L’immunoassay d’électrochimie (ECLIA) est une nouvelle approche pour la détection quantitative des variantes de protéines MeCP2 endogènes et exogènement appliquées, qui produit des mesures hautement quantitatives, précises et reproductibles avec une erreur intra- et inter-essais faible sur un large éventail de travail. Ici, le protocole pour le MeCP2-ECLIA dans un format de 96 puits est décrit.
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Article de méthode
Un essai à base d’électrochimie pour Les variantes de protéines MeCP2
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’ECLIA est une méthode polyvalente qui est capable de quantifier les quantités de protéines endogènes et recombinantes dans un format de 96 puits. Pour démontrer l’efficacité d’ECLIA, cet essai a été employé pour analyser des niveaux intrinsèques de MeCP2 dans le tissu de cerveau de souris et l’absorption de TAT-MeCP2 dans les fibroblastes dermals humains. Le MeCP2-ECLIA produit des mesures très précises et reproductibles avec une faible erreur intra-analyse et inter-analyse. En résumé, nous avons développé une méthode quantitative pour l’évaluation des variantes de protéines MeCP2 qui peuvent être utilisées dans des écrans à haut débit.
Introduction
L’immunoassay d’électrochimie (ECLIA) est basé sur un processus qui utilise des étiquettes conçues pour émettre de la luminescence lorsqu’elles sont stimulées électrochimiquement. Il s’agit d’une technique largement applicable pour la détection quantitative des analytes biologiques dans l’industrie de base et la recherche universitaire, l’industrie alimentaire ainsi que dans le diagnostic clinique1. Généralement, une plaque jetable de 96 puits avec des électrodes en encre de carbone est utilisée. Ces électrodes agissent comme un porteur de phase solide pour l’immunoassay. Un anticorps secondaire est conjugué à une étiquette électrochimique et l....
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Protocole
L’approbation de l’approvisionnement en biopsie de la peau à des fins de recherche a été obtenue auprès du Comité d’éthique de la recherche humaine de l’Hôpital pour enfants de Westmead, en Australie. Le consentement pour les expériences animales a été obtenu auprès du Ministère fédéral autrichien des sciences, de la recherche et de l’économie, qui ont été effectués conformément aux règlements locaux sur le bien-être animal (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
REMARQUE : Le principe du système ECLIA est représenté à la figure 1.
1. Sélection d’anticorps
- Évaluez le rapport signal-b....
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Résultats
Le principe du système ECLIA est décrit à la figure 1. Les courbes standard pour deux variantes MeCP2 sont indiquées dans la figure 2. La quantification précise était possible sur un large éventail de concentrations (1 à 1 800 ng/mL). Dans la figure 3, les niveaux de lysates meCP2 dérivés du cerveau de souris et des HDF ont été analysés. L’expression meCP2 dans les lysates nucléaires du cerveau des hétérozygotes, du wildtype et des .......
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Discussion
Pour mesurer les niveaux endogènes MeCP2, recombinants MeCP2 et TAT-MeCP2, une plaque de 96 puits ECLIA a été développée. Il a été démontré que la perte de la fonction de protéine MeCP2 conduit au syndrome de RTT6, pour lequel le traitement est actuellement limité à la gestion des symptômes et la physiothérapie. Une avenue de traitement prometteuse est la thérapie de remplacement de protéine, où les niveaux de MeCP2 peuvent être titrés jusqu’à leur concentration nécessaire12
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous sommes très reconnaissants à la Dre Brigitte Sturm pour son soutien à l’instrument ECLIA.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1,4-Dithiothréitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D9779 | Réactif de lyse hypotonique, tampon d’extraction, |
