Présenté ici est un protocole qui décrit la surveillance du cycle de vie complet de la bactérie prédatrice Bdellovibrio bactériovorus en utilisant la microscopie de fluorescence time-lapse en combinaison avec un tampon agarose et des plats d’imagerie cellulaire.
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Article de méthode
Imagerie à cellules vivantes du cycle de vie du prédateur bactérien Bdellovibrio bactériovore à l’aide de la microscopie par fluorescence time-lapse
Dans cet article
Résumé
Résumé
Bdellovibrio bactériovorus est une petite bactérie prédatrice gramme-négative et obligatoire qui tue d’autres bactéries gramnégatives, y compris les pathogènes nocifs. Par conséquent, il est considéré comme un antibiotique vivant. Pour appliquer B. bactériovorus comme antibiotique vivant, il est d’abord nécessaire de comprendre les grandes étapes de son cycle de vie complexe, en particulier sa prolifération à l’intérieur des proies. Jusqu’à présent, il a été difficile de surveiller les étapes successives du cycle de vie prédateur en temps réel. Présenté ici est un protocole complet pour l’imagerie en temps réel du cycle de vie complet de B. bactériovorus, en particulier lors de sa croissance à l’intérieur de l’hôte. À cette fin, un système composé d’un tampon d’agarose est utilisé en combinaison avec des plats d’imagerie cellulaire, dans lequel les cellules prédatrices peuvent se déplacer librement sous le tampon agarose tandis que les cellules de proies immobilisées sont capables de former des bdelloplastes. L’application d’une souche produisant une sous-unité β-marquée fluorescente de la polymérase III permet de surveiller davantage la réplication chromosomique pendant la phase de reproduction du cycle de vie de B. bacteriovorus.
Introduction
Bdellovibrio bactériovorus est une petite bactérie gram-négative (0,3–0,5 μm par 0,5–1,4 μm) qui s’attaque à d’autres bactéries gramnégatives, y compris les pathogènes nocifs tels que Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa et Shigella flexneri1,2,3. Étant donné que B. bactériovorus tue les agents pathogènes, il est considéré comme un antibiotique vivant potentiel qui peut être appliqué pour lutter contre les infections bactériennes, en particulier celles causées par des souches multirésistantes.
B. bactériovorus présente un cycle de vie particulier composé de deux phases : une phase d’attaque non réplicative à vie libre et une phase de reproduction intracellulaire (figure 1). Dans la phase de libre-vie, cette bactérie très motile, qui se déplace à des vitesses allant jusqu’à 160 μm/s, recherche sa proie. Après s’être attaché à la membrane externe de la proie, il pénètre dans le périplasme4,5. Pendant la phase de reproduction interpériplasmique, B. bactériovorus utilise une pléthore d’enzymes hydrolytiques pour dégrader les macromolécules de l’hôte et les réutiliser pour sa propre croissance. Peu de temps après avoir envahi le périplasme, la cellule hôte meurt et gonfle dans une structure sphérique appelée bdelloplaste, à l’intérieur de laquelle la cellule prédatrice s’allonge et reproduit ses chromosomes. Le processus de réplication commence à l’origine de réplication (oriC)6 et procède jusqu’à ce que plusieurs copies du chromosome ont été entièrement synthétisés7. Fait intéressant, la réplication de chaque chromosome n’est pas suivie d’une division cellulaire. Au lieu de cela, le prédateur s’allonge pour former une cellule longue, multinucléoïde et filamenteuse. Lors de l’épuisement des nutriments, le filament subit une septation synchrone et les cellules de descendance sont libérées du bdelloplaste8.
