Mesurer RAN Peptide Toxicity à C. elegans

Résumé

Les produits translationnels non dépendants à l’ATG associés à répétition sont des caractéristiques pathogènes émergentes de plusieurs maladies à base d’expansion répétée. Le but du protocole décrit est d’évaluer la toxicité causée par ces peptides à l’aide d’essais comportementaux et cellulaires dans le système modèle C. elegans.

Résumé

C. elegans est couramment utilisé pour modéliser les maladies neurodégénératives liées à l’âge causées par des mutations d’expansion répétée, telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la maladie de Huntington. Récemment, l’ARN contenant l’expansion répétée s’est avéré être le substrat d’un nouveau type de traduction de protéine appelé traduction non-dépendante de l’AUG (RAN) associée à la répétition. Contrairement à la traduction canonique, la traduction RAN ne nécessite pas de codon de démarrage et ne se produit que lorsque les répétitions dépassent une longueur de seuil. Parce qu’il n’y a pas de codon de démarrage pour déterminer le cadre de lecture, la traduction RAN se produit dans toutes les images de lecture à partir de modèles d’ARN de sens et d’antisense qui contiennent une séquence d’expansion répétée. Par conséquent, la traduction DE RAN augmente le nombre possible de peptides toxiques associés à la maladie possible de un à six. Jusqu’à présent, la traduction RAN a été documentée dans huit différentes maladies neurodégénératives et neuromusculaires basées sur l’expansion récidiviste. Dans chaque cas, le déchiffrement des produits RAN qui sont toxiques, ainsi que leurs mécanismes de toxicité, est une étape critique vers la compréhension de la façon dont ces peptides contribuent à la pathophysiologie de la maladie. Dans cet article, nous présentons des stratégies pour mesurer la toxicité des peptides RAN dans le système modèle C. elegans. Tout d’abord, nous décrivons les procédures pour mesurer la toxicité du peptide RAN sur la croissance et la motilité du développement de C. elegans. Deuxièmement, nous détaillons un essai pour mesurer les effets postdéveloppementaux et dépendants de l’âge des peptides RAN sur la motilité. Enfin, nous décrivons un essai de neurotoxicité pour évaluer les effets des peptides RAN sur la morphologie des neurones. Ces essais fournissent une évaluation large de la toxicité du peptide RAN et peuvent être utiles pour effectuer des écrans génétiques ou à petites molécules à grande échelle pour identifier les mécanismes ou les thérapies de la maladie.

Introduction

L’expansion inappropriée des séquences répétées d’ADN est la base génétique de plusieurs maladies neurodégénératives telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la démence frontotemporale (FTD) et la maladie de Huntington (HD)¹. Bien qu’il existe des modèles cellulaires et animaux établis pour ces maladies, les mécanismes sous-jacents à ces conditions ne sont pas bien définis. Par exemple, la MH est causée par l’expansion d’une séquence de répétition CAG dans la séquence de codage pour la protéine Huntingtin Htt². Puisque CAG code la glutamine d’acide aminé, l’expansion de répétition de CAG a comme conséquence l....

Protocole

1. Génération de constructions d’expression de peptide RAN codon-variées

1. Concevez la séquence individuelle de codage du peptide RAN en utilisant des codons synonymes pour éliminer la structure fondamentale répétitive de l’ADN et de l’ARN, mais préserver la séquence d’acides aminés qui surlyse.
2. Commandez les séquences de codon personnalisées commercialement aux durées répétées nécessaires pour les études (généralement 5 à 100 répétitions). Inclure un site de restriction HindIII à l’extrémité 5' et un site de restriction BamHI à la fin 3' pour faciliter le clonage dans les vecteurs d’expression C. elegans, tels que pPD95.79.
   REMARQUE : Si....

Résultats

Nous avons utilisé les essais décrits ici pour évaluer l’effet de différentes inhibitions de gène sur la toxicité des dipeptides RAN qui se trouvent dans les patients de SLA présentant une expansion de répétition de G₄C_2. En utilisant l’essai de croissance pour mesurer la toxicité développementale, nous avons analysé les effets de plusieurs mutants génétiques knock-out identifiés dans un suppresseurs d’écran RNAi à l’échelle du génome de la toxicité PR50-GFP exprimée par muscle. Alors que l’expressi.......

Discussion

Ici, nous rapportons des méthodes qui peuvent être utilisées pour assayer la toxicité du peptide RAN modélisé dans le muscle ou dans les neurones de C. elegans. Tandis que les protéines neurodégénératives ont un phénotype d’âge de début dans les patients humains, elles peuvent également montrer la toxicité développementnelle une fois surexprimées dans des systèmes modèles. La surexpression a des limitations d’interprétation importantes, mais elle fournit également un point de départ puissant pour les écrans géné.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîte de Pétri de 35 mm x 10 mm, stérile	CELLTREAT Scientific Products	50-202-036	Plaques de croissance de nématodes et ARN
AGAR GRANULÉS 2 KILOGRAMMES	BD DIAGNOSTIC SYSTEMS		Plaques de croissance de nématodes et ARNi
AGAROSE ULTRAPURE	LIFE TECHNOLOGIES		Micro-injection pour générer des souches transgéniques de peptides RAN
CARBENICILLINE 5G	THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS	BP26485	Plaques de croissance des nématodes et ARNi
VERRES DE COUVERTURE NO 1 22MM 1OZ/PK	THERMO SCI ERIE	12542B	Imagerie pour le dosage de la commissure
FEMOTIPS DISPSBL MICROINJ 20CS	EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS		Microinjection pour générer des souches transgéniques de peptide
RAN FF COV GLASS NO1 40X22MM 1OZPK	THERMO SCI	ERIE 125485C	Microinjection pour générer des souches transgéniques de peptides RAN
Fisherbrand  ; Superfrost Plus Lames de microscope	THERMO SCI ERIE	12-550-15	Imagerie pour le dosage de la commissure
Gibco  ; Bacto Peptone  ;	Gibco  ;	DF0118-17-0	Plaques de croissance de nématodes et
huile d’halocarbure ARNi 700	SIGMA-ALDRICH INC	H8898-50ML	Micro-injection pour générer des souches transgéniques de peptides RAN
IPTG BIOTECH 10G	THERMO SCI FAIRLAWN CHEMICALS		Plaques de croissance de nématodes et ARNi
Logiciel d’imagerie de fluorescence avancé Leica	Microsystems	LAS-AF	Logiciel d’acquisition d’images pour l’analyse de la vitesse vidéo et le test de commissure
Leica Immersion type N (Oil)	W NUHSBAUM INC		Imagerie pour le test de commissure
CHLORHYDRATE DE LÉVAMISOLE 10GR	THERMO SCI ACROS ORGANICS		Imagerie pour le test de commissure
POINTES DE MICROCHARGEUR 2 X 96 PCS	EPPENDORF NORTH AMERICA BIOTOOLS		E5242956003Micro-injection pour générer des souches transgéniques de peptides RAN
PARABOLE PETRI, 60X15MM,500/CS	CORNING LIFE SCIENCES PLASTIQUE		Plaques de croissance des nématodes et ARNi
TISSUE CULT PLATE 24WEL 50/CS	CORNING LIFE SCIENCES DL	87721	Plaques de croissance des nématodes et ARNi