Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Immunomarquage de testicules de drosophiles de mont entier pour l’analyse confocale 3D de grands spermatocytes

4K vues

⸱

DOI :

10.3791/61061

⸱

27 août 2020

 ,  , 
1CNRS, Institut Jacques Monod, Université de Paris, F 75006, Paris, France

Dans cet article

Résumé

Nous présentons ici un protocole amélioré pour la préparation et l’immunomarquage de tout-monture des testicules de drosophile, adapté à la microscopie confocale et permettant également un étiquetage reproductible et fiable. Nous illustrant ce protocole par la représentation 3D et la quantification des expériences de colocalisation sur les grands spermatocytes S4-S5.

Résumé

Les testicules de drosophile sont un système modèle puissant pour l’étude des processus biologiques, y compris la biologie des cellules souches, l’architecture nucléaire, la méiose et le développement des spermatozoïdes. Cependant, l’immunomarquage de l’ensemble du testicule de drosophile est souvent associé à une non-uniformité significative de la coloration due à la pénétration des anticorps. Les préparations écrasées ne surmontent que partiellement le problème car elles diminuent la qualité 3D des analyses. Ci-dessus, nous décrivons un protocole de tout-montage utilisant NP40 et heptane pendant la fixation ainsi que l’immunolabeling dans les milieux liquides. Il préserve le volume adapté à la microscopie confocale ainsi qu’un étiquetage reproductible et fiable. Nous montrons différents exemples de reconstitution 3D de noyaux de spermatocytes à partir de sections confocales. La reproductibilité intra- et inter-testicules permet la quantification 3D et la comparaison de la fluorescence entre des cellules individuelles de différents génotypes. Nous avons utilisé différents composants de la structure MINT intranucléaire (Mad1-containing Intra Nuclear Territory) ainsi que deux composants associés au complexe de pores nucléaires pour illustrer ce protocole et ses applications sur les plus grandes cellules du testicule, les spermatocytes S4-S5.

Introduction

Les testicules de drosophile sont un modèle précieux pour l’étude de l’architecture nucléaire. Dans les cellules spermatogoniales mitotiques, le volume nucléaire est largement occupé par la chromatine. Ces cellules subissent quatre cycles de division, produisant un kyste de 16 spermatocytes primaires. Au cours des jours suivants, les spermatocytes passent par 6 stades de développement (S1-S6), augmentant considérablement en volume, approximativement 20 fois1,2. Ils modifient également leur morphologie nucléaire. Le contour du noyau, révélé par la lamine Dm0, devient irrégulier et montre des invaginations profondes1,3. Ceci s’accompagne de changements importants de l’expression génique et de modifications dans l’organisation de la chromatine1,4,5,6,7. Les chromosomes interphase sont bien définis au stade S4-S5, formant trois masses distinctes correspondant aux 2 principaux autosomes bivalents et à la paire X-Y amarrés au nucléole.

Mad1 a été isolé à l’origine en tant qu’élément clé du point de contrôle mitotique (examiné en8). En interphase, il est décrit comme situé principalement au niveau de l’enveloppe nucléaire mais aussi dans le nucléoplasme 9,10,11. Dans le testicule de drosophile, nous avons rapporté que Mad1 est en avant dans le nucléoplasme, intimement associé aux deux masses autosomal importantes de chromatine et dans une moindre mesure à la chromatine DE X/Y. Nous avons défini cette structure associée à la chromatine comme MINT (Mad1-containing IntraNuclear Territory)12. Quatre autres protéines ont été associées aux MINTs dans les spermatocytes : la nucléoporine Mtor/Tpr, la peptidase SUMO Ulp1, la protéine de point de contrôle mitotique Mad2 et une sous-unité d’un complexe de type Polycomb Raf212.

