Démonstration du contrôle de la morphologie des polymères électrofilés pour l’ingénierie tissulaire à l’aide de la lignée cellulaire hepG2

Résumé

Cette méthode permet de tester différentes morphologies et topographies de fibres polycaprolactones à des fins d’ingénierie tissulaire. Les petites et grandes fibres sont fabriquées avec des orientations aléatoires, des orientations alignées, ainsi que des structures cryogéniques poreuses électrofilées et utilisées comme plates-formes pour la culture cellulaire.

Résumé

L’électrofilage offre aux chercheurs la possibilité de fabriquer des fibres polymères reproductibles à l’échelle micro à nanométrique. L’architecture fibreuse 3D des polymères électrofilés est considérée comme une imitation structurelle de la matrice extracellulaire (ECM). Par conséquent, les fibres électrofilées fabriquées à partir de polymères biocompatibles ont été largement étudiées par les chercheurs en ingénierie tissulaire pour leur rôle potentiel en tant qu’ECM artificielle pour guider la croissance tissulaire à la fois in vitro et in vivo. Toutes les cellules sont extrêmement sensibles à leur environnement mécanique. Cela a été démontré par la découverte de multiples voies de mécanotransduction intrinsèquement liées aux filaments d’actine du cytosquelette. Le cytosquelette agit comme un capteur mécanique qui peut diriger la fonctionnalité et la différenciation de la cellule hôte en fonction de la rigidité et de la morphologie de son substrat. Les fibres électrofilées peuvent être réglées à la fois en termes de taille et de morphologie des fibres pour moduler facilement l’environnement mécanique à l’intérieur d’un échafaudage en polymère fibreux. Ici, les méthodes d’électrofilage de la polycaprolactone (PCL) pour trois morphologies distinctes à deux diamètres de fibre différents sont décrites. Les catégories de fibres morphologiques se composent de fibres orientées de manière aléatoire, de fibres alignées et de fibres poreuses filées cryogéniquement, avec des diamètres de 1 μm et 5 μm. Les méthodes détaillées dans cette étude sont proposées comme plate-forme pour étudier l’effet de l’architecture des fibres électrofilées sur la génération de tissus. La compréhension de ces effets permettra aux chercheurs d’optimiser les propriétés mécaniques des fibres électrofilées et de démontrer plus en profondeur le potentiel de cette technologie.

Introduction

Des méthodes d’ingénierie tissulaire se sont développées au cours des dernières décennies pour fournir aux cellules un environnement biomimétique afin de favoriser une régénération tissulaire réussie, à la fois pour les modèles de tissus in vitro et les techniques de régénération in vivo. Ces méthodes encouragent généralement les cellules à former des agrégats 3D, soit par elles-mêmes, soit à l’aide d’un échafaudage de guidage¹. Les échafaudages peuvent être fabriqués sous forme de nano/microstructures de polymères poreux ou^fibreux, ou d’hydrogels ^2,3,4 hautement absorbants d’eau. L’électrofilage des polymères est une technique de fabrication courante qui permet d’obtenir des matrices de fibres polymères non tissées à l’échelle nanomicroscopique qui peuvent imiter l’architecture fibreuse de la matrice extracellulaire native (ECM)⁵. De multiples polymères biocompatibles sont applicables au processus d’électrofilage ; Par conséquent, les fibres électrofilées sont un support populaire pour faciliter la régénération des tissus ^6,7,8. Les fibres électrofilées ont été utilisées dans la culture d’une gamme de tissus, démontrant une voie prometteuse pour des plates-formes d’échafaudage peu coûteuses et reproductibles 9,10,11,12,13.

Les cellules ont une sensibilité aiguë à leur environnement mécanique. Des recherches antérieures ont mis en évidence cette relation importante, appelée mécanotransduction, qui peut influencer la fonction, la morphologie et la différenciation cellulaires^14,15. La base du cytosquelette cellulaire eucaryote est construite à partir d’actine filamenteuse et joue des rôles mécaniques clés dans la division cellulaire, l’adhésion, la migration, la contraction et la morphologie. Il est manipulé par des stimuli mécaniques externes via la connexion avec des protéines de surface extracellulaires 16,17,18. L’influence morphologique sur la différenciation des cellules souches a été démontrée dans de nombreuses études en modifiant la forme d’un substrat attachable, qui est alors capable de contrôler la forme cellulaire et de diriger le processus de différenciation^19,20. De plus, la rigidité du substrat sur lequel les cellules se fixent influence également le destin et la lignée des cellules souches^21,22. Outre les cellules souches, il a également été observé que ces effets affectent les cellules de différentes lignées^23,24. Les méthodes d’ingénierie tissulaire tridimensionnelle ont montré des résultats similaires à ceux trouvés dans les études de mécanotransduction 2D avec des hydrogels et des échafaudages fibrillaires 25,26,27. De plus, la mécanique du substrat est communiquée par des agrégats de cellules 3D via la signalisation cellule-cellule²⁸. La mécanique des matériaux joue un rôle crucial dans la direction de la fonctionnalité cellulaire et devrait donc être un facteur majeur dans la conception d’échafaudages pour les tissus modifiés.

