Une plate-forme de spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) pour étudier les enzymes biosynthétiques peptidiques

Les protéines sont des molécules structurellement dynamiques qui échantillonnent différentes conformations sur des échelles de temps allant des vibrations des liaisons femtosecondes aux réarrangements de domaines protéiques entiers qui peuvent se produire sur plusieurs secondes¹. Ces fluctuations conformationnelles sont souvent des aspects critiques de la fonction enzymatique/protéique. Par exemple, les changements conformationnels induits par la liaison ligand sont souvent d’une importance cruciale pour moduler la fonction enzymatique, soit en organisant les résidus actifs du site nécessaires à la catalyse, en définissant les sites de liaison du substrat dans les mécanismes cinétiques séquentiels, en protégeant les intermédiaires réactifs de l’environnement, soit en modulant la fonction enzymatique par l’intermédiaire de réseaux allotériques. Des études récentes ont également montré que la dynamique conformationnelle peut être conservée tout au long de l’évolution et que les perturbations des mouvements moléculaires conservés peuvent être corrélées avec des changements dans la spécificité du substrat et l’émergence de nouvelles fonctions enzymatiques^2,3.

Ces dernières années, la spectrométrie de masse d’échange hydrogène-deutérium (HDX-MS) est rapidement apparue comme une technique puissante pour sonder la façon dont les paysages conformationnels protéiques réagissent aux perturbations telles que la liaison ligand ou la mutagenèse^4,5,6,7. Dans une expérience typique de HDX-MS (figure 1), une protéine d’intérêt est placée dans le tampon préparé dans D₂O, ce qui déclenche le remplacement des protons échangeables de solvants par deutérium. Le taux de change de l’amide moiety des liaisons peptidiques dépend fortement du pH, de la séquence locale d’acides aminés, et de l’environnement structurel local de l’amide⁸. Les amidons engagés dans des interactions de liaison hydrogène (comme celles présentes dans les α-hélices et les feuilles de β) s’échangent plus lentement que les amides dans les régions non structurées de la protéine qui sont exposées au solvant en vrac. Ainsi, l’étendue de l’absorption de deutérium est un reflet de la structure de l’enzyme. On s’attendrait à ce que les enzymes qui sont conformationally dynamiques, ou qui subissent des transitions structurelles sur la liaison ligand, produisent une réponse mesurable de HDX.

La base mécaniste du taux de change lent d’un amide structuré est indiquée dans la figure 2^5,8,9. Pour subir le HDX, la région structurée doit d’abord échantillonner transitoirement une conformation dépliée, de sorte que les molécules solvantes qui catalysent l’échange HDX via un mécanisme chimique acide/de base spécifique, aient accès à l’amide échangeable. En fin de compte, les magnitudes relatives du taux de change chimique (k_chem) et les taux de pliage et de refolding (k_ouvert et k_fermer) déterminer le taux HDX mesuré dans l’expérience^5,8. De ce modèle cinétique simple, il est clair que l’étendue de l’absorption de deutérium reflétera la dynamique conformationnelle sous-jacente (telle que définie par k_ouvert et k_fermer). La plupart des expériences HDX-MS sont réalisées dans un flux de travail ascendant où, suite à la réaction d’échange, la protéine d’intérêt est digérée en peptides et l’absorption de deutérium par chaque peptide est mesurée comme une augmentation de la masse⁷. De cette façon, HDX-MS permet de cartographier les perturbations de la dynamique conformationnelle des enzymes à l’échelle spatiale locale des peptides, ce qui permet au chercheur d’évaluer comment la perturbation modifie la dynamique dans différentes régions de l’enzyme d’intérêt.

Les avantages de l’approche HDX-MS pour élucider la dynamique structurelle des protéines sont nombreux. Tout d’abord, la méthode peut être effectuée avec de petites quantités de protéines indigènes ou sur des complexes protéiques dans des systèmes à structure quaternaire¹⁰. Il n’est même pas nécessaire que la préparation enzymatique utilisée dans l’analyse soit fortement purifiée^11,12, tant que le flux de travail HDX-MS ascendant fournit un nombre suffisant de peptides identifiés avec confiance qui couvrent la séquence protéique d’intérêt. En outre, HDX-MS peut fournir des informations sur la dynamique conformationnelle dans des conditions quasi natives sans avoir besoin d’étiquetage protéique spécifique au site comme cela serait utilisé dans les études de fluorescence à molécule^{unique 13}, et il n’y a pas de limite de taille au complexe protéique ou protéique qui peut être étudié (ce qui rend difficiles des approches telles que la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire [NMR])^7,14. Enfin, des méthodes HDX-MS résolues dans le temps peuvent être utilisées pour étudier les protéines intrinsèquement désordonnées, qui sont difficiles à étudier avec la cristallographie aux rayons X^15,16,17,18. La principale limitation de HDX-MS est que les données sont de faible résolution structurelle. Les données HDX-MS sont utiles pour indiquer où la dynamique conformationnelle évolue et pour révéler des changements conformationnels couplés, mais elles ne fournissent pas souvent beaucoup d’informations sur le mécanisme moléculaire précis qui conduit au changement observé. Les progrès récents dans la combinaison des méthodes de dissociation de capture d’électrons avec les données de protéine HDX-MS se sont révélés prometteurs pour cartographier les sites d’échange aux résidus d’acides aminés^{simples 19}, mais le suivi des études biochimiques et structurelles sont encore souvent nécessaires pour fournir la clarté aux modèles structurels transmis par les données HDX-MS.

Ci-dessous, un protocole détaillé pour le développement d’un essai HDX-MS est présenté²⁰. Les protocoles de préparation de l’échantillon présentés ci-dessous devraient être généralement applicables à toute protéine qui présente une bonne solubilité dans les tampons aqueux. Des méthodes de préparation d’échantillons plus spécialisées et des workflows HDX-MS sont disponibles pour les protéines que nécessaire en présence de détergent ou de phospholipides^21,22,23,24. Les paramètres instrumentaux de collecte de données HDX-MS sont décrits pour un spectromètre de masse quadrupole haute résolution couplé au système de chromatographie liquide. Des données d’une complexité et d’une résolution similaires pourraient être recueillies sur l’un ou l’autre d’un certain nombre de systèmes de spectrométrie de masse chromatographie liquide (LC-MS) disponibles dans le commerce. Des aspects clés du traitement des données à l’aide d’un logiciel disponible dans le commerce sont également fournis. Nous présentons également des lignes directrices pour la collecte et l’analyse des données qui sont conformes aux recommandations formulées par l’ensemble de la communauté HDX-MS¹². Le protocole décrit est utilisé pour étudier les propriétés structurelles dynamiques de HalM2, une synthétase lanthipeptide qui catalyse la maturation en plusieurs étapes d’un produit naturel peptidique antimicrobien²⁰. Nous montrons comment HDX-MS peut être utilisé pour révéler les sites de liaison du substrat et les propriétés allostériques qui ont échappé à la caractérisation précédente. Plusieurs autres protocoles sur la protéine HDX-MS ont été publiés ces dernières années^25,26. Avec le présent travail, ces contributions antérieures devraient fournir au lecteur une certaine flexibilité dans la conception expérimentale.