Avant que B. bacteriovorus puisse être utilisé comme antibiotique vivant contre les infections bactériennes, il est crucial de comprendre les principales étapes de son cycle de vie, en particulier celles liées à sa prolifération à l’intérieur de la proie. L’imagerie à cellules vivantes de B. bactériovorus a été difficile, en raison des diverses formes morphologiques du prédateur et de ses proies au cours du cycle de vie complexe. Jusqu’à présent, les interactions entre B. bactériovorus et sa cellule hôte ont été principalement étudiées par microscopie électronique et analyse snap-shot2,9,10, qui ont tous deux des limitations, surtout quand ils sont utilisés pour surveiller les étapes successives du cycle de vie prédateur.9 Ces méthodes fournissent des images à haute résolution des cellules B. bactériovorus et permettent l’observation d’un petit prédateur pendant la phase d’attaque ou de croissance. Cependant, ils ne permettent pas le suivi des cellules B. bactériovorus uniques tout au long des deux phases du cycle de vie.
Présenté ici est un protocole complet pour l’utilisation de la microscopie de fluorescence time-lapse (TLFM) pour surveiller le cycle de vie complet de B. bacteriovorus. Un système composé d’un tampon d’agarose est utilisé en combinaison avec un plat d’imagerie cellulaire, dans lequel les cellules prédatrices peuvent se déplacer librement sous le tampon agarose tandis que les cellules de proies immobilisées sont capables de former des bdelloplastes (Figure 2). Cette configuration est préparée à partir de souches spécifiques de E. coli et de B. bacteriovorus, mais le protocole peut être facilement modifié pour s’adapter aux souches individuelles d’un utilisateur (p. ex., portant différents marqueurs de sélection, protéines fusionnées avec différents fluorophores, etc.).
Dans ce cas, pour visualiser B. bactériovorus pendant la phase d’attaque, une souche spécifique (HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) a été construite qui exprime une version fluorescente de la protéine cytoplasmique, PilZ (disponible dans notre laboratoire sur demande)7. Cette souche produit en outre DnaN (la pince β-coulissante), une sous-unité d’ADN polymérase III holoenzyme, fusionnée avec une protéine fluorescente. Cela permet de surveiller la réplication continue de l’ADN à l’intérieur des cellules prédatrices au fur et à mesure qu’elles se développent dans les bdelloplastes.
Bien que le protocole et le logiciel décrits utilisés pour l’acquisition d’images se réfèrent à un microscope inversé fourni par un fabricant spécifique (voir tableau des matériaux),cette technique peut être ajustée pour tout microscope inversé équipé d’une chambre environnementale ou d’un autre support de chauffage externe et capable d’imagerie en time-lapse. Pour l’analyse des données, les utilisateurs peuvent choisir n’importe quel logiciel disponible compatible avec les formats de sortie individuels.
Figure 1 : Cycle de vie B. bactériovorus chez E. coli en tant que cellule hôte. Pendant la phase d’attaque, une cellule B. bactériovorus nage libre recherche et s’attache à une cellule hôte de E. coli. Après l’invasion, la cellule prédatrice devient localisée dans le périplasme de la proie, changeant la forme de la cellule hôte et formant un bdelloplaste. La phase de reproduction commence par la formation de bdelloplaste. La cellule prédatrice digère la cellule proie et réutilise des composés simples pour construire ses propres structures. B. bactériovorus se développe comme un long filament unique à l’intérieur du périplasme de l’hôte. Lorsque les ressources de la cellule proie sont épuisées, le filament de B. bactériovorus se produit de façon synchrone et forme des cellules de descendance. Après que les cellules de descendance développent leur flagelle, elles lysent le bdelloplast. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Protocole
1. Préparation du lysate de B. bactériovorus pour l’analyse microscopique
- Dans une fiole de 250 mL, mettre en place la coculture en combinant 1 ml de 24 h B. bactériovorus culture (par exemple, HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) et 3 ml de culture de proies du jour au lendemain (p. ex., E. coli S17-1 pZMR100) avec 50 mL de tampon Ca-HEPES (25 mM HEPES, 2 mM CaCl2 [pH = 7,6]) complété par des antibiotiques au besoin (ici, 50 μg/mL kanamycine).
- Incuber la coculture pendant 24 h à 30 °C avec des secousses à 200 tr/min.
