La génération de rotavirus recombinants à partir de l’ADN plasmide fournit un outil essentiel pour l’étude de la réplication et de la pathogénie du rotavirus, et le développement de vecteurs et de vaccins d’expression de rotavirus. Ici, nous décrivons une approche simplifiée de génétique inverse pour générer des rotavirus recombinés, y compris des souches exprimant des protéines fluorescentes de reporter.
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Article de méthode
Méthode simplifiée de génétique inversée pour récupérer les rotavirus recombinés exprimant des protéines reporter
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les rotavirus sont une population importante et évolutive de virus à ARN à double brin segmenté qui causent une gastro-entérite sévère chez les jeunes de nombreuses espèces hôtes mammifères et aviaires, y compris les humains. Avec l’avènement récent des systèmes de génétique inverse du rotavirus, il est devenu possible d’utiliser la mutanèse dirigée pour explorer la biologie du rotavirus, modifier et optimiser les vaccins antirotavirus existants, et développer des vecteurs vaccinaux multitargets rotavirus. Dans ce rapport, nous décrivons un système de génétique inverse simplifié qui permet le rétablissement efficace et fiable des rotavirus recombinants. Le système est basé sur la co-transfection des vecteurs de transcription T7 exprimant le rotavirus pleine longueur (MD) ARN et un vecteur CMV codant une enzyme de plafonnement de l’ARN dans les cellules BHK produisant constitutivement la polyméase d’ARN T7 (BHK-T7). Les rotavirus recombinants sont amplifiés en supervisant les cellules BHK-T7 transfectedes avec des cellules MA104, une lignée de cellules rénales de singe qui est fortement permissive pour la croissance du virus. Dans ce rapport, nous décrivons également une approche pour générer des rotavirus recombinants qui expriment une protéine distincte de reporter fluorescent par l’introduction d’un élément de stop-restart translationnel 2A dans le segment 7 du génome (NSP3). Cette approche évite de supprimer ou de modifier l’un des cadres de lecture ouverts viraux, permettant ainsi la production de rotavirus recombinants qui conservent des protéines virales entièrement fonctionnelles tout en exprimant une protéine fluorescente.
Introduction
Les rotavirus sont des causes majeures de gastro-entérite sévère chez les nourrissons et les jeunes enfants, ainsi que les jeunes de nombreuses autres espèces de mammifères et devian1. En tant que membres de la famille Reoviridae, les rotavirus ont un génome segmenté d’ARN à double brin (ARNN). Les segments du génome sont contenus dans une virion icosahedral nonveloped formée à partir de trois couches concentriques de protéines2. Sur la base du séquençage et de l’analyse phylogénétique des segments du génome, neuf espèces de rotavirus (A-D, F-J) ont été définies3. Ces souches comprenant l....
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Protocole
1. Préparation des médias et entretien de la culture cellulaire
- Obtenez des cellules rénales de hamster de bébé exprimant constitutivement la polymérase d’ARN de T7 (BHK-T7) et les cellules MA104 de rein vert africain de singe.
REMARQUE : Les cellules BHK-T7 (ou BSR-T7) ne sont pas disponibles dans le commerce, mais sont une lignée cellulaire commune de laboratoires utilisant la génétique inverse pour étudier la biologie du virus de l’ARN. La lignée cellulaire BHK-T7 utilisée dans ce protocole a été obtenue du Dr Ursula J. Buchholz (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA), un co-développeur de la lignée cellulaire originale BHK exprimant la poly....
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Résultats
Le protocole de génétique inverse décrit dans cet article se déroule par de multiples étapes distinctes : (1) la co-transfection des cellules BHK-T7 avec des vecteurs de transcription de rotavirus pT7 et un plasmide d’expression pCMV/NP868R, (2) supervision des cellules BHK-T7 transfectedes avec des cellules MA104, (3) amplification des virus recombinés présents dans les cellules BHK-T7/MA104 lysates à l’aide de cellules MA104, et (4) l’isolement de la plaque du virus recombinant à l’aide des cellules MA104
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Discussion
Dans notre laboratoire, nous comptons régulièrement sur le protocole de génétique inverse décrit ici pour produire des rotavirus SA11 recombinants. Avec cette approche, les individus ayant peu d’expérience dans les techniques de biologie moléculaire ou de travailler avec des rotavirus récupérer les virus recombinés, même sur leur première tentative. Nous avons généré près de 100 virus recombinés à la suite de ce protocole, y compris ceux dont les génomes ont été repeménent pour exprimer des protéines étrangères (p. ex., .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les subventions des NIH R03 AI131072 et R21 AI144881, Indiana University Start-Up Funding, et le Lawrence M. Blatt Endowment. Nous remercions les membres du laboratoire IU Rotahoosier, Ulrich Desselberger, et Guido Papa pour leurs nombreuses contributions et suggestions dans l’élaboration du protocole de génétique inversée.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Bébé hamster Rein - T7 RdRP (BHK-T7) Cellules | Contact : ubuchholz@niaid.nih.gov | ||
