le virus sort de la pointe de la canule. Pour éviter la constipation, abaisser la canule à une vitesse constante et ne pas arrêter le mouvement jusqu’à ce que la profondeur la plus profonde du côté de l’injection est atteint. Si une trop grande partie de la pointe de la canule est enlevée et le diamètre est trop grand, la canule endommagera les tissus et le risque d’appliquer le virus tout à la fois sera augmenté. Ainsi, assurez-vous que seule la partie obstruée de la pointe est soigneusement enlevée.

Au cours de l’expérience comportementale, la configuration de l’expérience dans le logiciel de suivi vidéo (par exemple, Ethovision XT) peut causer des problèmes. Si, par exemple, la sortie de lumière ne fonctionne pas correctement, cela peut être dû à plusieurs raisons. Le Pulser doit être ouvert, programmé et démarré avant l’ouverture d’Ethovision XT. Le matériel doit être sélectionné correctement dans la « configuration expérimentale » (étape 3.2.2.4). Si la mauvaise boîte IO, ou autre chose que « Costume Hardware », est sélectionnée, le périphérique Pulser ne peut pas être contrôlé par Ethovision. Si le test de la sortie de lumière est réussi, mais que le protocole de lumière programmé dans les « paramètres de contrôle d’essai » ne fonctionne pas pendant l’acquisition, la référence de sous-règle ou de sous-règle peut être mal située ou les conditions et les actions ne sont pas claires. Par exemple : la référence appartient-elle à la sous-règle correcte ? La référence est-elle programmée correctement (p. ex., à quelle fréquence la sous-règle est-elle exécutée)?

En outre, il peut arriver que pendant les « paramètres de détection », l’animal soit suivi adéquatement, mais pendant l’acquisition il y a des échantillons où le sujet n’est pas trouvé. Dans ce cas, vérifiez si l’éclairage dans la salle expérimentale a été changé, ou si quelque chose produit des ombres indésirables dans le labyrinthe. L’ensemble du fond du labyrinthe doit avoir la même couleur, car le réglage ne fonctionnera que pour une combinaison spécifique. Si, pour quelque raison que ce soit, différentes couleurs ou ombres de fond ne peuvent pas être évitées, définissez le paramètre de détection dans la partie la plus sombre du labyrinthe.

Pour modifier les paramètres après l’acquisition des premiers animaux, n’appliquez pas ces modifications dans les paramètres déjà utilisés. Dupliquez-les pour les ajuster. Cela signifie également que l’essai déjà enregistré n’est plus valide pour l’analyse des données. Dans un tel cas, enregistrez tous les animaux pour ce groupe expérimental avec les paramètres d’origine, et créez une nouvelle expérience par la suite où les vidéos enregistrées sont analysées au lieu de suivi en direct. Dans cette expérience « à partir de la vidéo », plusieurs paramètres peuvent être utilisés pour l’analyse sans perdre la comparabilité entre les animaux ou même les données.

Limitations et applications futures
Cette méthode de manipulation du comportement avec optogénétique chez les animaux en mouvement libre inclut également des limitations. Pendant la chirurgie, la proximité des deux implants est limitée. Pour la double implantation, la distance entre les deux implants doit être minimalement la largeur de l’appareil pour tenir l’implant. L’appareil doit abaisser le deuxième implant dans le trou de bavure, tandis que les premiers implants sont déjà fixés. Une solution pour cela pourrait être une implantation inclinée, où les extrémités de la fibre de verre peut être très proche tandis que les ferules en céramique au-dessus du crâne ont une plus grande distance^{23,55,56,57,62,63}. Un inconvénient d’une implantation inclinée est la propagation de la lumière. Lorsque la pointe de fibre est inclinée au lieu de tout droit au-dessus, la zone stimulée est différente. Dans le cas de deux régions cibles à proximité, la position modifiée de la stimulation lumineuse doit être prise en compte.

Au cours de l’expérience comportementale, la construction du labyrinthe pourrait interférer avec le câble optique connecté à l’animal. Certains tests comportementaux, tels que la boîte claire-obscurité, contiennent une zone intérieure^64,65, et d’autres labyrinthes contiennent des compartiments que la souris a besoin d’entrer. De telles expériences ne peuvent pas être effectuées avec cette configuration. Alternativement, un système sans fil pourrait être une option^22,26,66. Mais heureusement, certains labyrinthes, tels que le labyrinthe Barnes, peut être disposé de telle manière, que les souris sont en mesure d’entrer dans les compartiments pertinents⁶⁷.

