Un guide de sectionnement, de coring et de traitement d’image pour l’approvisionnement et l’analyse d’échantillons d’os cortical à haut débit pour le micro-CT synchrotron

Résumé

Nous avons utilisé un protocole d’échantillonnage géologique (carottage) pour se procurer des spécimens d’os corticals de taille uniforme pour les expériences SRμCT de l’aspect antérieur du femora humain. Cette méthode est minimalement destructrice, efficace, se traduit par des spécimens cylindriques qui minimisent l’imagerie des artefacts à partir de formes d’échantillons irrégulières et améliore la visualisation et l’analyse microarchitecturales.

Résumé

L’os est un tissu dynamique et mécaniquement actif qui change de structure au cours de la durée de vie humaine. Les produits du processus de remodelage d’os ont été étudiés substantiellement utilisant les techniques bidimensionnelles traditionnelles. Les progrès récents de la technologie d’imagerie aux rayons X par l’intermédiaire de la tomographie micro-calculée de bureau (μCT) et de la tomographie micro-calculée par rayonnement synchrotron (SRμCT) ont permis l’acquisition de balayages tridimensionnels à haute résolution (3D) d’un plus grand champ de vision (FOV) que d’autres techniques d’imagerie 3D (p. ex., SEM) fournissant une image plus complète des structures microscopiques dans l’os cortical humain. Toutefois, le spécimen doit être centré avec précision à l’intérieur du FOV afin de limiter l’apparence des artefacts de stries connus pour avoir un impact sur l’analyse des données. Des études antérieures ont signalé l’achat de blocs osseux rectilinaires de forme irrégulière qui entraînent des artefacts d’imagerie en raison de bords inégaux ou de troncature d’image. Nous avons appliqué un protocole d’échantillonnage géologique (carottage) pour se procurer des spécimens de carottes osseuses corticales de taille constante pour des expériences SRμCT de l’aspect antérieur du femora humain. Cette méthode de carottage est efficace et minimalement destructrice pour les tissus. Il crée des échantillons cylindriques uniformes qui diminuent les artefacts d’imagerie par nature d’être isométrique pendant la rotation et de fournir une longueur de chemin uniforme pour les faisceaux de rayons X tout au long de la numérisation. Le traitement d’image des données tomographiques de rayon X des échantillons cored et irrégulièrement formés confirme le potentiel de la technique pour améliorer la visualisation et l’analyse de la microarchitecture corticale d’os. L’un des objectifs de ce protocole est de fournir une méthode fiable et reproductible pour l’extraction de noyaux d’os corticals adaptables à divers types d’expériences d’imagerie osseuse à haute résolution. Un objectif global du travail est de créer un approvisionnement normalisé d’os cortical pour SRμCT qui est abordable, cohérent, et simple. Cette procédure peut en outre être adaptée par des chercheurs dans des domaines connexes qui évaluent généralement des matériaux composites durs tels que dans l’anthropologie biologique, les géosciences, ou les sciences des matériaux.

Introduction

Avec les progrès récents de la technologie d’imagerie, il est maintenant possible d’acquérir des données d’imagerie par rayons X avec une très haute résolution. Les systèmes de micro-CT de bureau (μCT) sont la norme actuelle pour l’imagerie des os cancellous en raison de leur nature non destructive¹. Quand les dispositifs microstructuraux de formation image de l’os cortical, cependant, l’utilisation de μCT a été plus limitée. En raison de contraintes de résolution, les systèmes de bureau ne peuvent pas atteindre la résolution requise pour l’image des caractéristiques microstructurales plus petites que les pores corticals, tels que les lacunae ostéocytes. Pour cette application, SRμCT est idéal en raison de la plus grande résolution de ces systèmes¹. Par exemple, des expériences menées à la Source lumineuse canadienne (CLS) sur les lignes de faisceaux d’imagerie et de thérapie biomédicales (BMIT)² ont produit des images avec des voxels aussi petits que 0,9 μm. Des études^{antérieures 1,3,4,5 ont} utilisé cette résolution pour acquérir des projections et des rendus tridimensionnels subséquents (3D) à partir de spécimens d’os corticals provenant d’os longs humains ( figure1) pour quantifier la densité lacunaire ostéocyte^4,6,7,^8,9 et la variation de la forme lacunaire et de la taille³ à travers la durée de vie humaine et entre les sexes. D’autres études ont démontré la présence de baguage d’ostéon^{chez l’homme 10}, un phénomène précédemment reconnu pour être associé à seulement les mammifères non humains dans la littérature anthropologique médico-légale.