| dosage de protéines Bio-Rad, concentré de réactif de colorant | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Préparation d’échantillon |
| Détection AB SULFO-TAG étiqueté anti-lapin | Meso Scale Diagnostics | R32AB-1 | |
| Antibody Discovery workbench 4.0 | Meso Scale Discovery | Software | |
| DMEM (1X) | gibco by Life Technologies | 41966-029 | Préparation d’échantillons |
| Dulbecco' s PBS (stérile) | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Préparation d’échantillons, Solution de lavage, Solution d’enrobage |
| EDTA | Sigma-Aldrich | EDS | Tampon d’extraction |
| Sérum fœtal bovin | Sigma-Aldrich | F9665 | Préparation d’échantillons |
| Glycérol | Sigma-Aldrich | G2025 | Tampon d’extraction |
| Gold Read Buffer T (1x) avec tensioactif | Meso Scale Diagnostic | R92TG | MeCP2 Protocole ECLIA |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | Réactif de lyse hypotonique, tampon d’extraction |
| KIMBLE Dounce kit de broyeur de tissus | Sigma-Aldrich | D8938 | Préparation d’échantillons |
| Laboratoire Agitateur, mouvement de balancement (basse vitesse) | GFL | 3014 | MeCP2 Protocole ECLIA |
| Chlorure de magnésium hexahydraté (MgCl*6H20) | Sigma-Aldrich | M2670 | Réactif de lyse hypotonique, Tampon d’extraction |
| MeCP2 (Humain) Protéine recombinante (P01) | Abnova Corporation | H00004204-P01 | Traitement cellulaire |
| Microseal B seal | Bio-Rad Laboratories Inc. | MSB1001 | pour l’étanchéité |
| des plaques Monoclonal Anti-MeCP2, produit chez la souris, clone Mec-168, immunoglobuline purifiée | Sigma-Aldrich | M6818-100UL ; RRID :AB_262075 | Anticorps, Solution d’enrobage |
| MSD Blocker A | Meso Scale Diagnostics | R93BA-4 | Blocker |
| MSD SECTOR Imager 2400 | Meso Scale Diagnostics | I30AA-0 | MeCP2 Protocole ECLIA |
| Multi-Array 96-well Plate | Meso Scale Diagnostics | L15XB-3/L11BX-3 | MeCP2 Protocole ECLIA |
| Pénicilline-Streptomycine | gibco by Life Technologies | 15140122 | Préparation d’échantillons |
| Polyclonal Anti-MeCP2, produit chez le lapin | Eurogentec S.A. | sur mesure | |
| Chlorure de potassium (KCl) | Merck KGaA | 1049361000 | Réactif de lyse hypotonique |
| Souris AB primaire, anti-MeCP2 (1B11) | Sigma-Aldrich | SAB1404063 ; RRID :AB_10737296 | Anticorps |
| primaire AB souris, anti-MeCP2 (4B6) | Sigma-Aldrich | WH0004204M1 ; RRID :AB_1842411 | Anticorps |
| primaire AB souris, anti-MeCP2 (Mec-168) | Sigma-Aldrich | M6818 ; RRID :AB_262075 | Anticorps |
| primaire AB souris, anti-MeCP2 (Men-8) | Sigma-Aldrich | M7443 ; RRID :AB_477235 | |
| Anticorps primaire AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) | Technologie de signalisation cellulaire | 3456S ; RRID :AB_2143849 | |
| Anticorps Inhibiteur de Protéase Cocktail (100X) | Sigma-Aldrich | 8340 | Réactif de lyse hypotonique, Tampon d’extraction |
| Secondaire AB, Lapin, anti-MeCP2 | Eurogentec S.A. | personnalisé | |
| Anticorps secondaire AB, Lapin, anti-MeCP2 | Merck | 07-013 | Anticorps |
| Chlorure de sodium (NaCl) | Tampon d’extraction | Sigma-Aldrich | S3014 |
| Anticorps anti-lapin marqué SULFO-TAG (chèvre) | Meso Scale Diagnostics | W0015528S | |
| Anticorps TAT-MeCP2 | protéine | Traitement cellulaire | |
| Trypsine EDTA 0,25 % (1X) | gibco par Life Technologies | 25200-056 | Traitement cellulaire |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Solution de lavage |
Références
- Debad, J. D., Glezer, E. N., Wohlstadter, J., Sigal, G. B., Leland, J. K. Clinical and biological applications of ECL. Electrogenerated Chemiluminescence. Bard, A. J. , CRC Press. Baca Raton, FL. 359-383 (2004).
- Yuzaburo, N., Michinori, U., Osamu, S. Highly Sensitive Electr....
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