Article de méthode

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

DOI :

10.3791/61037

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1 mai 2020

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1Skin Research Institute of Singapore, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 2School of Chemical and Life Sciences, Singapore Polytechnic, 3Institute of Medical Biology, Agency for Science, Technology and Research (A*STAR)

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit l’utilisation de l’encombrement macromoléculaire pour créer un modèle de tissu cicatriciel hypertrophique humain in vitro qui ressemble à des conditions in vivo. Lorsqu’ils sont cultivés dans un environnement macromoléculaire surpeuplé, les fibroblastes de peau humaine présentent des phénotypes, de la biochimie, de la physiologie et des caractéristiques fonctionnelles ressemblant au tissu cicatriciel.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il a été démontré que les tissus in vivo sont fortement encombrés par les protéines, les acides nucléiques, les ribonucléoprotéines, les polysaccharides, etc. Le protocole suivant applique une technique d’encombrement macromoléculaire (MMC) pour imiter cette encombrement physiologique par l’ajout de polymères neutres (crowders) aux cultures cellulaires in vitro. Des études antérieures utilisant Ficoll ou dextran comme crowders démontrent que l’expression du collagène I et de la fibronectine dans les lignées cellulaires WI38 et WS-1 sont considérablement améliorées à l’aide de la technique MMC. Cependant, cette technique n’a pas été validée dans les fibroblastes humains de peau hypertrophiques primaires dérivés de cicatrices (hHSF). Comme la cicatrisation hypertrophique résulte du dépôt excessif du collagène, ce protocole vise à construire un modèle de cicatrice hypertrophique in vitro riche en collagène en appliquant la technique MMC avec des HHSF. Ce modèle MMC optimisé a été montré pour posséder plus de similitudes avec le tissu cicatriciel in vivo par rapport aux systèmes traditionnels de culture cellulaire 2 dimensions (2-D). En outre, il est rentable, rentable et souhaitable sur le plan éthique par rapport aux modèles animaux. Par conséquent, le modèle optimisé rapporté ici offre un modèle avancé "in vivo-like" pour les études hypertrophiques liées aux cicatrices.

Introduction

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Le tissu cicatriciel représente le critère final de la réparation des tissus. Cependant, chez de nombreuses personnes, en particulier celles souffrant de brûlures ou detraumatismes 1, les cicatrices peuvent être excessives et imposer des effets indésirables sur la morphologie et le fonctionnement de la peau guérie. Bien que les mécanismes exacts de la formation pathologique (cicatrices hypertrophiques et chéloïdes) ne soient pas entièrement compris, le dépôt excessif du collagène pendant la cicatrisation des plaies a été démontré comme une contribution essentielle2.

Il est bien établi que la transformation du facteur de croissance bêta 1 (TGF-1) et de l’actine alpha lisse du muscle (SMA) jouent un rôle clé dans la formation de cicatrices hypertrophiques. Les preuves suggèrent que le TGF-1 élevé stimule directement le dépôt excessif de collagène par la régulation de la voie de signalisation SMAD3. En outre, il a été constaté que la SAS a contribué à la formation de cicatrices hypertrophiques en régulant la contraction et la réépithelialisation des cellules dans le processus de cicatrisationdes plaies 4. L’absence de modèles in vitro et in vivo appropriés est un obstacle majeur au développement et à l’évaluation des interventions et des thérapies pour l’assainissement des cicatrices. L’objectif de cette étude est d’utiliser la technique MMC existante pour construire un modèle de cicatrice hypertrophique « in vivo » qui convient à l’évaluation des interventions nouvelles et émergentes liées aux cicatrices.