L’objectif de cette méthode est de comprendre les effets de la taille et de la morphologie des fibres de polycaprolactone électrofilée (PCL) sur les cultures cellulaires in vitro. La méthode est adaptée de recherches antérieures axées sur l’ingénierie des tissus rénaux⁹. Un protocole étape par étape plus détaillé est proposé ici afin de faciliter la reconstruction d’échafaudages et de développer une méthode standardisée applicable à tous les types de cellules. Six groupes d’échafaudages ont été construits avec cette méthode : trois sont de grandes fibres de 5 μm (LG) et les trois autres de petites fibres de 1 μm (SM), en utilisant différentes concentrations de PCL. Au sein de ces groupes LG et SM, il existe trois constructions morphologiques différentes : les fibres aléatoires (RA), les fibres alignées (AL) et les fibres cryogéniques poreuses (CR). Ces groupes d’échafaudages ont tous des structures intrinsèquement différentes et fournissent ainsi des environnements mécaniques locaux uniques sur lesquels les cellules se fixent. Pour démontrer l’effet morphologique que cela produit sur les cellules, la lignée cellulaire hepG2 a été ensemencée sur chaque groupe d’échafaudages dans le cadre d’une étude représentative. Cette méthode est proposée comme analyse de référence pour la conception d’échafaudages électrofilés pour tous les types de cellules, des cellules souches aux lignées cellulaires et aux cellules primaires.

Protocole

1. Préparation de la solution

1. Fibres de grande taille (aléatoires, alignées et cryogéniques)
   1. Préparez un rapport de 5:1 de chloroforme et de méthanol en mélangeant 50 mL de chloroforme et 10 mL de méthanol dans un flacon en verre résistant aux solvants à l’aide d’une pipette sérologique en verre.
      ATTENTION : Le chloroforme et le méthanol sont des solvants toxiques et le mélange doit être effectué dans une hotte.
   2. Pour créer une solution à 19 % p/v de PCL dans du chloroforme 5:1, peser 1,9 g de PCL et l’ajouter à 10 mL de chloroforme :méthanol 5:1 dans un flacon en verre résistant aux solvants. Fermez deux fois le flacon à l’aide d’un film de paraffine et laissez le flacon sur un rouleau pendant la nuit pour permettre au PCL de se dissoudre complètement.
      ATTENTION : Le mélange doit être effectué dans une hotte.
2. Petites fibres (aléatoires et alignées)
   1. Pour préparer une solution à 7 p/v de PCL dans de l’hexafluoroisopropanol (HFIP), peser 0,7 g de PCL et mélanger avec 10 mL de HFIP dans un flacon en verre résistant aux solvants. Fermez deux fois le flacon à l’aide d’un film de paraffine et laissez-le sur un rouleau pendant la nuit pour permettre au PCL de se dissoudre complètement.
      ATTENTION : Le HFIP est hautement toxique et le mélange doit être effectué dans une hotte.
3. Petites fibres cryogéniques
   ATTENTION : Le mélange doit être effectué dans une hotte.
   1. Préparez un rapport de 3:1 de chloroforme et de méthanol en mélangeant 30 mL de chloroforme et 10 mL de méthanol dans un flacon en verre résistant aux solvants à l’aide d’une pipette sérologique en verre.
   2. Pour créer une solution à 14 % p/v de PCL dans du chloroforme :méthanol 3:1, peser 1,4 g de PCL et l’ajouter à 10 mL de chloroforme :méthanol 3:1 dans un flacon en verre résistant aux solvants. Fermez deux fois le flacon à l’aide d’un film de paraffine et laissez-le sur un rouleau pendant la nuit pour permettre au PCL de se dissoudre complètement.

2. Configuration de l’électrofilage

REMARQUE : Les paramètres doivent être réglés avant de commencer le processus d’électrofilage.