1. Préparation de réaccérateurs déréflés et de solutions de stock enzymatique

1. Préparez les réachagents nécessaires aux réactions HDX (y compris les tampons, sels, substrats, ligands, etc.) sous forme de solutions de stock concentré 100−200x en D₂O (99,9 % de fraction atome D). Préparez au moins 50 mL de solution de stock tampon.
   NOTE: Pour la caractérisation de HalM2, les solutions suivantes ont été préparées: 500 mM MgCl₂, 100 mM tris (2 carboxyethyl)phosphine (TCEP), 750 mM ATP (en tampon HEPES), 800 mM HEPES 7,1, 500 μM HalA2, et 500 mM AMPPNP.
2. Congeler et lyophiliser les solutions de stock à la sécheresse.
3. Re-dissoudre dans D₂O, et répéter le cycle de lyophilisation au moins une fois de plus pour remplacer autant de protons échangeables par des deutéons que possible.
4. Ajustez le du stock tampon HEPES déréflé à la valeur désirée avec naod/DCl concentré, en gardant à l’esprit la relation suivante²⁷:
   
   REMARQUE : Le taux d’amide HDX dépend fortement du pL de la solution (pL = pH ou pD)⁵. Différents lots de solutions de stock tampon doivent être préparés, stockés et utilisés de la même manière pour éviter une légère dérive pL entre les expériences.
5. Calculez la quantité de chaque reagent nécessaire pour un essai HDX de 300 μL et stockez comme aliquots à usage unique à -80 °C.
6. Préparez une solution concentrée de stock enzymatique (~100−200 μM) dans un tampon de stockage d’enzymes protiated à l’aide d’un filtre centrifuge(Tableau des matériaux)ou d’un dispositif équivalent.
   REMARQUE : Le tampon exact et le seuil de poids moléculaire du filtre centrifuge dépendront de la protéine/enzyme d’intérêt. HalM2 est stocké dans 50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM KCl, et 10% glycérol. 10 filtres kDa ont été utilisés pour préparer l’enzyme concentrée.
7. Aliquot l’enzyme en portions à usage unique et conserver à -80 °C.
   REMARQUE : Il peut s’agir d’un point d’arrêt. Toutes les solutions de stock décrites dans la section 1 peuvent être préparées avant les réactions HDX. Si elles sont stockées à -80 °C, la plupart des enzymes/solutions de stock stérilisés seront stables pendant de nombreux mois.

2. Étalonnage du volume d’étanchéation HDX

1. Préparer une réaction HDX de 300 μL dans D₂O à l’aide des réaccérateurs stérilisés et des stocks concentrés d’enzymes préparés dans la section 1.
   1. Utilisez une concentration finale en enzymes de 1−5 μM.
   2. Utilisez une concentration tampon HEPES stérilisé finale d’au moins 50−100 mM.
   3. Assurez-vous que les concentrations d’autres composants sont suffisantes pour maintenir l’activité/fonction enzymatique désirée.
2. Préparer 1 L de solution d’étanchéité HDX (phosphate de 100 mM, 0,8 M guanidine-HCl, pH 1,9). Congeler et conserver en portions de 50 mL (pour le stock à long terme) et de 1 mL (pour les aliquots à usage unique).
   REMARQUE : La composition exacte du tampon d’étanchéation dépendra de l’enzyme utilisée dans l’étape de protéolyse du flux de travail HDX-MS ascendant (étape 3.3.3). Le tampon d’étanchéation donné ici est compatible avec la pepsine, la protéase la plus couramment utilisée pour HDX-MS. Si une protéase différente est utilisée, vérifiez auprès du fournisseur de protéase pour assurer la compatibilité tampon.
3. Calibrez le volume de tampon d’étanchéation nécessaire pour ajuster le pL final du mélange de réaction HDX trempé à une valeur de lecture de mètre de pH de 2,3.
   REMARQUE : Le taux de change solvant H/D de la liaison peptidique amide N-H est un processus dépendant du pH qui est soumis à la catalyse acide et de base. Le taux de change minimum se produit à une valeur de pH 2,5 (lecture du mètre de pH = 2,3 pour un mélange 50:50 H₂O:D₂O). Ainsi, une valeur finale de pL près de 2,5 permettra de minimiser l’échange de dos d’hydrogène qui se produit au cours de l’analyse lC-MS ascendante, préservant ainsi l’étiquette de deutérium dans les peptides.
   1. Mélanger 50 μL du mélange de réaction HDX de l’étape 2.1 avec 50 μL de tampon étanche et mesurer le pL du mélange trempé avec une électrode micro-pointe.
   2. Augmentez le volume de solution d’étanchéation au besoin pour ajuster la lecture finale du compteur de pH à une valeur de 2,3.
   3. Une fois que le volume d’étanchéisation approprié a été déterminé, répétez le processus d’assaisage plusieurs fois à l’aide d’aliquots frais de 50 μL de la réaction HDX (étape 2.1) pour s’assurer qu’un pL final cohérent est atteint à l’ajout d’une quantité fixe de tampon d’assaisons.

3. Préparation d’échantillons de référence et optimisation du flux de travail LC-MS ascendant

1. Préparer des échantillons de référence non stérilisés pour la protéine d’intérêt dans le triplicate dans des tubes de 0,5 mL. Assurez-vous que les conditions du mélange de réaction finale sont identiques à celles utilisées dans les réactions HDX authentiques (étape 2.1), sauf que les réactions sont préparées en H₂O à l’aide de solutions de stock de réaccente également préparées en H₂O.
2. Étanchez les échantillons comme à l’étape 2.3 en ajoutant le volume approprié de tampon d’étanchéation pour ajuster le pH final à 2,5. Flash congeler les échantillons dans de l’azote liquide et stocker à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’analyse.
3. Analyser les échantillons de référence enzymatiques protiated à l’aide d’un flux de travail LC-MS ascendant.
   REMARQUE : Avant d’exécuter ces étapes, le système LC-MS qui sera utilisé pour l’acquisition de données doit être correctement calibré et prêt à l’emploi. Le moment et la température de toutes les étapes du flux de travail LC-MS ascendant doivent être rigoureusement contrôlés afin de minimiser les différences dans l’échange de dos entre les échantillons. Avec l’instrumentation MS utilisée dans ce protocole (Tableau des matériaux et Informations à l’appui), la plupart des étapes peuvent être contrôlées par le logiciel de l’instrument. Pour assurer la collecte de répliques précises, il est recommandé d’automatiser autant d’étapes dans le flux de travail que possible.
   1. Retirer un échantillon individuel de référence enzymatique (préparé comme à l’étape 3.2) du congélateur et décongeler à 37 °C pendant 1 min dans un bain d’eau.
   2. À exactement 2 minutes après avoir retiré l’échantillon du congélateur et de la décongélation, injectez une partie de 40 μL de l’échantillon de référence trempé dans une colonne de chromatographie liquide ultra-performante (UPLC) (2,1 x 30 mm, 300 Å, 5 μM) contenant une phase stationnaire fonctionnalisée avec de la pepsine (une protéase acide stable).
   3. Digérer l’échantillon à un débit de 100 μL/min pendant 3 min à 15 °C en utilisant 0,1 % d’acide formique dans H₂O (pH = 2,5) comme solvant.
   4. Recueillir les peptides peptiques comme ils s’élit de la colonne de pepsine sur une colonne de piège C18 tenue à 0,4 °C pour minimiser l’échange de dos.
   5. Passez les peptides peptiques desaltés de la colonne de piégeage à une colonne analytique C18 (1 mm x 100 mm, 1,7 μM, 130 Å) maintenue et actionnée à 0,4 °C pour la séparation des peptides peptiques.
      REMARQUE : Les étapes 3.3.3−3.3.5 peuvent être automatisées par certains systèmes LC-MS utilisés pour l’acquisition de données HDX-MS. Alternativement, ces étapes peuvent être effectuées indépendamment, en gardant à l’esprit que le moment et la température de chaque étape doit être soigneusement contrôlée pour atteindre un échange constamment bas du dos.
   6. Elute la colonne C18 avec un système de solvant d’acide formic d’acetonitrile/eau/0.1%. Optimisez le gradient LC pour la protéine d’intérêt afin de maximiser la séparation et de préserver l’étiquette de deutérium dans les peptides peptiques.
      REMARQUE : Les détails de l’élitution du gradient sont fournis dans l’information à l’appui.
   7. Soumettons le digeste peptique à la spectrométrie de masse de l’ionisation électrospray (ESI).
      REMARQUE : Les conditions de source fournies dans l’information à l’appui fourniront une ionisation suffisante pour la plupart des peptides peptiques.
      1. Une fois ionisé dans l’instrument ms, effectuer une séparation de la mobilité ion phase de gaz en utilisant l’azote comme gaz tampon pour améliorer la capacité maximale de la méthode.
      2. Après la séparation de la mobilité iriontique, soumettons les ions précurseurs peptiques à un flux^{de travail} MS E impliquant des cycles alternatifs de faible énergie de collision (4 V) et d’énergie de collision élevée (21−40 V).
         REMARQUE : Les régimes alternés d’énergie de collision faible et élevée permettent la collecte de données sur la SP (faible énergie de collision) simultanément avec les données MSMS (énergie de collision élevée). Ceci, à son tour, permet la corrélation de temps des ions précurseurs avec leurs ions de fragment respectifs. Cette corrélation est essentielle pour l’identification confiante de peptide décrite dans la section 4.
      3. Détecter le précurseur du peptide et les ions fragmentaires à l’aide d’un analyseur de masse d’une puissance de résolution d’au moins 20 000.
      4. Parallèlement à l’acquisition de données, acquérir des données MS pour une norme externe [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib).
         REMARQUE : Le flux de travail sur la SP décrit à l’étape 3.3.7 est appelé protocole MS^E. Des paramètres instrumentaux complets pour^{un protocole} MS E qui convient à HDX-MS ascendant sont fournis dans l’information à l’appui.
   8. Évaluer la qualité des données LC-MS.
      REMARQUE : À l’aide du protocole décrit ci-dessus et des paramètres instrumentaux fournis dans l’information àl’appui, les échantillons de référence devraient produire un chromatogramme iion total d’une intensité maximale du signal d’environ 1 x 10⁸. Il devrait y avoir beaucoup de peptides peptiques qui s’échappent entre 3−9 min (Figure 3A−C).
   9. Injecter 40 μL d’échantillons vierges (0,1% d’acide formique dans l’eau) pour nettoyer la pepsine et les colonnes analytiques C18.
      REMARQUE : En général, 2−3 blancs devraient suffire.
   10. Répétez les étapes 3.3.1−3.3.9 pour chacun des échantillons de protéines de référence triplicate.