Outre ceux avec des zones fermées, les labyrinthes qui sont trop larges peuvent également causer des problèmes. Plus la zone du labyrinthe est grande, plus le câble doit être long pour permettre à l’animal d’aller à toutes les positions dans le labyrinthe. Il faut faire attention à ce que l’animal ne soit pas en mesure de marcher sur le câble ou de l’attraper et de le mordre. Une solution pour cela pourrait être une construction qui roule le câble redondant. Un inconvénient est que la traînée pour dérouler le câble est difficile pour les souris. Cette solution conviendrait mieux aux rats. Une autre option possible pourrait être de faire la stimulation de la lumière à l’avance, au lieu de pendant l’expérience, bien sûr, cela n’est possible que si un effet à long terme dû à la stimulation lumineuse se produit²³.

Comparaison avec les méthodes existantes/alternatives
Les méthodes alternatives seraient la stimulation chimique ou électrique pendant le comportement^8,18. Les agonistes ou antagonistes chimiques sont capables d’activer ou de réduire au silence les neurones via des récepteurs spécifiques et peuvent également manipuler les systèmes de neurotransmetteurs simples^38,68. D’une part, la spécificité des récepteurs est assez élevée pour les produits chimiques, car l’agoniste ou antagoniste spécifique n’active que certains récepteurs³⁹. D’autre part, la spécificité des sous-types récepteurs du même groupe de neurotransmetteurs est souvent insuffisante. La plupart des produits chimiques se lient à au moins deux sous-types avec des probabilités différentes⁶⁹. En outre, les produits chimiques ne peuvent pas distinguer les types de cellules neuronales tant qu’ils possèdent les mêmes types de récepteurs. Au-delà de cela, la résolution temporelle et spatiale est pauvre pour les manipulations chimiques par rapport à l’optogénétique. Les agonistes ou les antagonistes sont souvent administrés par voie orale³⁵ ou par injections systémiques^57,70. Si l’infusion du produit chimique se fait directement dans le tissu cérébral, les effets apparaissent plus rapidement qu’avec les applications orales, mais toujours sur une échelle de temps plus lente qu’avec la stimulation lumineuse. Comme les produits chimiques administrés diffusent dans le cerveau et ne sont pas spécifiques pour les types neuronaux ou les régions du cerveau, la manipulation de circuits cérébraux spécifiques, il n’est pas possible.

La stimulation électrique a une résolution temporelle plus élevée que la stimulation chimique^9,14. La propagation dans le tissu neuronal est moins qu’avec la stimulation chimique et la résolution spatiale est meilleure qu’avec la stimulation chimique. Cependant, la stimulation électrique n’a pas la possibilité d’aborder spécifiquement différents types de cellules neuronales ou de types de récepteurs, comme chaque neurone à proximité de l’électrode répondra à la stimulation électrique.

Les méthodes alternatives au comportement chez les souris en mouvement libre sont par exemple des enregistrements électrophysiologiques en tranches de cerveau, où les neurones ou les axones simples peuvent être modulés avec optogénétique et les effets obtenus peuvent être mesurés par l’enregistrement des électrodes^6,71. Les expériences in vitro offrent la possibilité d’étudier la base moléculaire et cellulaire des stimulations optogénétiques, mais ont la limite que la connectivité intrinsèque et l’entrée d’autres régions du cerveau est manquante. Une autre option est d’utiliser optogénétique en conjonction avec l’imagerie multiphoton^1,72. Dans ce cas, les souris ont la tête fixe et peuvent être anesthésiées ou être éveillées pour résoudre des tâches simples.