- Vérifiez que les cellules de proie sont entièrement lysées par microscopie à contraste de phase monté sur le liquide. À ce stade, de nombreuses cellules de phase d’attaque motile B. bactériovorus devraient être présentes, et aucune cellule E. coli ou bdelloplaste ne doit être visible.
- Filtrer la culture B. bacteriovorus à travers un filtre de 0,45 μm de taille de pore pour enlever les cellules hôtes restantes. Les cellules prédatrices (0,3–0,5 μm x 0,5–1,4 μm) pénètrent librement 0,45 μm pores, tandis que les cellules hôtes sont conservées sur la surface du filtre.
- Faire tourner le filtrate pendant 20 min à 2469 x g et 30 °C dans un tube conique de 50 ml pour recueillir les cellules prédatrices. Resuspendez le granulé B. bactériovorus en 3 mL de tampon Ca-HEPES (à un ODfinal 600 d’environ 0,2) et incuber à 30 °C et 200 tr/min pendant 30 min.
2. Préparation des cellules hôtes pour l’invasion de B. bactériovorus
- Utiliser une seule colonie de la souche hôte(E. coli S17-1 pZMR100 est recommandé en raison de diverses tailles de cellules ayant pour résultat la formation de bdelloplastes de taille inégale) pour inoculer 10 mL de milieu YT (0,8% d’tryptone de Bacto, Extrait de levure de 0,5 %, 0,5 % de NaCl [pH = 7,5]) qui a été complété par des antibiotiques, si nécessaire (ici, 50 μg/mL kanamycine). Cellules de culture du jour au lendemain à 37 °C et 180 tr/min.
- Transférer 2 ml de culture E. coli (OD600 d’environ 3,0) dans un tube à essai et une centrifugeuse de 2 mL à température ambiante (RT) et 2469 x g pendant 5 min. Resuspendez le granulé dans 200 μL de tampon Ca-HEPES.
3. Mise en place du microscope (voir tableau des matériaux)
- Préchauffer une chambre microscopique avec un objectif d’immersion en huile 100x à 30 °C pendant au moins 1 h avant utilisation. Cette étape est nécessaire pour éviter les erreurs dans le maintien de la mise au point pendant l’expérience.
- Allumez à la fois l’automatisation du microscope et de la microscopie. Initialisez le logiciel de contrôle et sélectionnez les filtres appropriés pour acquérir des images brightfield/DIC/phase-contraste et fluorescence, au besoin (ici : images BF, filtre polychromique GFP/mCherry, et émission/excitation pour mCherry et GFP).
4. Assemblage de dispositions pour la microscopie de fluorescence en time-lapse
- Mélanger 200 mg d’agarose de faible qualité moléculaire fluorescente avec 20 mL de tampon Ca-HEPES (concentration finale d’agarose de 1%) et dissoudre l’agarose dans un micro-ondes. Le lot peut être réutilisé plusieurs fois après qu’il se solidifie, alors il suffit de répéter l’étape de chauffage.
- Verser 3 mL d’agarose fondue dans un plat à fond de verre de 35 mm(Table des matériaux). Laissez l’agarose se solidifier.
- À l’aide d’une micro-spatule de laboratoire, retirez soigneusement le tampon d’agarose du plat de 35 mm sans perturber le poteau central du tampon d’agarose. Retournez le côté inférieur du pad vers le haut et placez-le dans une couverture de plat Petri (Figure 2).
- Placez 5 μL de suspension concentrée e. coli sur le dessus du tampon retourné et répandez les cellules dans le poteau central à l’aide d’une boucle d’inoculation. Ajouter 5 μL de suspension concentrée de B. bactériovorus (OD600 d'~0,2) sur la surface enduite d’E. coli. Ne propagez pas les cellules.
- Remettre rapidement le gel agarose dans le plat à fond de verre de 35 mm (côté supérieur orienté vers le bas), puis couvrir d’un couvercle. Si nécessaire, retirer les bulles d’air en appuyant doucement sur l’agar contre la plaque.