Pour compléter la description des MINTs, nous avons dû employer des anticorps et avons été confrontés aux problèmes techniques généralement rencontrés avec immunostaining dans le testicule : une perméabilité pauvre ayant pour résultat une non-uniformité significative de souillure dans la profondeur du testicule, en particulier dans les grands spermatocytes. Lespréparations annulées ont augmenté l’accès aux anticorps mais ont conduit à des images compressées, limitant les analyses 3D et empêchant la mesure de la fluorescence quantitative, y compris la colocalisation. Le problème de la pénétration d’anticorps a également pu être adressé par des agents perméabilisants tels que le désoxycholate 13 de Nade 0,3%,mais ce procédé n’a pas dans nos mains donné des résultats reproductibles. Parce que nous avons effectué de nombreuses expériences de co-étiquetage, nous avons cherché à améliorer le protocole de perméabilisation. La combinaison de 1% NP40 plus heptane a entraîné plus de reproductibilité, en particulier dans l’étude des grands spermatocytes.

Ce protocole effectue la fixation et l’immunomarquage des testicules en suspension, améliorant la qualité de l’échantillon ainsi que la reproductibilité, et le rendant approprié pour la microscopie confocale. Nous avons utilisé le protocole pour mieux définir les relations spatiales de certaines protéines de l’enveloppe nucléaire avec les structures nucléoplasmiques de grands spermatocytes. Cette méthode permettra de mieux enquêter sur les changements qui accompagnent le développement des spermatocytes, par exemple les changements structurels dynamiques du noyau, y compris la chromatine, le nucléoplasme et les pores nucléaires.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

1. Collecte de testicules de drosophile

REMARQUE : Les jeunes mâles (0 à 15 h après l’éclosion) sont nécessaires pour examiner les cellules germinales diploïdes (c.-à-d. spermatogonie et spermatocytes).

  1. Sélectionnez les jeunes mouches autant que possible pour minimiser les interférences des spermatides en développement.
  2. Anesthésier les mouches par brève exposition au dioxyde de carbone et les transférer sur un tapis demouches 14,15.
  3. Sous un microscope à dissection (grossissement 10x), utilisez une pince pour retirer la tête.
  4. Transférer 5 à 10 mouches décapitées sur 100 μL de tampon de Ringer (KCI de 183 mM, NaCl 47 mM, Tris-HCI de 10 mM, EDTA 1 mM, inhibiteur de protéine complète, pH 6,8) sur une lame de verre enduit de silicone sur un support de fond noir.
  5. Avec un microscope à dissection à un grossissement 40x, utilisez une paire de pinces numéro 5 pour maintenir une mouche entre le thorax et l’abdomen et, avec d’autres pinces, éloignez l’abdomen du thorax. Isolez rapidement les testicules et les tissus adjacents de la carcasse de mouche15 et placez-les dans une nouvelle goutte de tampon de Ringer sur la même lame.
  6. Une fois que tous les testicules sont prêts, nettoyez les testicules des tissus restants (glande accessoire et organes génitaux externes).
  7. Retirez l’excès de mémoire tampon de la goutte contenant les testicules disséqués. En règle générale, utilisez une pipette p200 avec une pointe de 10 μL montée sur une pointe de 200 μL. Cela permet d’éliminer l’excès de liquide à travers une petite ouverture. Placer une goutte de fixateur de paraformaldéhyde à 4% sur la goutte contenant les testicules disséqués, puis transférer rapidement les testicules dans un tube contenant une solution fixatrice fraîche.

2. Fixation du paraformaldéhyde

  1. Préparer 2 mL de solution fixatrice juste avant utilisation : 600 μL de paraformaldéhyde à 4 % dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 30 μL de NP40 20 % plus 1200 μL d’heptane dans un tube de microcentrifugation siliconé de 2 mL. Utiliser du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS préparé dans des aliquotes de 600 μL et conservé à -20 °C.
    Attention : L’heptane et le paraformaldéhyde sont toxiques et doivent être manipulés dans une hotte. Éliminez-les conformément aux règlements de l’institut d’accueil.
  2. Transférer les testicules à l’aide d’une micropipette p200 avec une pointe à large ouverture vers la solution PFA/NP40/heptane. Agiter le tube de haut en bas pendant 30 s à la main. Continuer à fixer les testicules sur un mélangeur rotatif à température ambiante pendant 30 min.
  3. Arrêtez le mélangeur rotatif et placez le tube dans un rack à tubes pour permettre la séparation de phase et pour que les testicules se déposent au fond du tube.
  4. Retirez tout l’heptane et la solution fixatrice et rincez rapidement les testicules trois fois avec 1x PBS.
  5. Transférer dans un tube individuel propre de 200 μL. Effectuer toutes les incubations dans ces petits tubes pour minimiser les quantités d’anticorps utilisés.
  6. Retirer l’excès de tampon à l’aide d’une micropipette de 200 μL avec une pointe P200 et une pointe P10 attachées. Veillez à ne pas aspirer les testicules.
  7. Conservez les testicules en PBS 1x sur la glace jusqu’à ce que tous les échantillons soient prêts.