4. Traitement des données de référence et définition d’une liste peptidique

1. Analyser les données ms^{E brutes} (étape 3.3.7) à l’aide d’un logiciel protéomique (Table of Materials). À l’aide du logiciel protéomique, accédez aux bibliothèques | Databanks séquence protéique pour définir la base de données protéique en important la séquence d’acides aminés de la protéine d’intérêt.
   REMARQUE : L’objectif de cette étape est de rechercher les données de référence sur la SP pour les peptides peptiques dérivés de la protéine d’intérêt et d’utiliser les données msms (acquises simultanément avec les données sur la SP) pour valider toute identification putative au peptide.
2. Donnez un nom à la séquence protéique d’intérêt. Importer la séquence protéique (en format FASTA). Le logiciel effectuera une digestion in silico de la protéine de base de données pour générer une liste de peptides qui seront utilisés pour rechercher les données LC-MS.
3. Définissez les paramètres de traitement (situés sous le menu bibliothèque). Sélectionnez Electrospray MS^{E comme} type d’acquisition de données. Dans le champ Lock Mass for Charge 2, entrez 785.8426 pour le m/z pour le 2⁺ ion de [Glu-1]-fibrinopeptide B (GluFib) et cliquez sur finition.
4. Définissez les paramètres workflow (situés sous le menu Bibliothèque).
   1. Sélectionnez Electrospray MS^E pour le type de recherche. Sous le flux de travail | Titre de requête de recherche de base de données, sélectionnez la protéine de base de données créée à l’étape 4.2 dans le champ Databank.
   2. Changez le reagent de digest primaire à non spécifique, et effacez le champ de reagent de modificateur fixe en tenant le bouton de Ctrl tout en cliquant sur Carbamidomethyl C.
5. Spécifiez l’annuaire de sortie en naviguant vers les options | configuration d’automatisation | Identité E. Cochez les cases pour apex 3D et Peptide sortie 3D et sortie comptable ion et spécifiez l’annuaire désiré.
6. Traiter les données de l’échantillon de référence.
   1. Sur la barre d’outils gauche de l’espace de travail de la plate-forme protéomique, créez une nouvelle plaque en cliquant à droite sur Microtiter Plate. Mettre en évidence trois puits dans la plaque de microtiter (un pour chaque échantillon de référence prélevé à la section 3). Cliquez à gauche dans un puits, maintenez et faites glisser vers trois puits.
   2. Cliquez à droite et sélectionnez ajouter des données brutes. Dans la fenêtre qui apparaît, accédez à l’annuaire contenant les trois fichiers de référence de la section 3 et sélectionnez-les en même temps.
   3. Cliquez ensuite et choisissez les paramètres de traitement définis à l’étape 4.3. Cliquez ensuite et sélectionnez les paramètres de workflow définis à l’étape 4.4. Puis cliquez sur la finition.
7. Une fois que les données brutes, les paramètres de traitement et les paramètres de flux de travail ont été attribués à chaque puits de la plaque, les puits apparaîtront bleus. Sélectionnez les puits, cliquez à droite et sélectionnez les dernières données brutes du processus. Cliquez sur le coin inférieur droit de la fenêtre pour suivre le traitement des données. Une fois que le message Aucun travail à exécuter n’apparaît, le traitement est entièrement terminé.
8. Une fois le traitement des données terminé, les puits de la plaque passeront au vert. Cliquez à droite sur les puits et sélectionnez afficher les résultats du flux de travail. Une fenêtre séparée s’ouvrira pour chaque fichier de données de référence.
9. Inspecter les données pour s’assurer que la majorité des signaux de SP dans les données de l’échantillon de référence ont été cartographiés avec succès aux peptides prévus à partir de la digestion in-silico de la protéine d’intérêt. Les peptides appariés seront de couleur bleue dans le spectre de sortie( Figure 4). Double-cliquez sur le filtre OK et vérifiez que la couverture en pourcentage est supérieure à 99%.
   REMARQUE : Lors du traitement, la sortie des données sera automatiquement enregistrée avec l’extension defichier (raw_data_file_name_IA_final_peptide) dans l’annuaire spécifié à l’étape 4.5.
10. Importer la sortie logicielle protéomique dans le logiciel de traitement HDX (Table of Materials) pour un seuil supplémentaire.
    1. Cliquez sur Données dans le coin gauche de la fenêtre logicielle de traitement HDX. Cliquez sur les résultats PLGS d’importation et cliquez sur l’icône ajouter. Choisissez les fichiers de données traités à partir de l’étape 4.9 en naviguant vers l’annuaire approprié.
    2. Cliquez sur Suivant et spécifiez les paramètres suivants : minimum d’ions consécutifs ≥ 2, erreur de masse = 5 ppm, et seuil de fichier = 3. Cliquez sur la finition.
11. Une fois satisfait des paramètres de seuil, enregistrez le projet HDX. Toutes les données HDX seront importées dans ce projet pour analyse et affichage.
    REMARQUE : Les échantillons échangés de deutérium décrits dans la section suivante devront être traités avec un flux de travail identique LC-MS. Par conséquent, avant de procéder aux analyses HDX (section 5), assurez-vous que la préparation de l’échantillon (section 2), le flux de travail bottom-up LC-MS (section 3) et les workflows de traitement des données (section 4) fournissent la reproductibilité souhaitée et la couverture séquence de la protéine cible. Si l’un ou l’autre de ces processus doit être modifié pour améliorer la couverture, il est conseillé de revenir à l’étape 2.1, de préparer de nouveaux échantillons de référence en triplicate et de répéter les sections 2−4 (tout en faisant les ajustements nécessaires au protocole) pour s’assurer que chaque peptide peut être généré et détecté reproductiblement.

