Nous présentons un essai RT-LAMP pour la détection de TiLV chez le poisson tilapia à l’aide d’instruments simples sur une période de temps relativement courte par rapport aux techniques RT-PCR conventionnelles. Ce protocole peut aider à contrôler la propagation épidémique de TiLVD, en particulier dans les pays en développement.
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Article de méthode
Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) Assay for the Specific and Rapid Detection of Tilapia Lake Virus
Dans cet article
Résumé
Résumé
La maladie du virus du lac de Tilapia (TiLVD), une maladie virale émergente du tilapia causée par le virus du lac tilapia (TiLV), est un défi persistant dans l’industrie aquacole qui a entraîné la morbidité et la mortalité massives du tilapia dans de nombreuses régions du monde. Un essai diagnostique efficace, rapide et précis pour l’infection de TiLV est donc nécessaire pour détecter l’infection initiale et pour empêcher la propagation de la maladie dans l’agriculture aquacole. Dans cette étude, une méthode très sensible et pratique d’amplification isothermale (RT-LAMP) de transcription inverse très sensible et pratique est présentée pour détecter le virus du lac de tilapia dans les tissus du poisson. Une comparaison des essais RT-qPCR et RT-LAMP d’échantillons infectés a révélé des résultats positifs dans 63 (100%) et 51 (80,95%) échantillons, respectivement. En outre, une analyse des échantillons non infectés a montré que les 63 tissus non infectés ont donné des résultats négatifs pour les essais RT-qPCR et RT-LAMP. La réactivité croisée avec cinq agents pathogènes dans le tilapia a été évaluée à l’aide de RT-LAMP, et tous les tests ont montré des résultats négatifs. Les échantillons de foie et de mucus obtenus à partir de poissons infectés ont montré des résultats comparables en utilisant la méthode RT-LAMP, suggérant que le mucus peut être utilisé dans RT-LAMP comme un essai non létal pour éviter de tuer des poissons. En conclusion, les résultats ont démontré que l’essai RT-LAMP présenté fournit une méthode efficace pour la détection de TiLV dans le tissu de tilapia dans un rayon de 1 h. La méthode est donc recommandée comme outil de dépistage sur les fermes pour le diagnostic rapide de TiLV.
Introduction
La maladie par le virus du lac de Tilapia (TiLVD) est une maladie virale dans le tilapia(Oreochromis spp.) qui causerait des décès de tilapia dans de nombreuses régions du monde, y compris l’Asie1,2, l’Afrique et l’Amérique. La maladie a été identifiée pour la première fois lors de la mortalité massive du tilapia en 2009 en Israel, où le nombre de tilapia sauvage dans le lac Kinneret a chuté de façon spectaculaire, passant de 257 à 8 tonnes par an2. La maladie est causée par le virus du lac de tilapia (TiLV), qui a été attribué à la famille Amnoonviridae comme un nouve....
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Protocole
Cette expérience, qui portait sur l’utilisation de tissus animaux, a été approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Kasetsart, Bangkok, Thaïlande (numéro de protocole ACKU61-VET-009).
1. Collection de tissus
- Euthanasier les poissons tilapia à l’aide d’une surdose d’huile de clou de girofle (c.-à-d. plus de 3 ml/L). Le méthane tricaine peut être utilisé comme alternative à l’huile de clou de girofle.
- Utilisez des ciseaux et des forceps stériles pour ouvrir l’abdomen du tilapia post mortem et accisez environ 30 à 50 mg de tissu hépatique, ou à l’aide d’un verre de couvertur....
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Résultats
Dans cette étude, un essai DE RT-LAMP a été développé pour détecter l’infection de TiLV dans le tilapia. Les échantillons testés ont été prélevés dans 14 fermes situées dans différentes parties de la Thaïlande entre 2015 et 2016. Les poissons infectés et non infectés ont été principalement regroupés en fonction des diagnostics physiques et des apparences de TiLVD symptomatique. L’infection de TiLV a été plus tard confirmée utilisant RT-PCR après le processus de collecte. L’électrophoresis du gel agarose et la détection d.......