Reproduire des tissus vivants à l’extérieur du corps a été un objectif pendant des années dans la communauté scientifique. Le développement de techniques in vitro au début du XXe siècle a en partie atteint cet objectif. Les techniques in vitro actuelles ont légèrement évolué à partir de la démonstration originale de Roux que les cellules embryonnaires peuvent survivre ex vivo pendant plusieurs jours dans la saline chaude5. Cependant, les méthodologies in vitro sont principalement limitées aux types de cellules individuelles cultivés en 2-D et ne récapitulent pas avec précision les tissus in vivo. Bien qu’ils soient utiles pour examiner la biochimie cellulaire, la physiologie et la génétique, les tissus indigènes sont 3D et intègrent plusieurs types de cellules. Les systèmes in vitro simples en 2D soumettnt les cellules mammifères à des environnements hautement artificiels dans lesquels l’architecture spécifique aux tissus indigènes est perdue6. À son tour, cela affecte les événements intracellulaires et extracellulaires, ayant pour résultat la morphologie anormale de cellules, la physiologie, et le comportement7.

L’intérêt derrière ce protocole réside dans le développement et la gestion clinique des cicatrices hypertrophiques et des chéloïdes. Bien qu’il soit bien établi que les fibroblastes dermiques sont en grande partie responsables de la production abondante de collagènes présents dans le tissu cicatriciel, cultiver des fibroblastes dermiques à l’aide de systèmes in vitro 2-D ne parvient pas à reproduire le chiffre d’affaires du collagène observé in vivo8. Les méthodes in vitro contemporaines utilisent encore essentiellement le « salin chaud », un environnement complètement différent de celui des tissus vivants. Les tissus in vivo sont extrêmement encombrés, avec des protéines, des acides nucléiques, des ribonucléoprotéines et des polysaccharides, occupant 5% à 40% du volume total. Comme il n’y a pas deux molécules pouvant occuper le même espace en même temps, il y a peu d’espace libre disponible et une absence presque totale d’eau libre9.

La technique MMC impose des contraintes affectant les propriétés thermodynamiques des cytosols et des fluides interstitiels. Les interactions moléculaires, les complexes de signalisation récepteur-ligand, les enzymes et les organites sont confinés et interdits d’interagir librement9. Les interactions dans l’environnement périellulaire (c.-à-d. interstitium) sont également limitées. Des preuves récentes confirment que des concentrations élevées de macromolécules inertes dans les solutions bondées perturbent la diffusion, l’association physique, la viscosité et les propriétés hydrodynamiques10.

Fait intéressant, plusieurs agents de crowding populaires (c.-à-d. Ficoll, dextran, polyvinylpyrrolidone [PVP] et sodium 4-styrenesulfonate [PSS]) ne sont pas équivalents lorsqu’ils sont appliqués à différents types de cellules et dans différents contextes. Dans une étude précédente, Ficoll a été rapporté pour être moins cytotoxique pour les cellules souches mésenchymales comparées à PVP. Ces résultats ont été interprétés comme la conséquence de sa charge neutre et du rayon hydrodynamique relativement faible11. En revanche, une deuxième étude a constaté que dextran est plus efficace en stimulant le collagène I dépôt par les fibroblastes pulmonaires humains par rapport à Ficoll12. Les données de notre propre étude suggèrent que Ficoll améliore le dépôt de collagène par les fibroblastes hypertrophiques dérivés de cicatrice, tandis que PVP est toxique pour ces cellules13.

Il a été démontré que la conversion du procollagen en collagène est plus rapide dans un environnement in vivo très encombré14, tandis que le taux de réactions biologiques est retardée dans un système de culture 2D dilué15. Nous avons optimisé le protocole in vitro ici, incorporant MMC pour montrer la culture de fibroblastes dermiques servant de modèle plus " in vivo- comme pour la fibrose cutanée et la formation de cicatrices. Contrairement au système de culture 2D commun, cultiver des HHSF avec MMC stimule la biosynthèse et le dépôt de collagène de manière significative13. Notamment, d’autres caractéristiques de la fibrose (c.-à-d., l’expression accrue des métalloprotéinases matrices [MMPs] et des cytokines proinflammatoires) sont également évidentes en vertu de ce protocole MMC optimisé13. Lorsqu’elles sont cultivées à l’aide de cette méthode, il est démontré que les cellules cutanées récapitulent les paramètres physiologiques, biochimiques et fonctionnels mesurés in vivo.