5. Effectuer des réactions HDX

1. Préparez un espace de travail pour les réactions HDX.
   1. Pré-aliquot étanchez le tampon dans des tubes correctement étiquetés de 0,5 mL. Préparez un tube différent pour chaque point de temps, chaque réplique, et chaque état biochimique à analyser. Utilisez le volume approprié de tampon d’étanchéation à partir de l’étape 2.2 nécessaire pour ajuster la lecture finale du compteur de pH d’une partie de 50 μL de la réaction HDX à une valeur de 2,3.
   2. Centrifugez brièvement les cuves de 0,5 mL pour transférer tout le tampon d’étanchéation au fond du tube. Placez les tubes sur la glace.
   3. Remplissez un petit Dewar d’azote liquide et gardez-le à côté de l’espace de travail.
2. Préparez les réactions HDX. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de volume de réaction pour recueillir le nombre désiré de points de temps d’échange (un aliquot de 50 μL pour chaque point de temps désiré). Recueillir au moins 4−5 points de temps sur 3−4 ordres de grandeur dans l’échelle de temps (par exemple, des temps d’étanchéité de 15 s, 60 s, 300 s [5 min], 1 800 s [30 min], et 14 400 s [4 h] fournissent une couverture adéquate de la dynamique d’échange pour la plupart des enzymes).
   1. Pré-mélanger tous les composants déréflés (moins l’enzyme) de l’étape 1.1 en D₂O.
   2. Pour chaque état biochimique à examiner (enzyme libre, enzyme + ligand, enzyme + inhibiteur, etc.), préparez les réactions HDX au moins en triplicate.
   3. Incuber les mélanges de réaction dans un bain d’eau à température contrôlée à 25 °C pendant 10 minutes avant l’ajout de l’enzyme.
      REMARQUE : L’enzyme doit être préparée comme solution de stock concentré (~100−200 μM, étape 1.6) afin de minimiser l’ajout de protium dans l’analyse HDX.
   4. Lorsque vous ajoutez l’enzyme à une concentration finale de 1−5 μM, démarrez la émietté. Mélanger soigneusement et rapidement la solution à l’aide d’une pipette de 200 μL pour s’assurer que l’enzyme est répartie uniformément dans l’échantillon.
   5. Aux points de temps d’échange désirés, retirez 50 aliquots de μL de la réaction HDX et mélangez rapidement et uniformément avec le tampon d’assaisons pré-aliquoted et glacé dans un tube de 0,5 mL.
      REMARQUE : Les volumes de mélange et la procédure de mélange doivent être aussi précis et reproductibles que possible pour s’assurer que le pL d’étanchéité final désiré de 2,3 est atteint rapidement dans tous les échantillons. Garder le froid de glace tampon étanche aidera à minimiser l’échange de dos lors de la dénaturation de l’enzyme.
   6. Immédiatement après avoir étanché l’échantillon HDX, plafonnez le tube et congèlez le flash dans de l’azote liquide.
   7. Continuer à recueillir des points de temps jusqu’à ce que tous les analyses soient terminées, puis transférer les échantillons au congélateur de -80 °C pour l’entreposage.
      REMARQUE : Il peut s’agir d’un point d’arrêt. Après avoir recueilli tous les points de temps HDX, les échantillons peuvent être stockés à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’analyse LC-MS. Idéalement, les réactions triplicate HDX devraient être effectuées pour tous les états biochimiques d’intérêt le même jour. Au minimum, toutes les réactions HDX répliquées pour un état biochimique donné doivent être exécutés en parallèle le même jour.
3. Après avoir recueilli tous les points de temps HDX trempés, soumettez les échantillons au flux de travail LC-MS ascendant optimisé développé tel que décrit à l’étape 3.3. Injectez des échantillons HDX dans un ordre randomisé avec un nombre approprié de blancs entre les échantillons pour s’assurer que tout report de peptide est minime.
   REMARQUE : Les données HDX n’ont pas besoin d’être collectées en mode MS^E. Ainsi, le segment de l’énergie de collision élevée (étape 3.3.7.2) devrait être retiré du cycle de service de la SP. Il devrait s’agir de la seule modification apportée au flux de travail décrit à l’étape 3.3.
4. Évaluer la qualité des données HDX au fur et à mesure qu’elles sont collectées.
   1. S’assurer que les pics chromatographiques présents dans le chromatogramme iion total des échantillons de référence non stérilisés apparaissent en même temps de rétention dans les échantillons stérilisés (comme dans la figure 3D−F).
   2. S’assurer que les spectres de masse résumés sur des intervalles de temps spécifiques à partir d’échantillons de référence et d’échantillons stérilisés présentent des signes de stérilisation (c.-à-d. un déplacement de l’enveloppe isotopique des peptides individuels vers des valeurs m/z plus élevées dans les échantillons stérilisés [figure 6]).

6. Traitement des données HDX

1. Importer les données HDX dans le projet HDX créé à l’étape 4.11 en cliquant sur Données | Fichiers MS dans la barre d’outils supérieure.
   1. Cliquez sur Nouvel État et nouvelle exposition au besoin pour définir les états biochimiques (p. ex., enzyme libre, enzyme + ligand, etc.) et les temps d’exposition au deutérium, respectivement, qui sont pertinents à l’analyse.
   2. Cliquez sur New Raw pour sélectionner les fichiers de données HDX à analyser. Attribuez les temps d’échange appropriés et l’état biochimique à chaque fichier de données brutes importé.
      REMARQUE : Les données peuvent être importées et traitées par lots, ou toutes en même temps. L’ajout de données au projet n’annulera aucune analyse qui a déjà été effectuée dans le cadre de ce projet.
2. Une fois que les fichiers de données ont été ajoutés, cliquez sur la finition pour commencer le traitement des données. Après un court délai, le logiciel demandera si l’utilisateur veut enregistrer les données avant de continuer. Cliquez sur oui.
   REMARQUE : Le traitement initial peut prendre jusqu’à plusieurs heures selon le nombre d’échantillons analysés, le nombre de peptides dans la liste finale du peptide (étape 4.10), la taille de la fenêtre chromatographique et la fréquence de l’acquisition spectrale.
3. Si vous le souhaitez, modifiez les paramètres de traitement dans le menu Configuration pour modifier les paramètres de recherche iion. Assurez-vous d’utiliser les mêmes paramètres de recherche iion pour toutes les données d’un projet donné.

7. Analyse et visualisation des données HDX

REMARQUE : Une fois le traitement initial des données brutes terminé (étape 6.2), le logiciel de traitement HDX aura localisé les peptides de la liste des peptides (générés à l’étape 4.10) dans chacun des fichiers de données brutes analysés. Une fois que la distribution d’isotopes pour un peptide dans la liste est située dans un fichier de données brutes, le logiciel de traitement HDX représente chaque isotope avec un « bâton » (comme dans la figure 6C−E). Les intensités relatives des bâtonnets pour un peptide donné sont ensuite utilisées pour calculer l’absorption du deutérium par rapport aux spectres de référence. Tandis que le logiciel hdx-traitement fait un travail admirable d’attribuer correctement des « bâtons » à la plupart des peptides, la curation manuelle significative des valeurs d’absorption de deutérium sera toujours exigée.