1. Taille et placement de l’aiguille
   1. Pour les fibres de grande taille (aléatoires, alignées et cryogéniques), utilisez une aiguille en laiton de 1 mm de diamètre extérieur/0,8 mm de diamètre intérieur et placez l’aiguille à 230 mm de la surface du mandrin.
   2. Pour les petites fibres, utilisez une aiguille en laiton de 1 mm de diamètre extérieur/0,4 mm de diamètre intérieur et placez l’aiguille à 15 mm de la surface du mandrin.
2. Mouvement latéral de l’aiguille
   REMARQUE : Les échafaudages détaillés à la figure 1 ont été fabriqués avec une traverse d’aiguille de 100 mm à 50 mm/s, avec des mouvements répétés à gauche et à droite tout au long du processus.
   1. Pour régler le mouvement latéral, appuyez sur Mouvement | TNS 1 et réglez la position de départ [mm] sur -50, la distance [mm] sur 100, la vitesse [mm/s] sur 50 et le délai de tour [ms] sur 750.
3. Débit de la pompe à seringue
   1. Pour les fibres de grande taille (aléatoires, alignées et cryogéniques), appuyez sur l’onglet Matériau de l’interface utilisateur et réglez le pousse-seringue sur 4 mL/h.
   2. Pour les petites fibres (aléatoires et alignées), réglez le pousse-seringue à 0,8 mL/h.
   3. Pour les petites fibres cryogéniques, réglez le pousse-seringue à 2,5 mL/h.
4. Paramètres de tension
   1. Pour les grosses fibres, réglez la tension de l’aiguille à +15 kV et la tension du mandrin à -4 kV en appuyant sur l’onglet Tension de l’interface utilisateur et en modifiant les valeurs de tension positive et négative.
   2. Pour les petites fibres (aléatoires et alignées), réglez la tension de l’aiguille à +17 kV et la tension du mandrin à -4 kV.
   3. Pour les petites fibres cryogéniques, réglez la tension de l’aiguille à +18 kV et la tension du mandrin à -4 kV.
5. Rotation du mandrin (grandes et petites fibres)
   1. Pour des fibres aléatoires, appuyez sur Mouvement | Ciblez et réglez la vitesse de rotation du mandrin à 250 tr/min.
   2. Pour les fibres alignées, réglez la vitesse de rotation du mandrin sur 1 800 tr/min.
   3. Pour les fibres cryogéniques, réglez la vitesse de rotation du mandrin sur 180 tr/min.

3. Électrofilage de fibres aléatoires et alignées (grandes et petites fibres)

1. Insérez l’aiguille (reportez-vous à la section 2.1 pour plus d’informations sur la taille et le placement de l’aiguille) dans un tube en PTFE de 1 mm d’alésage et fixez-le dans le porte-aiguille de l’électrospinner.
2. Sous une hotte, transférez les 10 ml de solution polymère dans une seringue en polypropylène ou en verre (résistant aux solvants). Assurez-vous d’éliminer toutes les bulles en laissant reposer la seringue avant l’amorçage.
3. Connectez la seringue à l’aiguille via le tube en PTFE et fixez la seringue à l’intérieur du pousse-seringue. Une fois connecté, amorcez le tube en PTFE en pressant le piston de la seringue et en remplissant le tube avec une solution polymère.
4. Enveloppez le mandrin dans du papier d’aluminium et fixez-le sur le dispositif de rotation du mandrin.
5. Activez la rotation du mandrin en appuyant sur Mouvement | Cible | Tournez et le pousse-seringue en appuyant sur Matériau | Démarrer la pompe 1.
6. Lorsqu’un petit cordon de polymère s’est formé à l’extrémité de l’aiguille, allumez la tension en appuyant sur ACTIVATE HIGH VOLTAGE. Un jet de polymère doit ensuite être émis à partir d’une saillie conique d’une solution de polymère, appelée cône de Taylor. Vérifiez le mandrin pour confirmer le dépôt de fibres sur la surface du mandrin.
7. Exécutez le processus d’électrofilage jusqu’à ce que la quantité souhaitée de solution PCL soit électrofilée.
   REMARQUE : Pour les échafaudages présentés à la figure 1, 4 mL de solution ont été électrofilés.
8. Une fois l’électrofilage terminé, retirez la feuille d’aluminium recouverte de la fibre du mandrin et laissez-la dans une sorbonne pendant la nuit pour permettre l’évaporation excessive du solvant.
9. Après évaporation, stockez les fibres à température ambiante (RT).