Afin d’obtenir une résolution exceptionnelle, le faisceau de rayons X doit être finement concentré dans le champ de vision (FOV), ce qui limite souvent la taille maximale du spécimen à quelques millimètres de diamètre. À l’heure actuelle, il n’y a pas eu de procédures complètes et normalisées décrites dans la documentation décrivant l’approvisionnement en échantillons d’os qui répondent à ces restrictions. Il est essentiel de centrer les spécimens à l’intérieur du FOV pour s’assurer que 1) l’échantillon reste centré pendant qu’il tourne à 180° pendant l’imagerie, et 2) les artefacts de balayage sont limités puisqu’il n’y a pas de troncature d’image. En d’autres termes, aucune partie de l’échantillon à l’extérieur du FOV n’interfère avec le faisceau entrant dans son point focal à l’intérieur du FOV. Si cela se produit, l’algorithme de reconstruction est privé de certaines des données d’atténuation nécessaires pour une reconstruction entièrement correcte. Il est également intéressant de noter que les balayages à 360° (rotation complète) minimisent les effets du durcissement du faisceau, mais augmentent les artefacts causés par le désalignement et le mouvement de l’échantillon pendant l’imagerie. Ainsi, alors qu’une analyse à 360° génère généralement des données plus propres, le temps d’imagerie est doublé et un compromis entre coût expérimental et qualité des données doit donc être abordé.

Un aspect important et souvent négligé des expériences d’imagerie osseuse est la technique précise et reproductible de préparation des spécimens effectuée avant la numérisation. Les études qui intègrent les méthodes SRμCT dans leurs expériences mentionnent brièvement leur protocole d’échantillonnage, mais les auteurs fournissent peu ou pas de détails sur la méthodologie particulière utilisée pour recueillir leurs spécimens. Beaucoup de ces études mentionnent la coupe des blocs rectilinaires d’os de dimensions arbitraires, mais ne fournissent généralement aucune autre information sur les outils ou les matériaux^{d’intégration utilisés 3,4,10,11,12,13,14}. Certains chercheurs utilisent couramment des outils rotatifs portatifs (p. ex., Dremel) pour enlever les blocs rectilinaires d’os d’une région^{d’intérêt}(ROI)^3,4^{,10,11,12,13,14}. Cette méthode se traduit par des échantillons de taille non uniforme qui peuvent être plus grands que le FOV, augmentant la probabilité de scanner des artefacts et de tronquer l’image. Ces spécimens nécessitent souvent un raffinage plus important à l’aide d’une scie à gaufrettes de précision (p. ex., Buehler Isomet). Il est essentiel d’obtenir des échantillons aux dimensions cohérentes (jusqu’aux deux centièmes/mm) pour s’assurer que les ensembles de données acquis sont de la plus haute qualité et que les résultats subséquents sont reproductibles.

La production limitée de rapports sur la méthodologie d’approvisionnement des échantillons ajoute une couche supplémentaire de difficulté lorsqu’on tente d’employer et/ou de valider les méthodes effectuées dans une étude antérieure. À l’heure actuelle, les chercheurs doivent communiquer directement avec les auteurs pour obtenir de plus amples détails sur leurs procédures d’échantillonnage. Le protocole détaillé ici fournit aux chercheurs biomédicaux une technique d’échantillonnage soigneusement documentée, reproductible et rentable. L’objectif principal de cet article est de fournir un tutoriel complet sur la façon de se procurer des échantillons de carottes osseuses corticales de taille constante à l’aide d’une presse à forer et d’un morceau de carottage de diamants pour la visualisation et l’extraction précises des données microarchitecturales. Cette méthode est modifiée à partir de procédures utilisées pour recueillir régulièrement uniforme, petit diamètre (1-5 mm) cylindres à partir de blocs de matériaux durs dans la mécanique de roche à^{haute pression 15,16,17,18,19}.