| Bio-Rad 8-16 % Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Bio-Rad | 45608105 | |
| Compteur de cellules viables | Nexcelom | ||
| ChemiDoc MP Système d’imagerie en gel | Bio-Rad | ||
| Chloroform | MP | 194002 | |
| Clarity Western Substrat de chimiluminescence améliorée (ECL) | Bio-Rad | 170-5060 | |
| Competent E.coli DH5alpha Bacteria | Lucigen | 60602-2 | |
| Complete Protease Inhibitor | Pierce | A32965 | |
| Pipettes de transfert jetables, pointes allongées ultrafines | MTC Bio | P4113-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Lonza | 12-604F | |
| Eagle’s Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM) | Qualité Biologique | 115-073-101 | |
| Éthanol, Absolu (200 proof) | Fisher Bioreagents | BP2818-500 | |
| Solution de bromure d’éthidium (10 mg/ml) | Invitrogen | 15585-011 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Corning | 35-010-CV | |
| Sérum fœtal bovin (FBS), Anticorps | Corning | 35-011-CV | |
| Flag M2 inactivé par la chaleur, souris monoclonale | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit | Sigma | NA0200-1KT | |
| Geneticin (G-418) | Invitrogen | 10131-027 | |
| Gibco FluroBrite DMEM | ThermoFisher | A1896701 | DMEM avec faible bruit de fond fluorescence |
| Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM) | Gibco | 11710-035 | |
| Chèvre Anti-Lapin IgG, Raifort Peroxydase (HRP) | Technologie de signalisation cellulaire | 7074S | |
| Cobaye Anti-NSP3 Antisérum | Patton | lot de laboratoire 55068 | |
| Cochon d’Inde Anti-VP6 Antierum | Patton | lot de laboratoire 53963 | |
| IgG anti-cobaye de cheval, peroxydase de raifort (HRP) conjuguée | KPL | 5220-0366 | |
| IgG anti-souris de cheval, raifort eroxydase (HRP) | Technologie de signalisation cellulaire | 7076S | |
| iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma Kit de détection PCR | JH Science | 25235 | |
| Alcool isopropylique | Macron | 3032-02 | |
| L-glutamine Solution ( 100x) | Gibco | 25030-081 | |
| Poudre d’agar Luria (Miller’s LB Agar) | Produits de recherche RPI | L24020-2000.0 | |
| Medium 199 (M199) Milieu de culture | Hyclone | Sh30253.01 | |
| Minimal Essential Medium -Eagle Joklik’s Forumation (SMEM) | Lonza | 04-719Q | |
| Monkey Kidney (MA104) Cellules | ATCC | ATCC CRL-2378.1 | |
| Spectrophotomètre NanoDrop One | Solution | ||
| (0,33 %) | Sigma-Aldrich | N2889-100ml | |
| Solution d’acides aminés non essentiels (100x) | Gibco | 11140-050 | |
| Novex 10 % Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel | Invitrogen | XP00102BOX | |
| Eau de biologie moléculaire sans nucléase | Invitrogen | 10977-015 | |
| NucleoSpin Gel et kit de nettoyage PCR | Takara | 740609.25 | |
| Opti-MEM Sérum réduit moyen | Gibco | 31985-070 | |
| Pilon en granulés (sans RNase, jetable) | Fisher | 12-141-368 | |
| Solution de pénicilline-streptomycine, (100x penn-streptocoque) | Corning | 30-002-Cl | |
| Phosphate Solution saline tamponnée (PBS), 10x | Fisher Bioreagents | BP399-20 | |
| Trypsine porcine, type IX-S | Sigma-Aldrich | T0303 | |
| PureYield Plasmid Miniprep System | Promega | A1223 | |
| Qiagen Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12162 | |
| Qiagen Plasmid Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Vecteurs de transcription Qiagen | 27104 | |
| SA11 pT7 Addgene | 89162-89172 | ||
| SA11 pT7/NSP3 Vecteurs de transcription exprimant des protéines | Contact : jtpatton@iu.edu | ||
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50000 | Pour l’électrophorèse sur gel |
| SeaPlaque agarose | Lonza | 50100 | Pour le dosage de la plaque |
| Superscript III Kit RT-PCR en une étape | Invitrogen | 12574-035 | |
| Trans-Blot Turbo Kit de transfert de nitrocellulose | Bio-Rad | 170-4270 | |
| Système de transfert de turbo Trans-Llot | Bio-Rad | ||
| TransIT-LTI Réactif de transfection | Mirus | MIR2306 | |
| Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x) | Bio-Rad | 161-0772 | |
| Triton X 100 | Fisher Bioreagents | BP151-500 | |
| Réactif d’extraction d’ARN de trizol | Ambion | 15596026 | |
| Trypan blue | Corning | 25-900-CI | |
| Trypsine (0,05 %)-EDTA (0,1 %) Dissociation cellulaire Solution | Qualité Biologique | 118-087-721 | |
| Bouillon de phosphate de tryptose | Gibco | 18050-039 | |
| Tween-20 | VWR | 0777-1L | |
| Vertrel VF solvant | Zoro | G0707178 | |
| Zoe Imageur fluorescent à cellules vivantes | Bio-Rad |
Références
- Crawford, S. E., et al. Rotavirus infection. Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).
- Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. Atomic model of an infectious rotavirus particle. The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).
- Intern....
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Réimpressions et autorisations