1. Analyse des valeurs d’absorption du peptide deutérium
   1. Sélectionnez le premier peptide dans la liste peptidique et ouvrez l’intrigue spectrale empilée dans le menu Vues. Faites défiler de haut en bas dans la fenêtre empilée de parcelle de spectre pour voir les spectres de masse pour le peptide sélectionné en fonction du temps d’échange de deutérium (Figure 7D,E).
   2. Assigner et affecter des bâtons au besoin à l’aide de clics de souris pour s’assurer que la distribution isotopique appropriée a été localisée dans les données et que chaque pic isotopique a été attribué (les bâtons assignés apparaîtront bleus). En cliquant sur l’un des spectres de l’intrigue spectrale empilée (Figure 7D,E ) permettra àl’utilisateurd’attribuer / bâtons non assignés dans la fenêtre de visionneuse de données active (Figure 7C).
   3. Vérifiez les affectations de bâton pour chaque état de charge en retraciant l’état de charge en haut de la fenêtre spectrale empilée de parcelle.
   4. Répétez les étapes 7.1.1−7.1.3 pour chaque état biochimique d’intérêt. L’état biochimique peut également être basculé en haut de la fenêtre spectrale empilée. Pour les mesures de différence d’absorption de deutérium les plus précises, assurez-vous que les bâtons sont attribués pour le même ensemble d’états de charge pour chaque état biochimique.
   5. Répétez les étapes 7.1.1−7.1.4 pour chaque peptide dans la liste peptidique.
   6. Vérifiez l’écart type des valeurs d’absorption du peptide deutérium à l’aide de la carte de couverture.
      1. Accédez à la carte de couverture du menu Vues, qui affiche chaque peptide dans la liste peptidique cartographiée le long de la séquence d’acides aminés de la protéine d’intérêt (Figure 8C). Colorer les peptides en fonction de l’écart type relatif (unités de Da).
      2. Recherchez visuellement sur la carte des peptides aberrants avec un écart type relatif élevé. Cliquez sur les peptides aberrants de la carte de couverture pour remplir les parcelles spectrales empilées (figure 8B) et la fenêtre de visionneuse de données (figure 8A) avec le peptide cible.
      3. À l’aide de la parcelle spectrale empilée, vérifiez soigneusement que tous les états de charge et tous les points de temps du peptide aberrant ont correctement attribué des bâtons.
         REMARQUE : Le plus souvent, les peptides avec de grands écarts types (>0.3 Da) ont des pics isotopiques qui n’ont pas été convenablement assignés bâtons par le logiciel (comme indiqué dans la figure 8B). L’attribution des bâtons manquants permettra généralement de réduire l’écart type relatif d’un peptide à 0,3 Da.
      4. Cachez le peptide de la liste si l’écart type relatif ne peut pas être réduit à moins de 0,3 Da.
2. Exporter des données de différence HDX entre deux états biochimiques pour cartographier sur un modèle structurel de la protéine d’intérêt.
   1. Affichez la différence d’intérêt dans la carte de couverture. Cliquez à droite sur la carte de couverture pour exporter les données de différence vers .csv fichier. Exporter les données de l’État (.csv format) en naviguant vers les données | Export State Data dans la barre d’outils principale.
      REMARQUE : Le formatage approprié des données de différence et des fichiers de données d’état est fourni dans l’information à l’appui.
   2. Importez les données de différence, les données d’état, et le fichier de pdb de la protéine d’intérêt dans Deuteros^28. Choisissez l’intervalle de confiance de 99 %, sélectionnez activer lasomme et traiter les données.
      REMARQUE : MATLAB doit être installé sur le PC pour faire fonctionner Deuteros. Deuteros utilisera les mesures de reproduction dans l’ensemble de données pour calculer l’écart type des données d’absorption pour chaque peptide. Cet écart type sera utilisé pour définir l’intervalle de confiance pour les échanges significatifs, qui seront affichés sur les parcelles.
   3. Dans le cadre de PyMOL Options, sélectionnez l’absorption à l'| exporter pour générer un script Pymol pour cartographier les régions de différence d’échange significative sur la structure pdb de la protéine d’intérêt à l’aide du logiciel PyMOL.
      REMARQUE : En utilisant le flux de travail décrit dans ce protocole, l’intervalle de confiance de 99 % pour la différence significative d’absorption de deutérium pour un peptide donné à un seul moment est généralement de 0,3−0,5 Da. L’intervalle de confiance de 99 % pour l’écart résumé sur tous les points de temps d’échange est généralement de 0,7−1,0 Da.

Il est nécessaire d’évaluer la qualité de la digestion protéolytique et la reproductibilité du flux de travail pour chaque ensemble d’injections d’échantillons. Ainsi, avant d’effectuer des essais HDX-MS, il est essentiel d’établir des conditions efficaces pour la protéolyse de la protéine d’intérêt, pour la séparation des peptides à l’aide de la chromatographie liquide de phase inverse et de la mobilité des ions de phase gazeuse, et pour la détection des peptides à l’aide de SP. À cette fin, les échantillons de référence pour la protéine d’intérêt (prélevés en l’absence de deutérium) devraient d’abord être étudiés (article 3). Les données chromatographiques de la figure 3A−C montrent le total des chromatogrammes ioniques (TICs) pour trois échantillons de référence de la synthétase lanthipeptide HalM2. Le TIC est le changement dépendant du temps dans la somme de tous les nombres d’ion à toutes les valeurs m/z incluses dans l’analyse spectrale de masse. Des vues plus proches des CCI entre 3 et 8 min sont indiquées dans la figure 3D−F. Les spectres de masse indiqués dans la figure 3G−I représentent une somme de tous les spectres de masse sur un petit intervalle de temps (de 5,0 à 5,1 min) de chaque TIC. Une attention particulière devrait être accordée aux caractéristiques suivantes de la figure 3.

Premièrement, le grand pic près de 9,3 minutes à la fin du gradient représente des fragments incomplètement digérés (et donc, grands et plus hydrophobes) de HalM2(figure 3A−C). La digestion pourrait être rendue plus efficace en réduisant la concentration de HalM2, mais cela réduira l’intensité du signal peptidique et le rapport signal/bruit. La digestion pourrait également être rendue plus efficace en augmentant le temps de contact (de 3 min, étape protocolaire 3.3.3) avec la colonne de pepsine. Toutefois, l’augmentation du temps de contact se traduira par plus d’échange de dos. En fin de compte, ces paramètres doivent être équilibrés pour la protéine d’intérêt afin de fournir la couverture de séquence désirée, l’intensité du signal, et la rétention de deutérium. Deuxièmement, la forme et l’intensité des profils TIC devraient être similaires (comme dans la figure 3D−F). Ceci suggère que la digestion protéolytique de HalM2 soit reproductible et soit d’une efficacité semblable dans les trois échantillons de référence. On s’attend à ce qu’une digestion similaire d’un échantillon échangé au deutérium produise le même ensemble de peptides avec des temps de rétention similaires. Troisièmement, les spectres de masse sur un intervalle de temps donné devraient également être similaires( figure 3G−I). Une comparaison visuelle rapide des spectres de masse résumés sur l’intervalle de temps de 5,0−5,1 minutes de la séparation chromatographique montre que les signaux spectraux de masse dans chaque échantillon sont en effet très similaires, ce qui donne confiance que des peptides similaires sont présents dans chaque échantillon et s’échappent à des moments similaires de la colonne C18. Une inspection visuelle rapide similaire devrait être effectuée sur d’autres intervalles de temps à travers le chromatogramme.