4. Électrofilage de fibres cryogéniques

1. Pour l’électrofilage cryogénique, utilisez le mandrin de cryo-filage. Répétez les étapes 3.1 à 3.3, puis passez aux étapes suivantes.
2. Enveloppez le mandrin dans du papier d’aluminium.
3. Remplissez le mandrin de granulés de glace carbonique. Fixez le couvercle du mandrin de cryo-filature sur le mandrin pour vous assurer que la glace carbonique ne peut pas s’échapper du mandrin mais que la pression peut s’échapper. Des cristaux de glace devraient se former à la surface du mandrin presque immédiatement.
   ATTENTION : Utilisez des gants de protection lorsque vous manipulez de la glace sèche pour éviter les brûlures dues au froid.
4. Fixez le mandrin sur le dispositif de rotation du mandrin et activez immédiatement la rotation du mandrin en appuyant sur Motion | Cible | Tournez et le pousse-seringue en appuyant sur Matériau | Démarrer la pompe 1.
5. Une fois qu’une perle de polymère s’est formée à l’extrémité de l’aiguille, activez la tension en appuyant sur ACTIVATE HIGH VOLTAGE. Un jet de polymère doit ensuite être émis à partir d’une saillie conique d’une solution de polymère (c’est-à-dire le cône de Taylor). Vérifiez le mandrin pour confirmer le dépôt de fibres sur la surface du mandrin.
6. Après 1 h d’électrofilage, interrompez le processus en appuyant sur STOP ALL et remplissez le mandrin de glace carbonique. Assurez-vous d’une protection adéquate contre les vapeurs de solvant lors du remplissage du mandrin. Effectuez cela pour un total de 3x pendant 4 h de temps d’électrofilage.
   REMARQUE : L’électrofilage peut être repris en répétant les étapes 4.4 et 4.5.
7. Une fois l’électrofilage terminé, retirez délicatement le mandrin et placez-le immédiatement dans un lyophilisateur pendant 24 h pour sublimer les cristaux de glace à la surface du mandrin.
8. Après sublimation, retirez la feuille recouverte de fibres du mandrin et rangez-la chez RT, en prenant soin d’éviter l’écrasement.

5. Poinçonnage d’échafaudage

1. Poinçonnez des échafaudages à partir de la feuille de fibres à l’aide d’un poinçon de biopsie de 10 à 12 mm. Si les fibres restent collées à la feuille d’aluminium, placez les échafaudages dans de l’éthanol à 70 % pour faciliter le détachement.

6. Stérilisation et enrobage plasma

1. Placez les échafaudages (1 échafaudage par puits) dans une plaque de 24 ou 48 puits et lavez-les 3x avec de l’éthanol à 70 %. Laisser immergé lors du lavage final, placer dans un congélateur à -80 °C et laisser congeler.
2. Une fois congelée, placez la plaque dans un lyophilisateur et lyophilisez pendant 24 h. Les échafaudages séchés peuvent maintenant être recouverts de plasma.
   REMARQUE : S’il n’y a pas d’accès à un enrobeur de plasma, immerger les échafaudages dans un antibiotique-antimycosique à 1 % (Anti-Anti) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et laisser incuber à 37 °C pendant la nuit.
3. Placez la plaque dans la chambre à plasma et retirez le couvercle. Faites fonctionner l’enrobeur plasma à 500 mTorr et à une puissance radiofréquence (RF) moyenne pendant 30 s.
4. Après le revêtement au plasma, immergez les échafaudages dans 1 mL de PBS et 1 % d’Anti-Anti. Les échafaudages doivent absorber facilement la solution PBS.
   REMARQUE : Les échafaudages sont maintenant prêts à être ensemencés avec des cellules.

7. Préparation et ensemencement des cellules

REMARQUE : La technique de culture cellulaire de base fournie ci-dessous concerne les cellules hepg2 utilisées à des fins de démonstration dans les résultats représentatifs. Ces principes peuvent être appliqués à tout type de cellule adhérente ; Cependant, différentes cellules peuvent nécessiter des matériaux et des processus différents. La manipulation des cellules doit être effectuée dans une enceinte de sécurité biologique, selon une technique aseptique.