Le protocole in vitro optimisé MMC a été utilisé pour évaluer l’expression du collagène et d’autres protéines ECM par des fibroblastes dermal isolés du derme de cicatrice hypertrophique et des dermis adjacents non impliqués. Lorsqu’ils sont cultivés dans des environnements MMC in vitro, il a été observé que les HHSF expriment certaines caractéristiques (c.-à-d. l’ARNm, la biochimie, la physiologie et le phénotype) semblables au tissu cicatriciel hypertrophique dermique in vivo. Les preuves indiquent que les propriétés physiques et chimiques sont des considérations importantes lors de la sélection des foules et l’optimisation des conditions MMC pour la culture in vitro.

Pour preuve de principe, le protocole MMC est appliqué ici pour évaluer qualitativement et quantitativement la capacité de Shikonin et de ses analogues à induire l’apoptose. Cela permet l’évaluation des applications potentielles de ces composés de médecine traditionnelle chinoise (TCM) d’origine naturelle pour la gestion des cicatrices cutanées13. Malgré tout, la simplicité, la rentabilité et la rapidité de ce protocole MMC in vitro satisfont également aux réglementations récentes visant à éliminer l’expérimentation chez les mammifères par la directive de l’UE 2010/63/EU et l’Environmental Protection Agency (EPA) des États-Unis.

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Protocole

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1. Culture cellulaire

  1. Maintenir les hHSF et les fibroblastes cutanées fiques normaux dérivés de tissus non pathologiques (hNSF) dans le milieu modifié de l’aigle (DMEM) de Dulbecco contenant 10 % de sérum foetal de veau2(FCS) et 1 % v/v solution de pénicilline/streptomycine (P/S) à 37 oC dans un incubateur avec 5 % de CO 2/95% d’air.
  2. Achetez Ficoll 70, Ficoll 400 et acide ascorbique auprès des entreprises appropriées.

2. Construction du modèle de cicatrice hypertrophique MMC

  1. Ensemencer les hHSF ou les FSN (50 000/puits) dans une plaque de puits de 24 contenant 1 ml de support dans chaque puits.
  2. Placer dans un incubateur de 37 oC à 5 % de CO2 et laisser passer la nuit.
  3. Préparer les médias MMC. Sur la base du volume total requis pour l’expérience, produisez 10 % de supports FCS/DMEM en mélangeant ficoll 70 (18,75 mg/mL), Ficoll 400 (12,5 mg/mL) et acide ascorbique (100 m.).
  4. Placer le mélange dans un bain d’eau de 37 oC pendant 1 h pour disperser les foules dans la solution, puis stériliser le support MMC à l’aide d’un filtre de 0,2 m.
  5. Aspirer les médias dépensés et remplacer par les médias MMC fraîchement faits.
  6. Incuber les cellules pendant 6 jours à 37oC et 5% de CO2, changer les médias tous les 3 jours.

3. Expression de la quantité totale de collagène

  1. Préparer la solution rouge Sirius (0,1% w/v). Dissoudre 0,2 g de poudre de 80 rouge direct dans 200 ml d’eau déionisée distillée (ddH2O) avec 1 ml d’acide acétique.
  2. Aspirez le support MMC et ajoutez 300 L de solution Sirius Red dans chaque puits. Incuber à 37 oC pendant 90 min.
  3. Rincer délicatement la solution Sirius Red avec de l’eau du robinet et laisser sécher la plaque pendant la nuit.
  4. Extraire la tache Sirius Red en ajoutant 200 L d’hydroxyde de sodium (0,1 M) dans chaque puits. Placer la plaque sur un shaker orbital pendant 5 à 10 minutes pour extraire complètement la tache Sirius Red.
  5. Transférer 100 l’une de la tache Sirius Red extraite dans une plaque transparente de 96 et mesurer l’absorption à 620 nm à l’aide d’un lecteur de microplaque.