Après avoir vérifié visuellement la similitude dans les données LC-MS des échantillons de référence, le logiciel protéomique est utilisé pour rechercher dans les données de la SP des peptides dérivés de la séquence des acides aminés de la protéine d’intérêt. Après avoir défini la banque de données sur la séquence protéique (la séquence d’acides aminés de la protéine d’intérêt), le traitement et les paramètres du flux de travail décrits dans les étapes protocolaires 4.2−4.4, chaque échantillon de référence individuel est traité pour détecter les peptides peptiques qui correspondent aux peptides prévus dérivés de la protéine d’intérêt. Un exemple de la sortie logicielle protéomique d’un échantillon de référence HalM2 non stérilisé est indiqué dans la figure 4. Une attention particulière doit être accordée aux caractéristiques suivantes. Tout d’abord, tout signal ms qui est assorti à un peptide spécifique dans la protéine d’intérêt selon les valeurs définies dans les paramètres de traitement et de flux de travail sera de couleur bleue dans le spectre inférieur. Si un échantillon de référence est traité « avec succès », la majorité des signaux apparaîtront bleus (comme c’est le cas pour les données de la figure 4). En outre, dans le panneau supérieur gauche, assurez-vous que le « filtre OK » est basculé vers le checkmark vert. Lorsque cela est fait, les statistiques dans la barre supérieure du panneau supérieur droit (mis en évidence en bleu dans la figure 4) ne reflétera que les peptides qui donnent des scores de confiance élevés. Ces peptides présentent une faible précision de masse ppm, de multiples ions fragmentaires et une bonne corrélation entre les temps de rétention des fragments et des ions parentaux, et sont considérés comme des identifications confiantes. Pour l’échantillon de référence HalM2 montré, 1 421 peptides ont été détectés avec des scores élevés, couvrant 99,6 % de la séquence HalM2. Une couverture de séquence de près de 100 % devrait être réalisable pour la plupart des protéines à l’aide du flux de travail bottom-up LC-MS décrit dans la section 3 du protocole. En outre, d’autres statistiques utiles pour chaque peptide sont compilées dans le panneau supérieur droit, y compris l’erreur de masse, le temps de rétention des précurseurs, le nombre de fragments (ions produits), la liste complète des ions fragmentés par nom, et le temps de dérive de la mobilité ion. Cette information est utile pour l’interprétation des résultats, qui devraient toujours être axées sur les peptides les plus identifiés avec confiance.

La liste finale du peptide doit être déterminée par un seuil supplémentaire dans le logiciel de traitement HDX. Après avoir analysé les données de référence pour générer la liste peptidique (section protocole 4), la sortie doit être importée dans le logiciel de traitement HDX pour un seuil supplémentaire. Les fichiers de sortie seront stockés dans un répertoire tel que défini à l’étape 4.5 du protocole avec l’extension de fichier « ..._IA_final_peptide.csv ». Lors du téléchargement de la sortie dans le logiciel de traitement HDX, la liste complète des peptides sera affichée dans le panneau « aperçu peptidique » (Figure 5), et le nombre de peptides, la couverture de séquence, et la redondance seront affichés dans le coin inférieur droit de la fenêtre. Ces valeurs changeront en temps réel au fur et à mesure que des seuils supplémentaires seront appliqués. Après avoir cliqué surla suivante, les valeurs de seuil peuvent être définies dans les champs indiqués. Les filtres les plus critiques sont le « seuil de fichier » qui exige que tous les peptides soient situés dans chacun des trois échantillons de référence, l'« erreur MH+ maximale (ppm) » qui doit être réglée à une valeur et à 10 ppm, et les « produits consécutifs minimaux », ce qui exige que le peptide génère au moins deux ions fragmentaires consécutifs pendant la phase MSMS (c.-à-d. énergie de collision élevée) du fluxde travail MS E (étape du protocole 3.3.7.2).

La limitation technique la plus importante de l’analyse HDX-MS est l’échange de dos de deutérium contre du protium qui se produit dès que les échantillons échangés au deutérium sont trempés (avec tampon protiated). L’échange de dos se poursuit pendant la digestion de la protéase et les parties LC-MS du flux de travail. L’échange de dos est inévitable, mais si le pH, la température et le moment de toutes les étapes post-étanchéité sont soigneusement contrôlés comme décrit dans le protocole, 60%−70% de l’étiquette de deutérium peut être maintenue. Pour cette raison, il est essentiel de vérifier pendant les premiers stades du développement d’essai que la plupart des peptides retiennent le deutérium. Ceci peut être réalisé rapidement en comparant les données brutes d’un échantillon stérilisé avec celle d’un échantillon de référence. Comme cela a été fait pour assurer la reproductibilité des échantillons de référence (figure 3), comparer les TICs des échantillons de référence échangés et non stérilisés, en veillant à ce que les formes des profils se ressemblent. En outre, résumer les spectres de masse sur le même intervalle de temps chromatographic dans les deux échantillons. La plupart des peptides de l’échantillon échangé au deutérium devraient présenter des changements évidents dans leurs distributions isotopiques vers des valeurs m/z plus élevées (comme dans la figure 6). Ces données indiquent qu’une fraction substantielle de l’étiquette de deutérium est maintenue tout au long de la désaltérante acide, de la digestion de la pepsine et de la collecte de données sur la LC-MS.

Après avoir vérifié que le flux de travail fournit une rétention suffisante de deutérium, l’absorption de deutérium doit être quantifiée. Ainsi, les données brutes pour les échantillons échangés au deutérium sont importées dans le logiciel de traitement HDX. À l’aide des échantillons de référence et de la liste des peptides finalisés, le logiciel de traitement HDX localisera les peptides de la liste des peptides dans chacun des fichiers de données brutes et attribuera des « bâtons » à chacun des pics isotopiques. Dans les données représentatives de HalM2 indiquées à la figure 7,les bâtons assignés avec succès sont de couleur bleue dans tous les spectres. Après attribution des bâtons, la valeur centroïde m/z de la distribution isotopique sera déterminée par le logiciel et utilisée pour calculer l’absorption de deutérium par rapport à l’échantillon de référence non stérilisé. La valeur d’échange de deutérium pour chaque peptide doit être vérifiée manuellement. Dans la figure 7, le peptide actuellement sélectionné (HIDKLTVGL, couvrant les résidus halm2 110−118) est affiché dans le panneau gauche de la visionneuse principale de données (figure 7A). Les autres panneaux montrent les données HDX associées à ce peptide. En cliquant sur n’importe quel peptide dans la liste peptidique remplira les autres panneaux avec des données HDX de ce peptide. La figure 7B montre les parcelles d’absorption de deutérium pour le peptide 110−118. Cet ensemble de données contient quatre points de temps d’échange : 0,5, 5, 30 et 240 min (collectés en triplicate). Des données d’échange ont été recueillies pour deux états biochimiques : l’enzyme HalM2 libre (rouge) et l’enzyme HalM2 complexée à AMPPNP et son substrat peptide HalA2 (bleu). Notez la différence significative d’absorption de deutérium dans le peptide 110−118 sur l’ensemble du parcours et la haute précision des mesures de répétition (des barres d’erreur sont affichées sur la parcelle de la figure 7B). En général, une précision similaire dans la mesure de l’absorption sera obtenue pour la plupart des peptides, soulignant la reproductibilité du flux de travail présenté dans ce protocole. Lors de la liaison ligand (courbe bleue dans la figure 7B),le lien peptidique amides dans la région 110−118 de HalM2 apparemment subir une protection significative contre l’échange de deutérium, ce qui suggère que les acides aminés dans la région 110−118 sont de plus en plus stably structuré sur la liaison ligand. La mutagenèse suivante de cette région a indiqué un rôle en se liant au peptide précurseur, HalA220. La figure 7 montre également les parcelles spectrales empilées pour l’état HalM2 ( figure7D) et l’état HalM2:AMPPNP:HalA2 (Figure 7E). Dans ces parcelles, le temps d’échange augmente du bas vers le haut. L’augmentation de masse du peptide 110−118 lors de l’échange de deutérium à des moments plus longs est évidente à partir de l’inspection visuelle. Il est également évident que le peptide 110−118 prend plus de deutérium dans l’état halm2 (figure 7D) que dans l’état entièrement liganded (Figure 7E). Si nécessaire, en cliquant sur l’une ou l’autre des sous-intrigues de la figure 7D ou de la figure 7E,l’utilisateur peut modifier manuellement l’affectation des bâtons dans la visionneuse principale de données (figure 7C). Lors de l’attribution/non-affectation du bâton, le logiciel de traitement HDX recalcule les valeurs d’absorption du deutérium, et toutes les parcelles seront mises à jour en temps réel. De même, en cliquant sur les points de données individuels du panneau B, vous remplirez la visionneuse de données dans le panneau C pour l’attribution manuelle du bâton.