1. Prendre 1 x 10⁶ cellules hepg2 cryoconservées et les ensemencer dans un flacon de culture cellulaire T75 avec 12 mL de milieu complet composé de milieux essentiels minimaux d’Eagle (EMEM) complétés par 10 % de sérum de bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline-streptomycine, 5 mM de L-glutamine et 1 % d’acides aminés non essentiels.
2. Une fois que les cellules sont à 80 % de confluence, détachez les cellules du ballon de culture en les lavant 3 fois dans du PBS et en les incubant dans 2 mL de trypsine à 37 °C pendant 4 min. Après avoir tapoté le flacon, les cellules doivent se détacher.
3. Désactiver la trypsine en ajoutant 8 mL de milieu complet. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL et faites tourner les cellules dans une centrifugeuse à 120 x g pendant 5 min.
4. Retirer le surnageant au-dessus de la pastille de cellule à l’aide d’une pipette aspirante et le remplacer par 5 mL de milieu complet. Remettez les cellules en suspension en pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette sérologique de 5 ml.
5. Comptez la suspension cellulaire résultante via la méthode d’exclusion du bleu trypan. Prendre 100 μL de suspension cellulaire et l’ajouter à 100 μL de bleu de trypan dans un flacon de 1,5 mL. Introduisez le mélange dans un hémocytomètre sous une lamelle en verre et comptez les cellules au microscope.
6. Ajustez la concentration cellulaire à 2,6 x 10⁶ cellules/mL en ajoutant ou en supprimant le milieu complet. Pour retirer le fluide, centrifugez les cellules à 220 x g pendant 5 min, retirez le fluide requis et remettez les cellules en suspension.
7. Aspirez l’anti-anti-anti-1 % dans le PBS de la plaque de puits et semez 50 μL de suspension cellulaire de^2,6 x 10 6 cellules/mL sur la surface de l’échafaudage à l’aide d’une pipette de 200 μL.
8. Laisser les cellules se fixer sous l’incubation à 37 °C et 5 % de CO₂ pendant 1 à 3 h, en veillant à ce qu’elles ne se dessèchent pas. Une fois fixé, ajoutez 300 μL (pour une plaque à 48 puits) ou 500 μL (pour une plaque à 24 puits) de milieu de culture et incubez à 37 °C et 5 % de CO₂.
   REMARQUE : Les techniques standard de culture cellulaire peuvent être utilisées à partir de là jusqu’à une analyse fonctionnelle plus approfondie.

Résultats

La figure 1 montre des images au microscope électronique à balayage (MEB) de petites fibres (~1 μm) et de grandes fibres (~5 μm) fabriquées à partir de solutions PCL. Les fibres ont été recouvertes d’or-palladium (60:40) pendant 30 secondes à l’aide d’un revêtement par pulvérisation avant l’imagerie MEB. De grosses fibres ont été produites en utilisant une concentration élevée de 19 % p/v de PCL dans une solution 5:1 de chloroforme et de méthanol pour créer une solution de PCL à haute viscosité. Cette solution à haute viscosité a ensuite été électrofilée à un débit élevé pour émettre un grand fil de solution polymère dans le champ électrique. Par conséquent, une grande distance de 230 mm entre l’aiguille et le mandrin était nécessaire pour assurer une évaporation efficace du solvant avant le dépôt sur le mandrin. À l’inverse, des fibres plus petites ont été produites en utilisant une faible concentration de 7 % p/v de PCL dans HFIP pour créer une solution de PCL à faible viscosité. L’électrofilage de la solution PCL à faible viscosité à un faible débit a permis de garantir l’émission d’un fil plus fin de la solution PCL par l’aiguille dans le champ électrique. Le fil plus fin facilitait une évaporation plus rapide du solvant et l’aiguille devait être plus proche du mandrin à 70 mm pour assurer un dépôt stable des fibres. Pour l’électrofilage de petites fibres cryogéniques, il était nécessaire de modifier la solution PCL afin d’obtenir un protocole fiable. La PCL en HFIP électrofilée sur le mandrin cryogénique a entraîné à plusieurs reprises une structure de fibre désintégrée. L’électrofilage d’une concentration de PCL de 14 w/v % dans le méthanol chloroforme 3:1 a résolu ce problème ; Cependant, cela a créé une plus grande variation de la taille des fibres dans l’ensemble de l’échafaudage. L’étendue de l’alignement des fibres (rayon et orientation de la fibre) pour chaque échafaudage a été analysée à l’aide du plug-in ImageJ^{DiameterJ 29} et illustrée dans les figures 2 et 3.

Figure 1 : Images MEB montrant les qualités morphologiques de chaque groupe d’échafaudages. La rangée du haut montre les petites fibres et la rangée du bas les grandes fibres. Les groupes morphologiques sont répertoriés de gauche à droite sous forme de fibres aléatoires, de fibres alignées et de fibres cryogéniques, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Données de rayon de fibre (à gauche) et d’orientation de la fibre (à droite) du plug-in DiameterJ pour le petit ensemble de fibres. Morphologie répertoriée de haut en bas sous forme de fibres aléatoires, de fibres alignées et de fibres cryogéniques, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Données de rayon de fibre (à gauche) et d’orientation de la fibre (à droite) du plug-in DiameterJ pour le grand ensemble de fibres. Morphologie répertoriée de haut en bas sous forme de fibres aléatoires, de fibres alignées et de fibres cryogéniques, respectivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Cette méthode nous a offert un ensemble d’échafaudages avec six propriétés de traction nettement différentes, déterminées à l’aide d’une machine d’essai de traction selon les méthodes décrites précédemment⁹. Comme le montre le tableau 1 , les modules de Young à l’échelle macroscopique varient de 46,94 ± 3,48 MPa dans les grandes fibres alignées à 0,20 ± 0,01 MPa dans les grandes fibres cryogéniques. Les valeurs de rigidité physiologique des tissus vont de 100 Pa (tissu neural) à 2−4 GPa (tissu osseux)³⁰ ; Toutes les valeurs de rigidité de l’échafaudage rapportées ici se situaient dans cette plage.

