Imagerie à cellules vivantes du cycle de vie du prédateur bactérien Bdellovibrio bactériovore à l’aide de la microscopie par fluorescence time-lapse

Résumé

Présenté ici est un protocole qui décrit la surveillance du cycle de vie complet de la bactérie prédatrice Bdellovibrio bactériovorus en utilisant la microscopie de fluorescence time-lapse en combinaison avec un tampon agarose et des plats d’imagerie cellulaire.

Résumé

Bdellovibrio bactériovorus est une petite bactérie prédatrice gramme-négative et obligatoire qui tue d’autres bactéries gramnégatives, y compris les pathogènes nocifs. Par conséquent, il est considéré comme un antibiotique vivant. Pour appliquer B. bactériovorus comme antibiotique vivant, il est d’abord nécessaire de comprendre les grandes étapes de son cycle de vie complexe, en particulier sa prolifération à l’intérieur des proies. Jusqu’à présent, il a été difficile de surveiller les étapes successives du cycle de vie prédateur en temps réel. Présenté ici est un protocole complet pour l’imagerie en temps réel du cycle de vie complet de B. bactériovorus, en particulier lors de sa croissance à l’intérieur de l’hôte. À cette fin, un système composé d’un tampon d’agarose est utilisé en combinaison avec des plats d’imagerie cellulaire, dans lequel les cellules prédatrices peuvent se déplacer librement sous le tampon agarose tandis que les cellules de proies immobilisées sont capables de former des bdelloplastes. L’application d’une souche produisant une sous-unité β-marquée fluorescente de la polymérase III permet de surveiller davantage la réplication chromosomique pendant la phase de reproduction du cycle de vie de B. bacteriovorus.

Introduction

Bdellovibrio bactériovorus est une petite bactérie gram-négative (0,3–0,5 μm par 0,5–1,4 μm) qui s’attaque à d’autres bactéries gramnégatives, y compris les pathogènes nocifs tels que Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa et Shigella flexneri^1,2,3. Étant donné que B. bactériovorus tue les agents pathogènes, il est considéré comme un antibiotique vivant potentiel qui peut être appliqué pour lutter contre les infections bactériennes, en particulier celles causées par des souches multirésistantes.

B. bac....

Protocole

1. Préparation du lysate de B. bactériovorus pour l’analyse microscopique

1. Dans une fiole de 250 mL, mettre en place la coculture en combinant 1 ml de 24 h B. bactériovorus culture (par exemple, HD100 DnaN-mNeonGreen/PilZ-mCherry) et 3 ml de culture de proies du jour au lendemain (p. ex., E. coli S17-1 pZMR100) avec 50 mL de tampon Ca-HEPES (25 mM HEPES, 2 mM CaCl₂ [pH = 7,6]) complété par des antibiotiques au besoin (ici, 50 μg/mL kanamycine).
2. Incuber la coculture pendant 24 h à 30 °C avec des secousses à 200 tr/min.
3. Vérifiez que les cellules de proie sont entièrement lysées par microscopie à contrast....

Résultats

Le système décrit basé sur le TLFM permet de suivre les cellules individuelles de B. bactériovorus dans le temps (Figure 3, Movie 1) et fournit des informations précieuses sur chaque étape du cycle de vie prédateur complexe. La fusion PilZ-mCherry permet d’étiqueter l’ensemble de la cellule prédatrice en phase d’attaque ainsi qu’au début de la phase de croissance (figure 3). La transition de la phase d’attaque à la phase réplicative a é.......

Discussion

En raison de l’intérêt accru pour l’utilisation de B. bactériovorus comme antibiotique vivant, de nouveaux outils pour observer le cycle de vie prédateur, en particulier les interactions prédateur-pathogène, sont nécessaires. Le protocole présenté est utilisé pour suivre l’ensemble du cycle de vie de B. bacteriovorus, en particulier lors de sa croissance à l’intérieur de l’hôte, en temps réel. En outre, l’application d’une souche produisant une pince bêta fluorescente de l’ADN polymérase III holoenzyme .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Centrifugeuse	MPW MED. INSTRUMENTS	MPW-260R	Rotor ref. 12183
CertifiéBiologie moléculaire Agarose	BIO-RAD	161-3100	agarose à faible fluorescence pour tampon
d’agarose Fiji	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	Package de traitement d’images open source
Plat à fond en verre 35 mm	ibidi	81218-200	verre
non revêtuMicroscope	GE	DeltaVision Elite	Microtiter Stage, module laser à mise au point ultime, DV Elite CoolSnap HQ2 Caméra, montage SSI FP DV, KIT OBJ. Oly 100x huile 1.4 NA, prisme Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
Minisart Filter 0.45 µ ; m	Sartorius	16555----------K	Acétate de cellulose, stérile, Luer Lock Outlet
Start SoftWoRx	GE		Logiciel d’imagerie fourni par le fabricant