Pour réaliser une expérience optogénétique réussie, un large éventail d’outils et d’applications sont disponibles de nos jours. La sélection des outils optogénétiques et la configuration comportementale est essentielle pour répondre à des questions de recherche spécifiques. Si la bonne combinaison d’outils et d’expériences est choisie, l’optogénétique permet une étude sans précédent et approfondie des circuits neuronaux à haute résolution temporelle et spatiale. Cela aidera à comprendre et à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les maladies psychiatriques et la cognition.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ketamin	Sigma-Aldrich	K2753-64	Anestasia
20 % Glucose	AlleMan Pharma		Injection s.c. pour une récupération rapide
Labyrinthes comportementaux	Costum made		Measure anxiety
Bepanthen	Bayer		Pommade ophtalmique
Betaisodona	Monodipharma		Stérilisant contenant de l’iode
Betaisodona	Monodipharma		Pommade à l’iode
Jumelles	Olympus	SZ52, 110AL0.62x WD160
Chirurgie Viroles en céramique	Thorlabs	CFLC230-10	Implant
Fibre céramique Scribe	Thorlabs	CSW12.5	Découpe de la fibre de verre
Channelrhodopsin2-YFP virus	Penn Vector Core	Addgene 20298	Optogénétique outil
Air comprimé	Kontakt Chemie	Druckluft 67	Séchage du crâne
Système de coordonnées	Stoelting		Coordonnées stéréotaxiques pour la chirurgie
Correl Draw			Version graphique du logiciel 13
Cryoslicer	MICROM	HM500OM	Production de tranches de cerveau pour la coloration
Ethovision XT 14	Noldus		Logiciel de suivi comportemental
Exel			Logiciel statistique
Rondelle de polissage de virole	Thorlabs	D50-F	Implants de polissage côté rond
Fiber Patch Cord dual	Prizmatix	Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, Noyau de virole 1,25 mm Câbles	, qui sont reliés aux deux implants d’une implantation bilatérale
Fiber Patch Cord single	Prizmatix	Optogenetics-Fiber 500, 1,20 m, noyau de virole 1,25 mm	Câble, qui est relié à l’implant par un manchon
Outil de dénudage de fibre	Thorlabs	T06S13	Décapage de la fibre de verre pour implant
Papier filtre	VWR European	516-0300	Coupé en morceaux pour le test d’alimentation Novelty-Suppressed
Granulés alimentaires	Mü ; hle Leviers	Hö ; veler Nagerfutter	Nutrition pour les souris
Pipettes en verre	Harvard Apparatus	GC150-10	Pipettes d’injection
Gradia direct-Flo	Henry Schein	103322	Cément dentaire fluide
Lampe chauffante	efbe-Schott/Phillips	R95E	Empêcher les souris de se refroidir après l’opération
Plaque chauffante	Stoelting		Intégré dans la coordonnée système
Canule d’injection	Braun	100 Sterican, 0,4 x 20 mm, Gr. 20	Toutes les injections et pour percer un trou dans le crâne
Litière		T 1350	Mise à la terre pour le test d’alimentation Novelty-Supressed Cages
souris	Zoonlab	405 cm^2	Boîtier simple pour expériences
Optibond FL	Kerr	26684E	Préparation du crâne pour l’implantation
Fibre de verre optique	Thorlabs	FT200EMT	Fibre légère pour implant
Optogénétique-LED.STSI	Prizmatix		Boîte à outils optogénétique pour la stimulation lumineuse lors d’expériences comportementales
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	16005-1KG-R	Perfusion de souris pour enlever les cerveaux
Feuille de polissage 0,02 & micro ; m grit	Thorlabs	LFCF	Polissage des implants côté rond
Feuille de polissage 1 & micro ; m grit	Thorlabs	LF1D	Polissage des implants côté rond
Feuille de polissage 30 & micro ; m grit	Thorlabs	LF30D	Polissage des implants côté rond
Feuille de polissage 6 & micro ; m grit	Thorlabs	LF6D	Polissage des implants côté rond
Logiciel Pulser	Logiciel Prizmatix		Logiciel pour le contrôle des appareils légers
Rimadyl-Carprofène	Zoetis		Analgésie
Sigma Plot Logiciel			pour statistiques
Manchon	Thorlabs	FT200EMT	Connexion de l’implant et du câble lumineux
SodiumCloride ( NaCl)	Braun	3570410	Rinçage du crâne
Superglue	Pattex Henkel		Pour fixer la fibre de verre dans la virole
td-Tomato virus	Penn Vector Core	Addgene 51503	Outil optogénétique
Lumière UV	KoQGHJ	sans fil, 1200 mW/cm^2	Lampe de polymérisation pour cément dentaire
Xylavet-Xylazin	cp pharma		Anesthésie