4. Expression du collagène I (immunostaining)

  1. Laver les puits à l’aide de 200 l de saline tamponnée par le phosphate (PBS, pH à 7,35).
  2. Fixer les cellules à l’aide de méthanol (500 l/puits) à 4 oC pendant 10 min.
  3. Bloquer les interactions non spécifiques avec l’albumine de sérum bovin à 3 % pendant 30 minutes à température ambiante (RT).
  4. Aspirez la solution de blocage et incuber avec 200 L d’anticorps anti-collagène I (10 g/mL) pendant 90 min à RT.
  5. Aspirer l’anticorps primaire et laver 3x avec PBS pendant 5 minutes chacun.
  6. Incubate avec 200 l d’anticorps secondaires de chèvre anti-Rabbit-FITC (1:400 dilution) et 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; 1: 2000 dilution) pour 30 min à RT. Couvrir la plaque avec du papier d’aluminium.
  7. Jetez à la fois l’anticorps secondaire et DAPI et lavez 3x avec PBS pendant 5 minutes chacun.
  8. Visualisez la coloration de fluorescence directement au microscope.

5. Ballonnement occidental

  1. Laver les cellules 2x avec PBS.
  2. Ajouter 40 L de tampon de lyse dans chaque puits et gratter la couche cellulaire avec une pointe de pipette. Le tampon de lyse contient du tampon RIPA, un cocktail inhibiteur de la protéase (PIC), un vanadate de sodium de 2 mM et un fluorure de sodium de 10 mM.
  3. Transférer la protéine lysate dans les tubes de microcentrifuge et mesurer la concentration de protéines à l’aide d’un essai de protéine selon les instructions du fabricant16.
  4. Charger 10 g de protéines de chaque groupe dans les puits de 4 % à 12 % de gels protéinés Bis-Tris. Effectuer le gel de polyacrylamide de sulfate de sodium électrophoresis (SDS-PAGE) à 200 V pendant 30 min.
  5. Transférer la protéine dans la membrane de nitrocellulose en exécutant une tache occidentale à 90 V pendant 90 min. Évitez la formation de bulles d’air entre le gel et la membrane de nitrocellulose.
  6. Bloquez la membrane avec 10 ml de tampon de blocage.
  7. Incuber avec des anticorps primaires à 4 oC pendant la nuit. Les anticorps primaires sont : anti-collagène I, anti-collagène III, anti-collagène IV, anti-SMA, anti-MMP-1, anti-MMP-2, anti-MMP-9, anti-MMP-13, et déshydrogénase anti-glyceraldéhyde 3-phosphate (GAPDH).
  8. Laver la membrane avec 0,1% TBS-Tween 20 (5x pour 5 minutes chacun). TBS/Tween 20 (1 L) contient ce qui suit : 50 ml de Tris de 1 M (pH à 7,4), 30 ml de chlorure de sodium de 5 M, 1 ml de Tween 20 et 920 ml de ddH2O.
  9. Incuber avec une espèce anticorps secondaire approprié à RT pour 1 h.
  10. Répétez l’étape 5.8 et visualisez la fluorescence à l’aide d’un système d’imagerie.

6. RT-PCR

  1. Recueillir l’ARN total à l’aide de la mémoire tampon de lyse mélangé avec 2-mercaptoethanol inclus dans le kit d’analyse d’extraction d’ARN.
  2. Purifier l’ARN selon les instructions du fabricant17.
  3. Mesurer la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume.
  4. Effectuez la synthèse de l’ADNC de premier brin à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNC selon les instructions du fabricant.
  5. Les amorces d’oligoucucléotide RT-PCR sont fournies (précoated) dans des plaques de puits personnalisées de 96. Mélanger 100 ng des échantillons d’ADN avec 10 L de supermix vert SYBR dans la plaque personnalisée.
  6. Augmenter le volume total à 20 L/puits à l’aide de ddH2O.
  7. Exécuter RT-PCR à l’aide d’un cycle thermique suivant les instructions du fabricant: 40 cycles de dénaturage à 98 oC pour 15 s et annealing /extension à 60 'C pour 60 s. Les gènes testés dans RT-PCR comprennent: COL1A1, COL3A1, ACTA2, SMAD2, SMAD3, SMAD4, SMAD7, IL1A, IL1B, IL6, IL8, MMP1, MMP2, MMP3, TGFB1, et VEGF.