Une fois que des bâtons ont été attribués pour chaque peptide et point de temps d’échange pour tous les états biochimiques, l’écart type des valeurs d’absorption mesurées doit être vérifié. Ceci est plus facile à effectuer avec la carte de couverture et la parcelle spectrale empilée (Figure 8). Dans la carte de couverture (Figure 8C), sélectionnez l’état et échangez le temps d’intérêt, puis sélectionnez l’écart type relatif d’absorption. Les peptides de la carte de couverture seront colorés en fonction de l’écart type dans la valeur d’absorption mesurée du deutérium. De cette façon, il sera très facile d’identifier visuellement les peptides qui ont des erreurs de bâton isotopique. En cliquant sur le peptide aberrant (avec écart-type élevé) dans la carte de couverture, la visionneuse principale de données et la parcelle de spectre empilée avec les données HDX du peptide aberrant. Les affectations de bâton pour chaque état de point de temps et de charge peuvent alors être modifiées au besoin pour corriger la valeur d’absorption mesurée. Encore une fois, le logiciel de traitement HDX mettra à jour tous les affichages de données en temps réel au fur et à mesure que les affectations de bâton sont modifiées.

Après avoir entièrement organisé l’ensemble de données HDX, l’importance de la mesure de différence d’absorption du deutérium pour chaque peptide doit être prise en considération avant l’interprétation des données. En utilisant une approche décrite par Engen et ses collègues29, nous avons estimé une valeur moyenne d’absorption de 0,1 ± 0,1 Da pour la protéine HalM2 en utilisant le flux de travail décrit dans le protocole ci-dessus20. Cette valeur est compatible avec les erreurs signalées par d’autres pour des flux de travail HDX d’échange continussimilaires 29,30. Récemment, Politis et ses collègues ont développé Deuteros, un outil open source utile (mis en œuvre dans MATLAB) pour déterminer rapidement les différences significatives d’absorption dans les ensembles de données HDX28. Les fichiers d’entrée représentatifs pour Deuteros (« State_Data_for_Deuteros » et « Difference_Data_for_Deuteros ») sont inclus dans l’information à l’appui. Si elle est exportée directement à partir du logiciel de traitement HDX décrit dans ce protocole (Tableau des matériaux), la différence et les fichiers de données d’état auront le format approprié pour la lecture de fichiers par Deuteros. Si les données HDX sont générées sur un système LC-MS différent, les fichiers de données ressemblant à ceux fournis dans l’information à l’appui devront être construits manuellement.

L’espace de travail Dueteros est indiqué dans la figure 9. Une fois que les données sont importées dans Deuteros, l’utilisateur sélectionne la limite de confiance souhaitée (>98% recommandée) et clique sur Import & Calculate. Pour la carte de données aplatie, sélectionnez la couverture pour le type de données et absolue pour l’échelle de couleur. Cliquez sur l’intrigue. Pour les parcelles de bois, sélectionnez filtre binaire comme type de données, le filtre de confiance désiré et activer la somme. En cliquant sur l’intrigue,Deuteros tracera tous les peptides à chaque point de temps d’échange en fonction de leur position dans la séquence d’acides aminés et de leurs valeurs d’absorption de deutérium. Les peptides qui présentent un échange significatif seront colorés en rouge ou en bleu, selon que le peptide prend plus ou moins de deutérium, respectivement, selon la différence calculée. La valeur d’importance déclarée dans chaque parcelle (allant de 0,39 à 0,72 Da dans les données tracées à la figure 9)est calculée à partir des écarts types des différences d’absorption mesurées pour chaque peptide tel que déterminé à partir des mesures de reproduction présentes dans l’ensemble de données. Les intervalles de confiance sont affichés sous forme de barres pointillées sur chaque parcelle individuelle. Si elle est activée, la « Somme » ajoute simplement la différence d’absorption mesurée à chaque point de temps pour chaque peptide. Enfin, pour la visualisation des données d’absorption sur la structure tridimensionnelle de la protéine d’intérêt, sélectionnez l’absorption à l’exportation dans le cadre des options PyMOL, puis exportez. Deuteros va générer un script PyMOL qui peut être traîné et déposé dans l’espace de travail PyMOL contenant le fichier pdb ouvert de la protéine d’intérêt.

Le flux de travail HDX-MS présenté dans ce protocole a été utilisé pour caractériser les propriétés biochimiques d’une enzyme (HalM2) qui catalyse une série de modifications post-translationnelles sur un peptide génétiquement codé (HalA2)20. Dans la figure 10, les résultats représentatifs de HDX-MS sont indiqués pour la liaison du peptide précurseur HalA2 au complexe HalM2:AMP-PNP. Le panneau A montre la carte de couverture HalM2, où la couleur indique la différence relative d’absorption entre l’état biochimique [HalM2:AMPPNP] et l’état [HalM2:AMPPNP:HalA2]. Deuteros a été utilisé pour cartographier ces différences d’absorption sur un modèle d’homologie de l’enzyme HalM2 (Figure 10B,C). Les peptides qui sont de couleur rouge indiquent une diminution de l’absorption de deutérium sur la liaison HalA2, ce qui suggère que ces régions de HalM2 peuvent être impliquées directement dans la liaison du peptide précurseur. Pour étudier cette hypothèse, des régions I-III ont été mutées et les propriétés cinétiques des enzymes variantes ont été étudiées. Les mutations dans les régions I et III ont toutes deux entraîné des perturbations significatives dans l’affinité de liaison peptidique HalA2, ce qui suggère que ces régions de HalM2 interagissent directement avec le substrat peptidique, ou sont nécessaires pour former des structures qui permettent la liaison HalA2. En revanche, la mutation de la région II n’a eu aucun effet sur l’affinité contraignante hala2, mais ce mutant était presque dépourvu d’activité catalytique. Une explication de cette conclusion est que l’organisation de la région II observée sur la liaison HalA2 déclenche un changement conformationnel qui active l’enzyme. Il convient de noter qu’avant cette étude, aucune information n’était disponible sur le mode de liaison HalM2-HalA2 ou sur les changements conformationnels catalytiques pertinents dans le système, principalement parce que la grande taille et la nature flexible de HalM2 et hala2 ont empêché des études structurelles. Ainsi, ces données représentatives sur la synthétase de lanthipeptide HalM2 illustrent comment HDX-MS peut être utilisé pour localiser rapidement les régions fonctionnellement pertinentes des systèmes enzymatiques structurellement dynamiques, même en l’absence de données structurelles à haute résolution.