Figure 2 : Représentation schématique du flux de travail expérimental. Le tampon d’agarose est retiré du plat de 35 mm et retourné de sorte que le côté inférieur fait face vers le haut. Des suspensions fraîches de cellules prédatrices et la culture du jour au lendemain des cellules proies sont placées sur le coussinet retourné pour enrober le côté « bas ». Le tampon agarose est ensuite retourné à son orientation d’origine et remis dans le plat de 35 mm, qui est monté sur le stade de microscope inversé dans la chambre de microscope. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
5. Conduction de la microscopie de fluorescence en time-lapse
- Placez le plat de 35 mm dans le porte-vaisselle Petri de sorte qu’il ne se déplacera pas au cours de l’expérience. Placez une goutte d’huile d’immersion (1.518 indice de réfraction) sur l’objectif ainsi que sur le fond du plat de 35 mm.
- Monter le support sur la scène du microscope inversé dans la chambre de microscope.
- Définissez les options du logiciel de contrôle du microscope pour collecter plusieurs images à plusieurs positions au fil du temps.
- Réglez le grossissement (100x) et l’objectif polychromique (GFP/mCherry). À l’aide d’un eye piece et brightfield (BF), trouver le plan focal et ouvrir le gestionnaire de liste de points.
- Sélectionnez au moins 10 positions d’intérêt en déplaçant la scène et en stockant les coordonnées de chaque position du logiciel microscope en cliquant sur le bouton Point de marque. Évitez les positions situées à proximité les unes des autres pour éviter le photobleaching et la phototoxicité. Tournez la valve de la caméra de l’oculaire au moniteur et calibrez chaque point en définissant le plan focal et en cliquant sur le bouton Remplacer le point dans le gestionnaire de liste de points.
- Ouvrez le concepteur d’expériences et définissez tous les paramètres expérimentaux de chaque onglet comme suit :
- Dét marquer la boîte d’empilage Z.
- Choisissez des canaux fluorescents et définissez les paramètres d’éclairage optimaux. Ici, les paramètres suivants ont été utilisés : pour le canal mCherry, les ensembles de filtres mCherry (EX575/25; EM625/45), 50% d’intensité et 200 ms temps d’exposition; pour le canal GFP, ensemble de filtres GFP (EX475/28; EM525/48), 50% d’intensité et 80 ms; et pour les images BF, canal POL, 5% d’intensité, et 50 ms.
- Sélectionnez des intervalles entre l’acquisition d’images et le temps total de l’expérience. Ici, 5 intervalles de min ont été effectués au cours de la période de 10 h de l’expérience.
- Activez la maintenance de mise au point pour les positions choisies (pour le système utilisé ici, en marquant la case à cocher Maintenir le focus avec UltimateFocus).
- Sélectionnez le dossier de données dans lequel les fichiers d’image doivent être automatiquement enregistrés.
- Revérifier tous les paramètres du contrôle logiciel microscope, puis commencer l’expérience time-lapse.
- Après la première heure de l’expérience, vérifiez que toutes les positions de l’étape sont toujours au point. Ajustez la mise au point pendant les intervalles de temps entre l’acquisition d’image, si nécessaire.
- Lorsque l’expérience time-lapse est terminée, retirez le plat Petri et utilisez le plat de 35 mm avec un tampon agarose selon le protocole de biosécurité.
REMARQUE : Tous les sous-étapes après l’étape 5.2 sont spécifiques pour les utilisateurs de DeltaVision Elite. Les chercheurs qui utilisent d’autres systèmes doivent ajuster les paramètres en fonction de systèmes individuels.
6. Traitement des images en time-lapse et génération de films à l’aide du logiciel Fidji
- Transférer des données expérimentales sur un ordinateur chargé du logiciel Fidji. Lancer le programme Fidji et ouvrir une image à l’aide de File | Ouvrez ou en faisant simplement glisser et déposer le fichier d’image dans Fidji.
- Dans Les options d’importation de bio-formats, choisissez Afficher la pile avec Hyperstack dans les options d’affichage de la pile, cliquez sur le mode couleur composite dans les options de couleur et marquez l’échelle automatique.