Échafaud	Module de Young (MPa) pour le % de déformation
	0–2%	2–4%	4–6%	6–8%	8–10%
SM. RA	11.14 ± 2.13	9,31 ± 0,43	6,75 ± 0,64	4,75 ± 0,59	3,32 ± 0,40
SM. AL	27,94 ± 8,63	28.27 ± 7.36	16.34 ± 4.87	9,10 ± 3,75	5,85 ± 3,11
SM. CR	0,27 ± 0,11	0,31 ± 0,44	0,31 ± 0,65	0,29 ± 0,59	0,26 ± 0,40
LG. RA	9,23 ± 0,78	8,22 ± 0,87	5,96 ± 0,68	3,96 ± 0,59	2,63 ± 0,45
LG. AL	46.94 ± 3.48	38,03 ± 2,46	27,69 ± 1,22	16,10 ± 1,61	7,87 ± 1,32
LG. CR	0,20 ± 0,01	0,16 ± 0,01	0,12 ± 0,01	0,10 ± 0,01	0,09 ± 0,01

Tableau 1 : Données d’essai de traction pour chaque groupe d’échafaudage à des intervalles de 2 % de déformation. SM. RA = Petit aléatoire, SM. AL = Petit aligné, SM. CR = Petit cryogénique, LG. RA = Grand aléatoire, LG. AL = Grand aligné, et LG. CR = Grand cryogénique. Données présentées en moyenne ± écart-type, n = 5.

La figure 4 montre la coloration DAPI et phalloïdine utilisée pour visualiser la morphologie cellulaire. La méthode de coloration utilisée est établie dans la littérature ^11,12. Les images ont été obtenues à l’aide d’un microscope (Table of Materials) avec un objectif de grossissement 40x. Les images montrent que les fibres alignées produites par cette méthode allongent la morphologie des cellules hepG2 et dirigent les cellules proliférantes le long de la longueur des fibres, créant ainsi une directionnalité au sein de la culture cellulaire. En revanche, les cellules hepG2 sur des fibres aléatoires n’ont pas montré la prolifération directionnelle et l’élongation observées dans les structures alignées. Sur les structures aléatoires, les cellules hepG2 présentaient une morphologie plus régulière avec des protubérances étendues se fixant aux fibres PCL environnantes.

Figure 4 : Cellules hepG2 colorées au DAPI (bleu) et à la phalloïdine (en vert) sur les différentes morphologies d’échafaudage : aléatoire (à gauche), alignée (au milieu) et cryogénique (à droite). La rangée du haut montre les petites fibres et la rangée du bas montre les grandes fibres. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La création de différentes tailles de fibres a été réalisée à l’aide d’une combinaison de différents solvants, concentrations PCL et paramètres d’électrofilage. Le type de polymère, son poids moléculaire et le solvant affectent fortement la viscosité et les propriétés de charge de la solution résultante et ont donc une forte influence sur les propriétés d’électrofilage³¹. Les tensions affichées dans cette méthode sont susceptibles de changer en fonction des conditions dans lesquelles l’électrofilage est effectué. La température et l’humidité affectent le comportement du processus d’électrofilage³². Par conséquent, il est conseillé au lecteur d’être prêt à changer la tension pour contrer tout obstacle et obtenir un cône de Taylor stable. Il est recommandé de loger l’électrospinner dans une enceinte de contrôle de l’environnement afin de réduire la variabilité d’un lot à l’autre dans le processus d’électrofilage.

La réalisation des différentes morphologies présentées dans cette méthode est possible grâce aux capacités du dispositif d’électrofilage IME. Un mandrin à vitesse variable est essentiel pour contrôler l’alignement des fibres. La rotation du mandrin à bas régime (<250 tr/min) permet d’obtenir des fibres orientées de manière aléatoire en raison du comportement du jet de polymère. Lorsque la solution polymère chargée est émise par l’aiguille, les charges internes et les forces aérodynamiques induisent un effet de fouet chaotique qui est utilisé pour déposer un arrangement chaotique de fibres sur le mandrin ^33,34. Cet effet de fouet peut être surmonté en augmentant la vitesse de rotation du mandrin au-dessus de 1 800 tr/min. Les fibres déposées sur un mandrin à un régime aussi élevé présentent une structure alignée car la vitesse de surface est suffisante pour contrer efficacement tout mouvement transversal présenté par la fibre fouettante. Il est important de noter que lorsque des vitesses de mandrin élevées sont utilisées, il est probable qu’il perturbe l’air ambiant, ce qui peut avoir un effet négatif sur la production d’un cône de Taylor stable.