Figure 1 : Un échange continu, flux de travail HDX-MS ascendant. Voir le texte pour plus de détails. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Le taux de HDX dépend de la dynamique conformationnelle des protéines(kouverte et kclose)et du taux d’échange chimique dépendant du pH des liaisons N-H dans l’épine dorsale protéique des liaisons N-D (kchem). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Données représentatives de la LC-MS pour les échantillons de référence HalM2 triplicate. Le nombre dans le coin supérieur droit de chaque panneau représente le nombre total d’ion. Chaque ligne affiche les données d’un échantillon de référence différent. La première colonne (A−C) montre l’ensemble des chromatogrammes irionaux (TICs). Le grand pic à 9,3 min représente de grands peptides non digérés. La colonne du milieu (D−F) montre une vue plus proche des CCI entre 3 et 8 min. Notez le bon accord des formes des profils, qui indique un mélange sous-jacent similaire de signaux peptidiques dans chaque échantillon de référence sur l’ensemble du chromatogramme. La troisième colonne (G−I) montre des spectres de masse pour chaque échantillon de référence généré par la résumation de tous les spectres de masse enregistrés entre le point de temps 5,0 et 5,1 min de la course chromatographique. L’inspection visuelle de ces données indique que bon nombre des mêmes peptides sont détectés dans chaque échantillon. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Sortie logicielle protéomique représentative pour un échantillon de référence HalM2. Le panneau supérieur gauche montre la liste complète des peptides peptiques dérivés de HalM2 détectés dans les données sur la SP. Notez que le « filtre OK » affiche le coché vert. Cela filtre les données en fonction du score de confiance et supprime les identifications peptidiques de faible confiance. La barre supérieure du panneau droit (surlignée en bleu) affiche des statistiques cumulatives pour l’ensemble des peptides avec des scores élevés. Les statistiques les plus importantes sont le nombre de peptides détectés (dans ce cas 1 421) et la couverture de séquence (dans ce cas 99,6 %). Des statistiques supplémentaires pour chaque peptide sont également affichées dans le panneau supérieur droit. Chaque colonne de cette table de données est triable. Le panneau inférieur montre tous les signaux de SP qui ont été appariés à un peptide peptique dérivé de HalM2 prévu. Notez que la majorité des signaux de SP ont été attribués et sont de couleur bleue. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Seuil supplémentaire dans le logiciel de traitement HDX. La sortie logicielle protéomique pour chacun des trois échantillons de référence HalM2 est importée dans le logiciel de traitement HDX (panneau gauche). Après l’importation des données, un seuil supplémentaire est effectué (panneau droit). Le champ « produits consécutifs minimaux » désigne les ions fragmentés générés par le clivage des liaisons peptidiques adjacentes dans le peptide. Le paramètre « erreur MH+ minimale » permet à l’utilisateur de définir l’exactitude de masse acceptable, et le « seuil de fichier » permet à l’utilisateur de limiter les peptides aux seuls peptides qui ont été détectés dans les trois fichiers de référence. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Données représentatives d’un échantillon de référence HalM2 (rouge) et d’un échantillon HalM2 incubé dans le tampon D2O pendant 5 min (vert). Les deux échantillons ont été soumis au flux de travail bottom-up LC-MS décrit dans la section 3 du protocole. La colonne de gauche montre des spectres de masse résumés sur la fenêtre de temps de 6,0−6,1 min. Les trois colonnes droites montrent des vues plus proches des mêmes spectres de masse, où le passage à des valeurs m/z plus élevées dans l’échantillon stérilisé (vert, haut) est évident pour la plupart des signaux peptidiques. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7 : Capture d’écran de l’espace de travail dans le logiciel de traitement HDX. (A) La liste des peptides dérivés de HalM2 obtenus à partir de l’analyse d’échantillons de référence HalM2 avec le logiciel protéomique (Figure 3) et le seuil subséquent dans le logiciel de traitement HDX (Figure 4). Le peptide actuellement sélectionné (HIDKLTVGL, couvrant les résidus halm2 110−118) est mis en évidence en bleu. (B) Les courbes d’absorption du deutérium (en fonction du temps d’échange) pour les deux états biochimiques d’intérêt: l’enzyme HalM2 libre, et l’enzyme HalM2 liée à AMPPNP et le précurseur lanthipeptide, HalA2. (C) Spectre de masse de l’échantillon activement sélectionné (dans ce cas, l’un des échantillons de référence HalM2 non stérilisés). Les bâtons bleus du panneau C peuvent être attribués manuellement/non assignés au besoin s’ils n’ont pas été correctement assignés par le logiciel de traitement HDX lors du traitement initial des données. (D,E) Parcelles spectrales empilées pour l’état HalM2 (D) et l’état HalM2:AMPPNP:HalA2 (E). L’augmentation dépendante du temps de l’absorption de deutérium est facilement visible, tout comme la différence d’absorption entre les deux états biochimiques. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8 : Minimiser l’écart type dans les valeurs d’absorption mesurées. La carte de couverture du logiciel de traitement HDX (panneau C) fournit un moyen pratique d’identifier rapidement les peptides avec de grands écarts types dans leurs valeurs mesurées d’absorption de deutérium. Dans ce cas hypothétique, certains des pics isotopiques (bâtons bleus) du peptide dérivé halm2 couvrant les résidus 110−118 ne sont pas attribués pour les points de temps d’échange de 5 min (les bâtonnets gris du panneau B). Ceci mène à un écart type important dans la valeur d’absorption de deutérium mesurée pour le point de temps d’échange de 5 min. Le grand écart type est facilement évident par rapport à la couleur bleue du peptide 110−118 dans la carte de couverture (panneau C) et à partir de la dispersion du point de données et de la grande barre d’erreur dans la parcelle d’absorption (panneau A). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 9 : L’espace de travail Deuteros. Dans cet exemple, les valeurs de différence d’absorption ont été calculées dans le logiciel de traitement HDX en soustrayant l’absorption de deutérium de l’état HalM2:AMPPNP:HalA2 de celui de l’état HalM2:AMPPNP. L’objectif de la comparaison était de visualiser comment la liaison peptidique (HalA2) a modifié la dynamique structurelle du complexe HalM2:AMPPNP. L’ensemble de données contenait 4 points de temps d’échange (0,5, 5, 30 et 240 min). La différence d’absorption pour chaque peptide à chaque point de temps d’échange est illustrée dans les parcelles de Woods. Les peptides colorés dans les parcelles woods indiquent des peptides qui présentent une différence significative d’absorption, tel que défini par l’écart type des mesures de répétition présentes dans l’ensemble de données et les limites de confiance définies par l’utilisateur sélectionnées dans Deuteros. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 10 : Les données HDX-MS guident l’analyse fonctionnelle de la liaison peptidique et de l’activation allostérique dans la synthétase lanthipeptide HalM2. Le changement d’absorption de deutérium lors de la liaison du peptide précurseur HalA2 à la synthétase halm2 lanthipeptide a été étudié. La différence d’absorption pour chaque peptide après une réaction d’échange de 5 min est tracée (A). Cette intrigue a été générée dans le logiciel de traitement HDX. Les peptides colorés rouge et bleu subissent de moins en moins d’absorption de deutérium, respectivement, en présence du peptide HalA2. Ces « points chauds » HDX sont cartographiés sur un modèle d’homologie HalM2 (B,C). L’identification des peptides subissant des différences significatives d’échange a été déterminée dans Deuteros. Le script PyMOL utilisé pour cartographier les valeurs de différence sur le modèle d’homologie a été généré dans Deuteros. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Nous n’avons rien à divulguer.