Protocole

Tous les spécimens proviennent de donneurs cadavériques embaumés de l’Université de Tolède, du College of Medicine and Life Sciences et de la Northeast Ohio Medical University (NEOMED), avec le consentement éclairé du donneur lui-même ou du plus proche parent du donneur. La Commission d’examen institutionnel de la protection des sujets humains (CISR) de l’Université d’Akron a jugé ces spécimens exemptés de l’examen complet de la CISR, car ils n’ont pas été obtenus de personnes vivantes. Des renseignements démographiques, y compris l’âge, le sexe et la cause du décès, étaient disponibles pour tous les donneurs. Les personnes sélectionnées n’ont pas documenté les conditions os-affectant ni l’exposition aux régimes de traitement qui peuvent avoir affecté le remodelage d’os au moment du décès. Des échantillons corticals d’os ont été obtenus de femora des mâles et des femelles modernes cadavériques avec des âges s’étendant de 19 à 101 ans (moyen = 73.9 ans). Le milieu de forme fémoral a été étudié intensivement comprenant des examens de la variation de la porosité^{corticale 20,21,22,23,24} et la densité matérielle du tissu^{osseux 25,26,27}, et est ainsi devenu un site couramment utilisé pour les analyses microstructurales.

1. Approvisionnement et macération des tissus

1. Utilisez une scie oscillante équipée d’une lame de carbure de coupe plongeante (pour les matériaux composites) pour obtenir des blocs d’os d’environ 7,5 cm à partir des diaphyses intermédiaires du femora gauche.
2. Faire tremper les blocs fémoraux dans un plat en verre allant au four rempli d’une enzyme protéase en poudre et d’une solution d’eau du robinet pendant 1 h dans un incubateur fixé à 45 °C.
3. Après l’incubation, retirez soigneusement les tissus mous restants et le périoste à l’aide d’une dissection émoussée ou d’outils dentaires.
   REMARQUE : Évitez l’utilisation d’outils pointus (p. ex., scalpel) pour enlever les tissus mous. Ces instruments peuvent endommager l’os qui est détectable dans les balayages de μCT, affectant la conservation de spécimen et la qualité de données de balayage.
4. Enlever les débris ou les occlusions dans la cavité médullaire en plaçant des blocs osseux dans un nettoyeur à ultrasons pendant 5 à 10 minutes avec 20:1 parties d’eau du robinet pour nettoyer la solution (voir table des matériaux)ou en utilisant un flosser d’eau portatif (p. ex., Waterpik).
5. Immerger le bloc osseux dans une tasse à spécimens et remplir de 70 % d’éthanol. Laisser tremper l’os pendant au moins 24 heures pour éliminer les lipides.
   REMARQUE : Les xylènes peuvent également être utilisés pour éliminer les lipides. Le trempage prolongé dans les xylènes, cependant, peut rendre l’os cassant ou crayeux car il est un émulsifiant.
6. Après 24 heures, retirer les blocs osseux de l’éthanol et laisser sécher à l’air libre à température ambiante pendant 24 à 48 heures.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.