Les échafaudages cryogéniques hautement poreux sont produits en remplissant le mandrin de glace carbonique à -78,5 °C. Cela réduit la température du mandrin et favorise la condensation et la congélation des gouttelettes d’eau à la surface. Les cristaux formés présentent des pics qui émergent de la surface du mandrin et les fibres se déposent tout au long des pics. Une fois les cristaux de glace sublimés, une structure poreuse de fibres reste sur le mandrin^35,36. Le poids et la fragilité des cristaux limitent la capacité à créer des fibres alignées poreuses, car des vitesses de mandrin trop élevées (>250 tr/min) entraînent le détachement des cristaux et des fibres du mandrin en raison de forces centripètes et aérodynamiques excessives. Il est possible de rencontrer des difficultés avec cette méthode en raison de la fragilité des structures formées. Des précautions doivent être prises lors de la manipulation du mandrin et également lors de la manipulation ultérieure des échafaudages, car les structures ont tendance à être aplaties lorsqu’elles sont pressées et pliées lors du retrait des liquides. Il est également possible que les solutions qui s’électrospinnent avec succès sans le mandrin cryogénique puissent être fatalement perturbées par le changement de température et les structures cristallines. Lors de la cryo-filature, la quantité de glace formée à la surface du mandrin dépend fortement de l’humidité, ce qui produit une variabilité dans le résultat final. Il est donc fortement recommandé de confiner le processus d’électrofilage dans une enceinte de contrôle de l’environnement.

Pour évaluer les performances cellulaires sur ces échafaudages, il est nécessaire de stériliser le matériel au préalable. Il existe de nombreuses options disponibles pour stériliser les polymères, y compris les méthodes chimiques, les méthodes de rayonnement et les méthodes basées sur la chaleur^37,38. Il est important d’évaluer l’efficacité de chaque méthode et l’adéquation à la fois à l’utilisation du matériau et au matériau lui-même. Ce protocole utilise la stérilisation dans de l’éthanol à 70 % avant la lyophilisation, le traitement au plasma et l’immersion dans une solution Anti-Anti à 1 %. L’utilisation de l’éthanol permet aux protéines et aux micro-organismes d’être dénaturés et déshydratés sans perturber le matériau PCL³⁷. L’utilisation de solvants plus puissants peut entraîner la dissolution de la PCL. Le revêtement au plasma a été incorporé dans cette méthode principalement pour augmenter l’hydrophilie du PCL, qui est notoirement hydrophobe, et améliorer la fixation cellulaire^39,40. De manière pratique, cela fonctionne également comme une étape de stérilisation secondaire, mais il faut veiller à maintenir les échafaudages dans un environnement stérile avant et après le traitement au plasma. Cette méthode s’est avérée adaptée aux études in vitro avec des milieux traités aux antibiotiques. Cependant, pour les applications in vivo, des options plus robustes telles que l’oxyde d’éthylène (EtO) et l’exposition aux rayons gamma doivent être envisagées. Une fois la stérilisation effectuée, les cellules peuvent être ensemencées sur l’échafaudage et des techniques de culture cellulaire standard peuvent être appliquées pour former des cultures cellulaires 3D in vitro.

Il est important de noter que les valeurs de rigidité doivent être attribuées aux différentes microstructures formées à l’intérieur des échafaudages. Le matériau en vrac (PCL) reste constant entre les échafaudages. Par conséquent, la rigidité du matériau en vrac ne change pas entre les groupes. Les échafaudages cryogéniques présentent une rigidité beaucoup plus faible que les autres groupes en raison de la connectivité réduite au sein de la matrice de fibres, comme le montre le tableau 1. On pense que la connectivité réduite induit une déformation à dominante de flexion plus importante que la déformation à dominante d’étirement au sein de la structure fibreuse⁴¹. Il est intéressant de noter que la rigidité de l’échafaudage ne dépend pas fortement de la taille des fibres dans les groupes aléatoires et cryogéniques. Cependant, la rigidité longitudinale des fibres alignées montre une dépendance significativement plus élevée à la taille des fibres, le module de Young à 0-2 % de déformation étant de 27,94 ± 8,63 MPa pour les petites fibres et de 46,94 ± 3,48 MPa pour les grandes fibres. En raison de la nature d’étirement de l’essai de traction, cela implique une densité PCL en vrac plus élevée dans la section transversale longitudinale. Il est nécessaire de rappeler que les données mécaniques présentées ici sont un instantané mécanique à l’échelle macroscopique des architectures fibreuses. Une caractérisation micromécanique plus poussée serait bénéfique pour bien comprendre les influences mécaniques à l’échelle de la cellule.