3. Coloration des anticorps en solution

  1. Jeter le PBS et laisser les testicules dans 0,3% PBS-T pendant 30 min à température ambiante pour perméabiliser les membranes cellulaires.
  2. Pré-incuber dans le même tampon plus 5% sérum de chèvre normal (NGS) pendant 1 h.
  3. Ajouter 200 μL de l’anticorps primaire dilué dans 0,3 % pbs-t plus 5 % ngs(table des matériaux).
  4. Incuber l’anticorps primaire pendant la nuit à 4 °C (ou température ambiante) avec une agitation douce sur une bascule.
  5. Laver 3 fois dans 0,3% PBS-T pendant 15 min sur une bascule à température ambiante. Laisser les testicules se déposer au fond du tube par gravité.
  6. Ajouter 200 μL d’anticorps secondaires dilués 1:500 de la série conjuguée DyLight.
  7. Incuber l’anticorps secondaire dans une chambre sombre pendant 4 h à température ambiante.
  8. Laver à 0,3% PBS-T pendant 15 min sur une bascule à température ambiante. Répétez ensuite avec 0,2% PBS-T et 0,1% PBS-T, à chaque fois pendant 30 min sur une bascule à température ambiante. Faites un lavage final en PBS 1x pendant 30 min pour enlever le détergent.
  9. Ajouter 180 μL de solution de DAPI à 1 μg/mL dans 1x PBS pendant 15 min. La solution mère est de 10 mg/mL dansH2O.Évitez de faire une solution mère dans pbs, ce qui peut réduire le signal de coloration DAPI sur la chromatine diffuse dans les spermatocytes plus gros.
  10. Laver 3x pendant 5 min chacun.
  11. Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour dessiner un cercle sur une diapositive propre.
  12. Aspirez les testicules et mettez-les sur la lame. Le pré-rinçage de la pointe à grande ouverture avec 0,1% pbs-t empêche les testicules de coller à la pointe. Retirez l’excès de PBS.
  13. Ajouter une goutte (environ 100 μL) de Citifluor AF1.
  14. Placez doucement une lamelle de couverture de verre sur le tissu, en prenant soin d’éviter de piéger les bulles d’air.
  15. Scellez la lame de couverture sur la lame à l’aide de vernis à ongles clair.
  16. Observez des lames au microscope.