2. Sectionment des tissus

1. Déposer une lame de microscope en verre de 75 x 25 mm sur une plaque chaude fixée à 140 °C. Faire fondre une généreuse quantité de résine époxy thermique (voir tableau des matériaux)au centre de la lame.
   1. Si vous préparez d’autres sections minces pour la microscopie (<50 μm), le bloc osseux peut devoir être incorporé dans un époxy en deux parties pour préserver le trabeculae. En outre, lors de la mise en œuvre de ce protocole pour les spécimens fragiles (p. ex., os diagénétique ou spécimens fortement trabecularisés), il est nécessaire d’intégrer des spécimens dans un époxy.
      REMARQUE : Des échantillons d’os utilisés dans ce protocole ont été prélevés sur des spécimens cadavériques embaumés. Si des spécimens frais sont prélevés à l’autopsie ou dans un cas chirurgical pour examiner les structures des tissus mous (p. ex., vascularisation) par l’intermédiaire du SRμCT, l’imprégnation par époxy peut causer des dommages à ces tissus. Dans ces cas, un autre support adhésif ou de montage est recommandé (p. ex., ruban adhésif à double face, argile de modélisation).
2. Appuyez sur l’aspect inférieur du bloc osseux dans la résine époxy thermique sur la glissière du microscope, avec la longueur de l’os perpendiculaire à la lame. Déplacez l’échantillon d’avant en arrière afin d’enduire le dessous de l’os et d’assurer une adhérence sécuritaire à la glissière.
3. Laissez reposer le spécimen monté sur la plaque chaude pendant ~5 min pour permettre à l’époxy thermique de se évacuer dans les pores et/ou les fissures.
   REMARQUE: L’époxy sur la diapositive doit être exempt de bulles pour une meilleure adhérence. Pour enlever les bulles, déplacez l’échantillon d’avant en arrière sur la diapositive. Des bulles se forment souvent à cause de l’eau et/ou de l’éthanol emprisonnés dans l’os qui s’échappent et s’évaporent.
4. Retirez la lame avec le spécimen monté de la plaque chaude à l’aide de forceps contondants et laissez refroidir à température ambiante pendant ~10 minutes. Retirez tout époxy du bord de la lame à l’aide d’une lame de rasoir pour vous assurer que le mandrin saisit adéquatement la lame.
5. Fixez la glissière avec l’échantillon adhérent à un mandrin de glissière en verre et montez le mandrin au bras pivotant d’une scie à sectionnement à vitesse lente (voir tableau des matériaux, figure 2).
   REMARQUE : Bien qu’une scie Buehler IsoMet ait été utilisée dans ce protocole, d’autres scies de sectionnement de précision sont disponibles qui pourraient être utilisées à la place de l’IsoMet (p. ex., Leco, Exakt, Smartcut, CT3, Buehler Petrothin, Well Diamond Wire).
6. Ajustez le bras pivotant à l’aide du cadran de positionnement pour vous assurer que la lame entre en contact et transecte l’échantillon. Placez le spécimen de telle sorte qu’une coupe transversale de l’os soit coupée perpendiculairement à sa longueur.
7. Ajouter des poids de l’autre côté du bras de coupe pour contrer le poids du bras.
   REMARQUE : Si un contrepoids insuffisant est utilisé, l’échantillon peut porter sur la lame et provoquer la fracture de la lame.
8. Ajouter le liquide de coupe (20:1 parties d’eau au fluide de coupe) au réceptacle fluide de la scie.
9. Fixez fermement la lame de gaufrette de diamant et assurez-vous que le niveau de fluide submerge la partie de coupe de la lame. Réglez la vitesse à 200 RPM et abaissez lentement l’échantillon sur la lame (figure 3).
10. Assurez-vous que la lame et le mandrin ne vacillent pas et/ou ne rebondissent pas. Si un mouvement excessif est constaté, arrêtez immédiatement la scie et serrez la lame et/ou le bras de mandrin avant de reprendre la coupe. Ajoutez des contrepoids supplémentaires si le mandrin se déplace agressivement de haut en bas. Un mouvement excessif, y compris un mouvement visible d’un côté à l’autre, peut provoquer la fracture de la lame.
11. La première section épaisse est une « coupe des déchets » pour fournir une surface bien définie parallèle à chaque coupe supplémentaire. Après la coupe initiale des déchets, soulevez le bras pivotant et déplacez le mandrin vers la lame de 5 mm à l’aide du cadran de positionnement. D’autres sections épaisses (~1 mm) pour la microscopie peuvent encore être collectées avec cette méthode.
    REMARQUE : Afin d’économiser des tissus précieux, la coupe des déchets peut être omise. Toutefois, lors de la section d’un échantillon avec un bord inégal, il est essentiel que le pic du spécimen soit aligné tangentiellement jusqu’au bord du foret de carottage.
    1. Assurez-vous de tenir compte de la bordure de la lame lors de la section. Par exemple, pour obtenir une section de 5 mm à partir d’une lame qui a une bordure de 0,5 mm, déplacez l’échantillon et jerez 5,5 mm vers la lame.
12. Une fois la section terminée, placez la glissière de verre avec le spécimen monté sur une plaque chaude pour faire fondre l’époxy thermique. Cela permet d’enlever rapidement les blocs d’os de la lame.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.