Des architectures aléatoires et alignées ont été incluses dans cette méthode pour permettre une comparaison entre les morphologies isotropes et anisotropes. L’étendue de l’alignement des fibres peut être observée dans les images MEB de la figure 2 et les analyses de fibres présentées dans les figures 2 et 3. Des propriétés anisotropes sont observées dans de nombreux tissus du corps. En particulier, cela est couramment observé dans les structures cellulaires alignées telles que celles trouvées dans les tissus musculaires et nerveux. Les structures de fibres polymères alignées offrent la possibilité de récapituler ces structures alignées in vitro^42,43. Comme décrit précédemment, la fonction cellulaire est sensible aux changements morphologiques et mécaniques, de sorte qu’une analyse fonctionnelle plus approfondie doit être effectuée sur les cellules liées à un échafaudage pour déterminer l’influence biologique de chaque type d’échafaudage.

Par rapport à d’autres techniques de fabrication d’échafaudages existantes, cette méthode offre un moyen simple de produire des structures d’échafaudage à l’échelle microscopique avec un contrôle relativement élevé des propriétés mécaniques et de la morphologie. La fabrication alternative d’échafaudages PCL tels que la séparation de phase, la lixiviation du sel et la formation de mousse de gaz permet un contrôle morphologique en termes d’espace vide et de taille des pores. Cependant, la géométrie des pores et de la structure reste en grande partie la même 44,45,46,47. Par conséquent, des qualités telles que le niveau d’isotropie ne peuvent pas être modifiées aussi facilement par rapport à l’électrofilage. Les matériaux hydrogel, populaires pour la production d’échafaudages, permettent de modifier la rigidité du substrat polymère en modifiant le niveau des chaînes polymères réticulées⁴⁸. Il est également possible d’imprimer en 3D via diverses méthodes, offrant un excellent contrôle de la morphologie⁴⁹. Cependant, l’obtention d’une résolution à l’échelle de l’électrofilage dans des matériaux hydrogels biocompatibles reste un défi à mettre en œuvre dans la pratique^50,51. Les échafaudages électrofilés ont été couramment utilisés dans la recherche en ingénierie tissulaire au cours de la dernière décennie, et l’introduction de nouveaux matériaux et d’applications avec différents types de cellules est toujours explorée. Bien que de nouveaux matériaux soient constamment en cours de développement pour les échafaudages d’électrofilage, il reste des possibilités de caractérisation biologique supplémentaire des matériaux et des méthodes d’électrofilage existants. La méthode décrite est proposée comme méthode pour faciliter l’étude biologique in vitro, car elle est directement applicable aux techniques de base de culture cellulaire.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Poinçon de biopsie 10 mm	Acuderm	P1025
15 mL Tube Falcon	Thermo-scientific	339650
Flacon en verre de 20 mL	Fisherbrand	11513542
plaque de culture cellulaire 48 puits	Greiner Bio-one	677180
Anti-Anti 100X	Gibco	15240062
Chloroform	Acros Organics
DAPI	Sigma-aldrich	D9542
Eagles Média essentiel minimum	Gibco	11090081
Électrospinner	IME Technologies	EC-DIG
Sérum fœtal bovin	GE Healthcare	SH30071.03
Gold-Palladium Sputter coater	Emscope	SC500A
Cellule HepG2 line	Sigma-aldrich	85011430
Hexafluoroisopropanol (HFIP)	Manchester Organics	G26383
L-Glutamine 200 mM	Gibco	25030081
MEM Acides aminés non essentiels	Gibco	11140050
Methanol	Acros Organics	11984591
Pénicilline-Streptomycine 10 000 U/mL	Gibco
Phalloidin	Abcam	ab176754
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Sigma-aldrich	P4417-100TAB
Enducteur plasma	Harrick Plasma	PDC-002
Polycaprolactone (Moy. MW 80 000)	Sigma-aldrich	440744
Seringue en PTFE	Fisherbrand	12941031
Microscope électronique à balayage	Hitachi	S4700
T75 Flacon de culture	Corning	CLS430641
Trypan blue (0.4 %)	Gibco	15250061