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Résultats

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Des échantillons de triplicate ont été effectués dans chaque expérience, et chaque expérience a été répétée 3x utilisant des cellules de trois patients individuels. Les données sont exprimées en pourcentage du groupe témoin. Le test post-hoc d’ANOVA et Tukey a été appliqué pour analyser les différences statistiques(p - 0,05).

MMC utilisant Ficoll à 9% FVO (occupation fractionnelle du volume) améliore la quantité totale de collagène et de collagène I dépôt dans hHSF13...

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Discussion

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Ce protocole vise à optimiser et à authentifier un modèle in vitro amélioré : cicatrice-dans-un-jar " pour le tissu cicatriciel cutané humain. Des études antérieures ont rapporté l’application de la technique MMC aux fibroblastes pulmonaires humains12, les cellules souches mésenchymales de moelle osseuse humaine23, et les fibroblastes cutanées humains23 utilisant dextran12, Ficoll12, et PVP

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été soutenus par le financement de l’Agence singapourienne pour la science, la technologie et la recherche "SPF 2013/004: Skin Biology Basic Research" et de l’IAF-PP/2017 (HBMS) H17/01/a0/009. Les auteurs reconnaissent avec gratitude les conseils et l’aide du Dr Paula Benny et du Dr Michael Raghunath.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,2 &mu ; m filterSartorius16534
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)Thermo Fisher ScientificP36962
Alexa Fluor 680Thermo Fisher ScientificA-21076
Alexa Fluor 800Thermo Fisher ScientificA-11371
alpha anticorps primaire d’actine musculaire lisse alpha (&alpha ;SMA)Abcamab5694
Applied Biosystems 7500 Système PCR rapide en temps réel (thermocycleur)Thermo Fisher Scientific4351106
Acide ascorbiqueWako#013-12061
Albumine sérique bovineSigma-Aldrich#A2153
Bradford protein assayBio-Rad500-0006
Collagène I Anticorps primaire (pour l’immunomarquage)Abcam6308
Collagène I Anticorps primaire (pour Western Blot)Abcamab21286
Collagène III Anticorps primaireAbcamab7778
Collagène IV Anticorps primaireAbcamab6586
Direct Red 80Sigma-Aldrich2610108
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Life Technologies11996-065
Sérum de veau fœtal (FCS)Life Technologies6000-044
Ficoll 400GE HealthCare#17-0300-10
Ficoll 70GE HealthCare#17-0310-10
Anticorps primaire GAPDHSigma-AldrichG8795
Anticorps secondaire anti-lapin de chèvreAbcamab97050
Cicatrice hypertrophique humaine/fibroblastes normaux (hHSF/hNSF)Cell Research Corporation106, 107, 108
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad#1708890
MMP-1 anticorps primaireAbcamab38929
MMP-13 anticorps primaireAbcamab39012
Anticorps primaire MMP-2Abcamab37150
Anticorps primaire MMP-9Abcamab38898
Spectrophotomètres microvolume NanoDropThermo Fisher ScientificN/A
Membrane nitrocellulosiqueBio-Rad10484060
NuPAGE Gels de protéines Bis-Tris à 4 %Thermo Fisher ScientificNP0321BOX
Tampon de blocage OdysseyLI-COR Biosciences927&ndash ; 40000
Odyssey Fc Imaging SystemLI-COR BiosciencesN/D
Microscope HCS Olympus IX-81 (pour immunomarquage)OlympusN/A
Solution de pénicilline/streptomycine (P/S)Life Technologies15140-122
Tests PrimePCRBio-RadAmorces personnalisées pré-revêtues en plaques de 96 puits en fonction des besoins
Cocktail d’inhibiteurs de protéase (PIC)Sigma-Aldrich11697498001
PVP 360Sigma#PVP360
PVP 40Sigma#PVP40
Tampon RIPAMerckR0278
RNeasy Plus Mini KitQIAGEN#74134
Vanadate de sodiumSigma-Aldrich450022
Sodium vanadateSigma-Aldrich450243
SpectraMax M5 Lecteur de microplaques multimodeDispositifs moléculairesN/A
SsoAdvanced universel SYBR green supermixBio-Rad#172-5270
Tween 20Sigma-AldrichP9416

Références

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