3. Carottage d’échantillon

1. Monter des sections osseuses de 5 mm au fond d’une boîte en aluminium peu profonde (~8 cm de diamètre) en utilisant la technique de liaison époxy thermique décrite dans les étapes 2.2-2.4.
2. Placez l’étain sur une table de machine XY de la presse de forage de moulin (voir table des matériaux)et serrez à la main des pinces fixturing (figure 4).
3. Insérez le foret de carottage à bout de diamant de 2 mm de diamètre creux (voir tableau des matériaux)dans le mandrin de forage de l’usine. Ajustez le limiteur de profondeur pour éviter le carottage à travers l’étain( Figure 5).
4. Alignez l’aspect antérieur central de l’échantillon osseux sous le foret tout en évitant tout contact étroit avec le périoste, l’endostée ou les zones fortement trabecularisées.
   REMARQUE : La sélection automatisée des cortices fémoraux mi-antérieurs n’est pas faisable car l’épaisseur corticale varie entre les individus, particulièrement avec l’âge croissant.
5. Remplir l’étain d’eau distillée pour couvrir complètement l’échantillon. Cela empêche l’accumulation de chaleur, la combustion de l’échantillon et/ou les dommages au foret pendant le carottage.
   REMARQUE : Pour évaluer la possibilité de dommages causés par la chaleur causés par le carottage, un thermomètre infrarouge a été utilisé pour obtenir des relevés de température à partir de l’eau distillée, car le morceau de carottage a d’abord pénétré la surface des os. La température variait de 1 °C, de 22,9 à 23,9 °C parmi les dix échantillons prélevés pour cet essai. Ainsi, nous soutenons que les dommages causés par la chaleur sont négligeables.
6. Pour les premiers cas de contact entre le noyau et l’os, appliquez une pression douce afin de porter un anneau sur la surface supérieure de l’os. Cela empêche la déflexion du foret au début du processus de carottage et assure un placement correct du bit.
7. Pendant le carottage, soulevez le foret dans et hors de l’échantillon tout en gardant la pointe du bit sous la surface de l’eau. Poursuivez cette technique toutes les quelques secondes pour éliminer la poussière osseuse emprisonnée et vous assurer que les débris n’occluent pas le foret.
   REMARQUE : Si le noyau forme une forme conique, il est probablement dû à 1) permettant un temps insuffisant pour rincer la poussière d’os du morceau de carottage, et 2) le carottage se produit trop rapidement. Une vitesse accrue peut détacher de gros morceaux de l’échantillon et pulvériser l’aspect supérieur.
8. Une fois le carottage terminé, le noyau osseux qui en résulte peut se loger dans le foret à tige creuse(figure 6). Utilisez une paire de forceps à pointe fine ou une petite clé Allen pour déloger le noyau du bit (Figure 2).
9. Conservez l’échantillon cœuré dans un tube de microcentrifugeuse étiqueté dans un endroit frais et sec jusqu’à l’imagerie.