4. Analyses de colocalisation

  1. Acquérir des images confocales. Nous avons utilisé un microscope confocal Zeiss LSM 710 (huile apochromatique Plan 63x) avec une résolution z de 0,5 ou 1 μm.
  2. Sélectionnez différentes cellules parmi des testicules indépendants.
  3. Importez des images dans un logiciel de traitement (par exemple, Imaris).
  4. Définir le noyau par segmentation manuelle afin d’exclure les noyaux voisins. Utilisez le logiciel Coloc; il recueille les coefficients de corrélation de Pearson (PCC) à l’intérieur du volume entier entre 2 fluorophores.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Le principal obstacle à l’obtention d’une coloration adéquate des testicules de drosophile est la pénétrabilité limitée des anticorps, qui a été partiellement résolue en utilisant des préparations écrasées mais au prix d’une restriction des analyses 3D (par exemple la représentation 3D ou la mesure de la colocalisation). La procédure permet un étiquetage uniforme et préserve le volume de toutes les cellules du testicule. Ici, nous avons concentré l’illustration de la méthode sur la représentation 3D des spermatocytes S4-...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Ce protocole fournit une méthode pour l’immunolabeling réussi des testicules adultes de drosophile de tout-monté. Comme indiqué dans d’autres procédures, les jeunes mâles doivent être utilisés (nous avons même raccourci l’âge à moins de 20 heures après l’éclosion) pour minimiser la présence de spermatozoïdes en développement, ce qui risque d’obstruer les spermatocytes. La dissection doit être rapide et la dilution des anticorps doit être ajustée pour optimiser le rapport signal/bruit21,...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions P. Verrijzer, J. Johansen H., Okhura pour les anticorps et A. Debec, les centres boursiers de Bloomington et de Vienne pour les mouches. Merci à C. Jackson pour ses suggestions et ses discussions stimulantes.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Drosophila srains
ketelGFP y ; ketelGFP/y+CyODon de A. Debec (Institut Jacques Monod, UMR 7592, Paris, France)
Mad1-GFPJ Cell Sci. 15 mai 2011 ; 124(Pt 10) :1664-71.
Mtor ARNi  ;VDRCID 110218Centre d’ARNi de la drosophile de Vienne
Materials
DAPI  ;ThermoD1306La solution mère doit être préparée dans H2O
Dumont # 5 Fine Forseps  ;Outils
MBP Pointes de pipette à grand calibreFisherbrand11917744Pointe à grande ouverture
Thermo Scientific  ; 0,2 mL TubeIndividuel ThermoAB-0620
2 ml micro tubes à centrifuger  ;SigmaT3531-200EA  ;Tube siliconé de 2 ml
Citifluor AF1CitifluorAF1
Dakopen  ;SigmaZ377821-1EA  ;
Sérum de chèvre normal (NGS)SigmaNS02L-1ML
Paraformaldéhyde 4 %SigmaP6148-500G  ;Paraformaldéhyde (4 %) dissous dans l’aliquote PBS 1X par 600 ml
PBS 1XThermo14190094DPBS, sans calcium, sans magnésium
0,1 % (0,2 ou 0,3 %) PBS-T  ;PBS 1X  ; contenant 0,1 % (0,2 % ou 0,3 %) Triton X-100
Triton X-100, pour la biologie moléculaire,  ;SigmaT8787
Antibodies
GFP boosterChromotekgba4881/200
Souris anti-Mtor1/40 cadeau de J. Johansen, Iowa State University
Rat anti-Nup621/200 cadeau de H. Ohkura (Université d’Édimbourg, Royaume-Uni
Cobaye anti-Ulp11/200 don de C. P. Verrijzer, Université Erasme, Rotterdam
Lapin anti-Raf21/200 don de C. P. Verrijzer, Université Érasme, Rotterdam
DyLight série conjuguée  ;Thermo1/500 Donkey anti-(cobaye, souris, lapin ou rat) comme deuxième anticorps
scientifiques fins