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Discussion
L’industrie aquacole est continuellement menacée par des infections virales qui causent des pertes économiques importantes9,23,28. Par exemple, le TiLV émergent représente une menace majeure pour les pays producteurs de tilapia dans de nombreuses parties du monde1,6,9. Jusqu’à présent, il n’y avait pas de thérapeutique spécifique dispon.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Le projet est financé financièrement par le numéro de subvention du Fonds de recherche thaïlandais (TRF) RDG6050078 et le Center for Advanced Studies for Agriculture and Food, Institute for Advanced Studies, Kasetsart University, Bangkok, Thailand under the Higher Education Research Promotion et National Research University Project of Thailand, Office of the Higher Education Commission, Ministry of Education, Thailand. La recherche est appuyée en partie par la bourse d’études supérieures de l’École supérieure de l’Université Kasetsart. Les auteurs tiens à remercier le Dr Kwanrawee Sirikanchana pour le récit parlant de la vidéo et Piyawatchara Sikarin pour l’édition de....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Collection de tissus : | |||
| Huile de clou de girofle | Better Pharma | N/A | |
| Méthanesulfonate de tricaïne | Sigma-Aldrich | E10521 | Une option alternative à l’extraction de l’ARN de l’huile de clou de girofle |
| : | |||
| Réactif acide à base de guanidinium-phénol (réactif TRIzol) | ThermoFisher Scientific Corp. | ||
| Réactif acide à base de guanidinium-phénol (réactif GENEzol) | Geneaid | GZR100 | |
| Direct-zol | Zymo Research | R2071 | |
| - Prélavage | |||
| lavage | |||
| d’ARN- Eau | |||
| - Colonnes | Zymo-spin IIICG | ||
| - Tubes | |||
| RT-LAMP : | |||
| 1x SD II tampon de réaction | Biotechrabbit | BR1101301 Sulfate de | |
| magnésium (MgSO4) | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| dNTP set | Bioline | BIO-39053 | |
| Bétaïne | Sigma-Aldrich | B2629 | |
| Mélange de calcéine | Merck | 1461-15-0 | |
| Bst ADN polymérase | Biotechrabbit | BR1101301 | |
| AMV transcriptase inverse | Promega | M510A | |
| Eau sans nucléase | Invitrogen | 10320995 | |
| Elite incubateur à bain sec, unité | unique Major Science | EL-01-220 | |
| Électrophorèse sur gel : | |||
| Agarose | Vivantis Technologies | PC0701-500G | |
| Tampon Tris-borate-EDTA (TBE) | Tampon Sigma-Aldrich | SRE0062 | |
| Tris-acetic-EDTA (TAE) : | |||
| - Tris | Vivantis Technologies | PR0612-1KG | |
| - Acide acétique (glacial), EMSURE | Merck Millipore | 1000632500 | |
| - Éthylènediaminetétraacétate disodique dihydraté (EDTA), Vetec | Sigma-Aldrich | V800170-500G | |
| Neogreen NeoScience Co., Ltd. | GR107 | ||
| Colorant de chargement de gel d’ADN (6X) | ThermoFisher Scientific Corp. | R0611 | |
| Échelle et marqueurs ADN | Vivantis Technologies | PC701-100G | |
| Mini Ready Sub-Cell GT (Système d’électrophorèse horizontale) | Alimentation Bio-Rad | 1704487 | |
| PowerPac HC | Bio-Rad | 1645052 | |
| Gel Doc EZ System | Bio-Rad | 1708270 | |
| Bac à échantillons UV | Bio-Rad | 1708271 | |
| N&alpha ; Imageur BI | Neogene Science | ||
| synthèse de l’ADNc : | |||
| ReverTra Ace qPCR RT Kit | Toyobo | FSQ-101 | |
| Viva cDNA | Synthesis Vivantis Technologies | cDSK01 | Une option alternative pour la synthèse de l’ADNc |
| NanoDrop2000 (spectrophotomètre de microvolume) | ThermoFisher Scientific Corp. | ND-2000 | |
| T100 Thermocycleur | Bio-Rad | 1861096 | |
| RT-qPCR : | |||
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 1725120 | |
| Eau sans nucléases, eau stérile | MultiCell | 809-115-CL | |
| Bandelettes PCR 8 tubes, blanc | Bio-Rad | TLS0851 | |
| Tube PCR plat 8 bandelettes, optique | Bio-Rad | TCS0803 | |
| CFX96 Thermocycleur tactile | Bio-Rad | 1855196 | |
| General équipement et matériaux : | |||
| Mayo ciseaux | N/A | ||
| Pince | N/A | ||
| Vortex Genie 2 (mélangeur vortex) | Scientifique Industries | ||
| Microcentrifugeuse LM-60 | LioFuge | CM610 | |
| Corning LSE mini microcentrifugeuse | Corning | 6765 | |
| Pipettes | Rainin | Pipete-Lite XLS QSP pointes | |
| de pipette filtrées | Qualité Scientific Plastics | série TF Corning | |
| Pointes filtrées Isotip | Merck | série | CLS |
| Tubes de microcentrifugation sans nucléases de 1,5 ml, NEST | Wuxi NEST Biotechnology | 615601 |
Références
- Surachetpong, W., et al. Outbreaks of Tilapia Lake Virus Infection, Thailand, 2015-2016. Emerging Infectious Diseases. 23 (6), 1031-1033 (2017).
- Eyngor, M., et al. Identification of a novel RNA virus lethal to tilapia. Journal of Clinic....
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Réimpressions et autorisations