4. Routines de traitement d’image pour évaluer les paramètres microarchitecturaux d’os des noyaux corticals d’os

1. Reconstruction d’images μCT
   1. Téléchargez et installez la dernière version NRecon https://www.bruker.com/products/microtomography.html pour la reconstruction des images de projection SRμCT.
   2. Sélectionnez le raccourci NRecon sur le bureau et le GPUReconServer associé s’affiche.
   3. Ouvrez l’ensemble de données désiré dans la fenêtre contexturée. Si la fenêtre n’apparaît pas, sélectionnez l’icône du dossier dans le coin supérieur gauche de la fenêtre dataviewer.
   4. Sélectionnez la première projection de l’acquisition de SRμCT. Sous Sortie,supprimer les sélections pour l’utilisation roi et scales ON.
   5. Choisissez la destination du fichier de reconstruction. Sélectionnez Parcourir et créer un nouveau dossier nommé Recon. Le format de fichier sélectionné doit être BMP(8).
   6. Vérifiez l’indemnisation des mauvais alignés.
      REMARQUE : Cette estimation est souvent proche de la correction. Le rendu 3D rugueux peut être ajusté manuellement en déplaçant les flèches de haut en bas pour déplacer les images qui se chevauchent de sorte que les bords droit et gauche s’alignent aussi étroitement que possible.
   7. Sous Paramètres,choisissez les sélections souhaitées pour appliquer le lissage, le durcissement du faisceau, la rotation CS, l’objet plus grand que fov, et les algorithmes d’artefacts d’anneau.
   8. Ajustez l’histogramme sous sortie en sélectionnant Auto.
      REMARQUE : L’image qui en résulte peut être faible.
   9. Sélectionnez Démarrer pour commencer le traitement de la reconstruction.
   10. Utilisez la nomenclature standard pour les indices lacunaires de canal/ostéocyte^28. Il peut s’agir du volume total des tissus VOI (TV), du volume du canal (Ca.V), du nombre total de canaux (Ca.N), du diamètre moyen du canal (Ca.Dm), de la porosité corticale (Ca.V/TV), en pourcentage, du nombre total de lacunaes (N.Lc) et du volume lacunaire moyen (Lc.V), entre autres. Pour déterminer la densité lacunaire par mm³ (N.Lc/BV), le volume osseux (BV) est calculé comme volume total moins volume du canal (TV-Ca.V).
       REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
2. Collecte de données microarchitecturales à partir d’images reconstruites
   1. Téléchargez et installez la dernière version de CTAnalyser https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html pour l’analyse des paramètres microarchitecturaux.
      REMARQUE : La version gratuite de CTAnalyser est limitée en fonctionnalité. Par conséquent, il est recommandé d’acheter une licence complète pour effectuer des analyses plus détaillées.
   2. Sous image | Propriétés | Modifier la taille des pixels,s’assurer que la taille des pixels correspond à celle du protocole d’imagerie μCT appliqué.
      REMARQUE : Si vous modifiez des images d’ImageJ ou d’un programme similaire, notez qu’à l’enregistrement, l’en-tête intégré dans le fichier TIFF sera modifié et le logiciel d’analyse modifiera la taille des pixels lors de l’importation de l’ensemble de données.
   3. Sélectionnez Traitement personnalisé afin de créer une liste de tâches (voir Matériaux supplémentaires) pour analyser la microarchitecture osseuse à partir de l’ensemble de données de balayage. Voici un protocole général pour les paramètres du réseau lacunaire ostéocyte utilisant des plugins propres à CTAnalyser :
      REMARQUE : La liste de tâches plugin fonctionne bien pour les ensembles de données où l’échantillon est le seul sujet visible dans le FOV. Si un espace vide entoure le spécimen, l’application d’un retour sur investissement est nécessaire. Dans le cas contraire, les valeurs rassemblées dans l’analyse 3D et l’analyse individuelle des objets seront artificiellement diminuées.
      1. Rechargez les images pour réinitialiser et/ou ajuster toute modification (par exemple, à partir de l’édition dans ImageJ ou similaire) avant d’ouvrir le menu traitement personnalisé dans le logiciel d’analyse.
      2. Pour réduire le bruit dans les images, appliquez un filtre gaussien à faible passage dans l’espace 3D avec un noyau rond et un rayon de 2-3.