Références

  1. Cenci, G., Bonaccorsi, S., Pisano, C., Verni, F., Gatti, M. Chromatin and microtubule organization during premeiotic, meiotic and early postmeiotic stages of Drosophila melanogaster spermatogenesis. Journal of Cell Science. 107, 3521-3534 (1994).
  2. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Gatti, M. Spindle assembly in Drosophila neuroblasts and ganglion mother cells. Nature Cell Biology. 2 (1), 54-56 (2000).
  3. Fabbretti, F., et al. Confocal Analysis of Nuclear Lamina Behavior during Male Meiosis and Spermatogenesis in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11 (3), 0151231(2016).
  4. Fuller, M. T. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Martinas-Arias, A. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 71-148 (1993).
  5. Hiller, M., et al. Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program. Development. 131 (21), 5297-5308 (2004).
  6. Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., Fuller, M. T. Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation. Science. 310 (5749), 869-872 (2005).
  7. White-Cooper, H., Davidson, I. Unique aspects of transcription regulation in male germ cells. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (7), (2011).
  8. Luo, Y., Ahmad, E., Liu, S. T. MAD1: Kinetochore Receptors and Catalytic Mechanisms. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 51(2018).
  9. Chen, R. H., Shevchenko, A., Mann, M., Murray, A. W. Spindle checkpoint protein Xmad1 recruits Xmad2 to unattached kinetochores. Journal of Cell Biology. 143 (2), 283-295 (1998).
  10. Campbell, M. S., Chan, G. K., Yen, T. J. Mitotic checkpoint proteins HsMAD1 and HsMAD2 are associated with nuclear pore complexes in interphase. Journal of Cell Science. 114, Pt 5 953-963 (2001).
  11. Katsani, K. R., Karess, R. E., Dostatni, N., Doye, V. In vivo dynamics of Drosophila nuclear envelope components. Molecular Biology of the Cell. 19 (9), 3652-3666 (2008).
  12. Raich, N., Mahmoudi, S., Emre, D., Karess, R. E. Mad1 influences interphase nucleoplasm organization and chromatin regulation in Drosophila. Open Biology. 8 (10), (2018).
  13. Chang, Y. J., Pi, H., Hsieh, C. C., Fuller, M. T. Smurf-mediated differential proteolysis generates dynamic BMP signaling in germline stem cells during Drosophila testis development. Developmental Biology. 383 (1), 106-120 (2013).
  14. Stocker, H., Gallant, P. Getting started: an overview on raising and handling Drosophila. Methods in Molecular Biology. 420, 27-44 (2008).
  15. Zamore, P. D., Ma, S. Isolation of Drosophila melanogaster testes. Journal of Visualized Experiments. (51), e2641(2011).
  16. Gigliotti, S., et al. Nup154, a new Drosophila gene essential for male and female gametogenesis is related to the nup155 vertebrate nucleoporin gene. Journal of Cell Biology. 142 (5), 1195-1207 (1998).
  17. Chen, H., Chen, X., Zheng, Y. The nuclear lamina regulates germline stem cell niche organization via modulation of EGFR signaling. Cell Stem Cell. 13 (1), 73-86 (2013).
  18. Fawcett, D. W., Chemes, H. E. Changes in distribution of nuclear pores during differentiation of the male germ cells. Tissue Cell. 11 (1), 147-162 (1979).
  19. Bolte, S., Cordelieres, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. Journal of Microscopy. 224, Pt 3 213-232 (2006).
  20. White-Cooper, H. Tissue, cell type and stage-specific ectopic gene expression and RNAi induction in the Drosophila testis. Spermatogenesis. 2 (1), 11-22 (2012).
  21. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Immunostaining of Drosophila testes. 2011 (10), Cold Spring Harbor Protocols. 1273-1275 (2011).
  22. Bonaccorsi, S., Giansanti, M. G., Cenci, G., Gatti, M. Paraformaldehyde fixation of Drosophila testes. 2012 (1), Cold Spring Harbor Protocols. 102-104 (2012).
  23. White-Cooper, H. Spermatogenesis: analysis of meiosis and morphogenesis. Methods in Molecular Biology. 247, 45-75 (2004).
  24. Kibanov, M. V., Kotov, A. A., Olenina, L. V. Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Analytical Biochemistry. 436 (1), 55-64 (2013).
  25. Theofel, I., et al. tBRD-1 and tBRD-2 regulate expression of genes necessary for spermatid differentiation. Biology Open. 6 (4), 439-448 (2017).
  26. Trost, M., Blattner, A. C., Leo, S., Lehner, C. F. Drosophila dany is essential for transcriptional control and nuclear architecture in spermatocytes. Development. 143 (14), 2664-2676 (2016).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Coloration sur montage entiermicroscopie confocaleprotocole d immunomarquagefixation au heptane NP40p n tration des anticorpsreconstruction 3Dnoyaux de spermatocytesquantification de la fluorescenceanalyse de colocalisation
Immunomarquage de testicules de drosophiles de mont entier pour l’analyse confocale 3D de grands spermatocytes
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.