- En faisant défiler les piles d’images, évaluez si les cellules et les bdelloplastes sont restés au point au cours de l’expérience. Vérifiez si des taches fluorescentes vertes de DnaN-mNeonGreen sont présentes dans les cellules B. bacteriovorus à l’intérieur des bdelloplastes tout au long de la phase de croissance, et assurez-vous que toutes les étapes du cycle de vie prédateur peuvent être visualisées.
- Pour analyser une cellule B. bacteriovorus/bdelloplast, marquez-la à l’aide des outils de sélection dans le menu Fidji (Rectangle, Ovale, Polygone ou Freehand). Dupliquer la région choisie à l’aide d’Image | Dupliquer ou à l’aide de Ctrl + Maj + D.
- Ajuster la luminosité et le contraste de chaque canal de fluorescence comme suit :
- Pour choisir un seul canal, ouvrez les outils Canal en cliquant sur Image | Couleur | Canaux outils ou Ctrl + Maj + Z, et sélectionnez le canal d’intérêt (Canal 1: mCherry, Channel 2: mNeonGreen, Channel 3: brightfield).
- Ajuster la luminosité et le contraste des images dans le canal de fluorescence en ouvrant le menu B&C dans Image | Ajuster | Luminosité/Contraste ou en cliquant sur Ctrl + Maj + C.
- Ajouter une barre d’échelle à l’aide d’Analyze | Outils | Barre d’échelle. Ajoutez l’horodatage aux images en cliquant sur Images | Piles | Horodatage .
- Pour enregistrer des images modifiées, accédez à Fichier | Enregistrer Comme et choisir TIFF pour enregistrer comme une séquence d’image, AVI pour produire un film, ou PNG pour enregistrer une seule image de l’image actuelle.
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Résultats
Le système décrit basé sur le TLFM permet de suivre les cellules individuelles de B. bactériovorus dans le temps (Figure 3, Movie 1) et fournit des informations précieuses sur chaque étape du cycle de vie prédateur complexe. La fusion PilZ-mCherry permet d’étiqueter l’ensemble de la cellule prédatrice en phase d’attaque ainsi qu’au début de la phase de croissance (figure 3). La transition de la phase d’attaque à la phase réplicative a é...
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Discussion
En raison de l’intérêt accru pour l’utilisation de B. bactériovorus comme antibiotique vivant, de nouveaux outils pour observer le cycle de vie prédateur, en particulier les interactions prédateur-pathogène, sont nécessaires. Le protocole présenté est utilisé pour suivre l’ensemble du cycle de vie de B. bacteriovorus, en particulier lors de sa croissance à l’intérieur de l’hôte, en temps réel. En outre, l’application d’une souche produisant une pince bêta fluorescente de l’ADN polymérase III holoenzyme ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Cette étude a été soutenue par la subvention opus 2018/29/B/NZ6/00539 du Centre national des sciences à J.Z.C.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Centrifugeuse | MPW MED. INSTRUMENTS | MPW-260R | Rotor ref. 12183 |
| CertifiéBiologie moléculaire Agarose | BIO-RAD | 161-3100 | agarose à faible fluorescence pour tampon |
| d’agarose Fiji | ImageJ | https://imagej.net/Fiji | Package de traitement d’images open source |
| Plat à fond en verre 35 mm | ibidi | 81218-200 | verre |
| non revêtuMicroscope | GE | DeltaVision Elite | Microtiter Stage, module laser à mise au point ultime, DV Elite CoolSnap HQ2 Caméra, montage SSI FP DV, KIT OBJ. Oly 100x huile 1.4 NA, prisme Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V |
| Minisart Filter 0.45 µ ; m | Sartorius | 16555----------K | Acétate de cellulose, stérile, Luer Lock Outlet |
| Start SoftWoRx | GE | Logiciel d’imagerie fourni par le fabricant |
Références
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Réimpressions et autorisations