         REMARQUE : Ces paramètres ont été appliqués aux ensembles de données des expériences SRμCT signalées au moyen de tests d’essais et d’erreurs. L’objectif était d’obtenir les meilleures reconstructions de qualité pour les données. Ajustez les paramètres de reconstruction en fonction de chaque configuration expérimentale unique.
      3. Appliquez un seuil global à échelle grise sur les images en sélectionnant des valeurs faibles et élevées pour mettre en évidence les canaux vasculaires. Les tranches reconstruites des figures 8B et 8D représentent un seuil d’exemple de 0 à 155.
         REMARQUE : À l’approche de l’étape 4.2.3.2, les paramètres du seuil appliqués ici ont été choisis au moyen d’essais et d’erreurs importants. Le seuil doit être ajusté pour chaque système expérimental d’installation et d’imagerie μCT utilisé.
      4. Despeckle (denoise) pour enlever les taches blanches dans l’espace 3D qui sont dans le pixel volumétrique (voxel) gamme de taille des lacunae ostéocyte afin d’isoler les canaux seulement.
         REMARQUE : Pour un balayage de SRμCT de l’os cortical humain pris à la taille de pixel de 0.9 μm, la limite inférieure pour le lacunae d’ostéocyte est 13 voxels.
      5. Despeckle pour enlever les taches noires dans l’espace 2D pour enlever les artefacts dans les canaux. Ceux-ci peuvent être assez grands en 2D, ainsi supprimer les fonctionnalités qui sont <15,000 pixels.
      6. Dilater les pores dans l’espace 3D en utilisant la fonction de fonctionnement morphologique avec un noyau rond de 2 ou 3 rayon, selon la qualité des images, afin d’isoler les tissus mous emprisonnés dans les canaux.
      7. Effectuez une fonction Despeckle supplémentaire en utilisant les mêmes paramètres que l’étape 4.2.3.5. afin d’éliminer les tissus mous isolés dans les canaux.
      8. Éroder la dilatation de l’étape 4.2.3.6. à l’aide d’une fonction d’opération morphologique à l’aide d’un noyau rond avec un rayon de 2 ou 3. Le rayon de cette étape doit correspondre au rayon utilisé dans la procédure 4.2.3.6.
      9. Exécutez l’analyse 3D et sélectionnez les paramètres à calculer pour le volume des canaux vasculaires. En général, les valeurs fondamentales fourniront suffisamment d’informations.
      10. Enregistrez les images traitées avec Save Bitmaps dans un sous-ensemble personnalisé dans le répertoire.
          REMARQUE : Si la création d’une image de reconstruction 3D à partir des images traitées à l’aide d’un programme tel qu’Amira/Avizo, Libellule, Drishti, etc., il est recommandé d’enregistrer les images en monochrome (1 bit).
      11. Calculez le nombre de canaux vasculaires et décrivez leur taille, leur forme et leur orientation à l’aide de la fonction d’analyse individuelle des objets.
      12. Répétez les étapes 4.2.3.1 - 4.2.3.3. pour réinitialiser l’image pour l’analyse lacunaire ostéocyte.
      13. Enlevez les taches blanches dans l’espace 3D à l’aide de la fonction Despeckle, en veillant à ce que ces artefacts soient plus petits que la limite inférieure de la taille lacunaire. Cette étape élimine le bruit de l’analyse qui peut sembler être des pores corticals, tout en préservant les lacunes ostéocyte vrai. Pour les scans SRμCT humains de 0,9 μm de taille pixel, cette limite inférieure est de 13 voxels.
      14. Despeckle une fois de plus pour enlever les taches blanches qui sont plus grandes que la limite supérieure de la taille lacunaire. Pour les ensembles de données SRμCT humains avec les paramètres énumérés à l’étape 4.2.3.13, cette limite est de 2743 voxels.
      15. Effectuez une analyse 3D pour extraire des informations microstructurales relatives spécifiquement aux lacunes de l’ostéocyte.
      16. Sélectionnez Enregistrer bitmaps pour enregistrer les images traitées afin d’isoler les lacunes de l’ostéocyte.
      17. Effectuer une analyse individuelle des objets pour calculer le nombre d’ostéocytes en 3D dans le volume d’intérêt sélectionné (VOI).
          REMARQUE : Une fois que la liste de tâches a été établie et testée, CTAnalyser dispose d’une fonction de gestionnaire de lots (BatMan) qui peut être utilisée pour accélérer l’extraction des données et assurer un traitement uniforme de l’image. Une liste de tâches avec des paramètres d’exemple pour la procédure 4.2.3. peuvent être trouvés dans les matériaux supplémentaires.

Résultats

La méthode décrite d’échantillonnage de base s’est avérée très efficace et efficiente. Les échantillons de coring utilisant ce protocole ont permis l’achat d’échantillons de taille constante pour des expériences sur la ligne de faisceau CLS BMIT-BM^2,avec un FOV d’environ 2 mm à 1,49 μm voxel. Pour valider la consistance du diamètre du noyau, trois mesures ont été prises le long de la longueur (en haut, au milieu, en bas) d’un sous-ensemble de noyaux fémoraux antérieurs humains(n=69). Le d...

Discussion

Il n’y a pas eu de protocole complet et normalisé pour l’achat d’échantillons de carottes corticales uniformes et cylindriques pour l’imagerie SRμCT haute résolution avec des configurations FOV limitées. Le protocole détaillé ici comble ce vide en fournissant un tutoriel complet sur la façon de se procurer des échantillons de carottes osseuses corticales de taille constante pour l’imagerie SRμCT et la visualisation et l’extraction précises subséquentes des données microarchitecturales. Nous avons montré que notre protoco...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Carbure de coupe plongeant 1-1/8" pour composites	Warrior	61812	28,6 mm plongée
70 % éthanol	Fisher Scientific	BP8201500	3,8 litres
Pince à pointe arrondie	Fisher Scientific	10-300
Tubes à centrifuger	ThermoFisher	55398
Crystalbond 509-3 Epoxy	Ted Pella	821-3
CTAnalyser	Bruker microCT	v.1.15.4.0	Téléchargez et installez chez https://www.bruker.com/products/microtomography/micro-ct-software/3dsuite.html
Kit d’outils dentaires	Amazon	787269885110
Lame de scie à gaufrette diamantée pour matériau composite	Buehler	#11-4247
Perceuse à	colonne Broyeur à jet/Perceuse	350017	Modèle : JMD-15, les perceuses à colonne d’établi sont des substituts appropriés, mais manquent généralement d’une table de machine traduisible pour positionner les échantillons sous la tige de forage
Pince à pointe fine	Fisher Scientific	22-327379
Pinces de fixation pour table de machine XY pour fraiseuse/perceuse	MSC Industrial Supply	#04804571
Lames de microscope en verre	Ted Pella	26005	Lames de 75x50mm, épaisseur 1mm
Mandrin coulissant en verre	Buehler	#112488	Assez grand pour contenir des diapositives en verre de 75x50mm
Plaque chauffante capable d’atteindre 140 ° ; C	ThermoScientific	HP88850105
Incubateur	NAPCO	Modèle 4200
Isocut Fluid	Buehler	111193032	Lubrifiant ; 30mL
Foret de carottage diamanté de bijoutier	Otto Frei	#119.050	2mm de diamètre intérieur Trépan à tige creuse
NRecon	Bruker microCT	v.1.6.10.2	Téléchargez et installez chez https://www.bruker.com/products/microtomography.html
Scie oscillante	Harbor Freight	62866
Plats en verre allant au four	Pyrex	1117715	Récipient de conservation des aliments
en verre Scie de précision à vitesse lente (Isomet 1000)	Buehler	111280160
Lames de rasoir	Amazon	25181
Boîtes en aluminium peu profondes	Amazon	B01MRWLD0R	~8cm de diamètre
Gobelets	à échantillons Amazon	616784425436 885334344729
Tergazyme détergent	Alconox	1304-1	1,8kg boîte
Nettoyeur à ultrasons	MTI Corporation	KJ201508006