Article de méthode

Évaluation du stress oxydatif dans des échantillons biologiques à l’aide du test des substances réactives de l’acide thiobarbiturique

DOI :

10.3791/61122

⸱

12 mai 2020

 , 
1School of Molecular Sciences, The Biodesign Institute - Center for Personalized Diagnostics, Arizona State University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’objectif du test des substances réactives à l’acide thiobarbiturique est d’évaluer le stress oxydatif dans des échantillons biologiques en mesurant la production de produits de peroxydation lipidique, principalement du malondialdéhyde, en utilisant la spectrophotométrie de longueur d’onde visible à 532 nm. La méthode décrite ici peut être appliquée au sérum humain, aux lysats cellulaires et aux lipoprotéines de basse densité.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malgré sa spécificité analytique et sa robustesse limitées, le dosage des substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS) a été largement utilisé comme mesure générique de la peroxydation lipidique dans les fluides biologiques. Il est souvent considéré comme un bon indicateur des niveaux de stress oxydatif dans un échantillon biologique, à condition que l’échantillon ait été correctement manipulé et stocké. Le test implique la réaction de produits de peroxydation lipidique, principalement le malondialdéhyde (MDA), avec l’acide thiobarbiturique (TBA), ce qui conduit à la formation d’adduits MDA-TBA2 appelés TBARS. TBARS donne une couleur rouge-rose qui peut être mesurée spectrophotométriquement à 532 nm. Le test TBARS est effectué dans des conditions acides (pH = 4) et à 95 °C. Le MDA pur est instable, mais ces conditions permettent la libération de MDA à partir du MDA bis(diméthylacétal), qui est utilisé comme norme analytique dans cette méthode. Le test TBARS est une méthode simple qui peut être complétée en environ 2 h. La préparation des réactifs d’essai est décrite en détail ici. Les chercheurs soucieux de leur budget peuvent utiliser ces réactifs pour plusieurs expériences à faible coût plutôt que d’acheter un kit de test TBARS coûteux qui ne permet la construction que d’une seule courbe standard (et ne peut donc être utilisé que pour une seule expérience). L’applicabilité de ce test TBARS est démontrée dans le sérum humain, les lipoprotéines de basse densité et les lysats cellulaires. Le test est cohérent et reproductible, et des limites de détection de 1,1 μM peuvent être atteintes. Des recommandations pour l’utilisation et l’interprétation du test spectrophotométrique TBARS sont fournies.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La peroxydation lipidique est un processus dans lequel les radicaux libres, tels que les espèces réactives de l’oxygène et les espèces réactives de l’azote, attaquent les doubles liaisons carbone-carbone dans les lipides, un processus qui implique l’extraction d’un hydrogène à partir d’un carbone et l’insertion d’une molécule d’oxygène. Ce processus conduit à un mélange de produits complexes, y compris les radicaux peroxyles lipidiques et les hydroperoxydes comme produits primaires, ainsi que le malondialdéhyde (MDA) et le 4-hydroxynonénal comme produits secondaires prédominants1.

Le MDA a été largement utilisé dans la recherche biomédicale comme marqueur de la peroxydation lipidique en raison de sa réaction facile avec l’acide thiobarbiturique (TBA). La réaction conduit à la formation de MDA-TBA2, un conjugué qui absorbe dans le spectre visible à 532 nm et produit une couleur rouge-rose2. D’autres molécules dérivées de la peroxydation lipidique en plus du MDA peuvent également réagir avec le TBA et absorber la lumière à 532 nm, contribuant ainsi au signal d’absorption global mesuré. De même, la MDA peut réagir avec la plupart des autres grandes classes de biomolécules, ce qui pourrait limiter son accessibilité à la réaction avec TBA3,4. En tant que tel, ce test traditionnel est simplement considéré comme mesurant les « substances réactives de l’acide thiobarbiturique » ou TBARS5.

Lorsqu’il est correctement appliqué et interprété, le test TBARS est généralement considéré comme un bon indicateur des niveaux globaux de stress oxydatif dans un échantillon biologique6. Malheureusement, comme l’ont documenté Khoubnasabjafari et d’autres, le test TBARS est souvent mené et interprété de manière à faciliter les conclusions douteuses3,4,7,8,9,10,11. Les causes en sont principalement enracinées dans les variables pré-analytiques liées à l’échantillon et un manque de robustesse du test qui interdit des variations apparemment mineures dans le protocole d’essai sans changements substantiels dans les résultats du test1,7,12,13.

Les variables préanalytiques liées à la manipulation et au stockage des échantillons biologiques (p. ex., plasma sanguin conservé temporairement à -20 °C)14,15 peuvent avoir un impact majeur sur les résultats des essais TBARS16,17; à tel point que les résultats des tests TBARS ne devraient pas être comparés entre différents laboratoires à moins que des données explicites de validation analytique interlaboratoire ne le justifient. Cette recommandation s’apparente à la façon dont les transferts de Western sont couramment utilisés et interprétés. Les comparaisons des densités de bande sont valables pour les études à l’intérieur du transfert et peut-être à l’intérieur du laboratoire, mais la comparaison des densités de bande entre laboratoires est généralement considérée comme une pratique invalide.

Certains chercheurs ont suggéré que la MDA telle que mesurée par le test TBARS ne répond tout simplement pas aux critères analytiques ou cliniques requis pour un biomarqueur acceptable3,9,10,18,19. En effet, si le test n’avait pas été développé il y a plus de 50 ans, il n’aurait probablement pas acquis l’utilisation généralisée et l’acceptabilité tacite qu’il a aujourd’hui. Bien qu’il existe d’autres tests avec une sensibilité analytique, une spécificité et une robustesse plus élevées utilisés pour déterminer le stress oxydatif, le test TBARS basé sur l’absorbance à 532 nm reste de loin l’un des tests les plus couramment utilisés pour la détermination de la peroxydation lipidique20, et donc l’évaluation du stress oxydatif.

Le test TBARS ne peut être trouvé que sous la forme d’un kit coûteux (plus de 400 dollars américains), dans lequel les instructions ne fournissent pas d’informations détaillées sur la plupart des concentrations des réactifs utilisés. De plus, les réactifs fournis ne peuvent être utilisés que pour une seule expérience, car une seule courbe standard colorimétrique peut être réalisée par kit. Cela peut être problématique pour les chercheurs qui ont l’intention de déterminer les niveaux d’oxydation dans quelques échantillons à différents moments, car la même courbe standard ne peut pas être utilisée à plusieurs reprises. Par conséquent, plusieurs kits doivent être achetés pour plusieurs expériences. Actuellement, à moins qu’un kit coûteux ne soit acheté, il n’existe pas de protocole détaillé sur la façon d’effectuer un test TBARS. Certains chercheurs dans le passé ont vaguement décrit comment effectuer un test TBARS21,22, mais ni un protocole entièrement détaillé ni une vidéo complète sur la façon de mener le test TBARS sans un kit coûteux n’est disponible dans la littérature.

Nous rapportons ici une méthodologie détaillée, validée analytiquement et à cet effet sur la façon d’effectuer un test TBARS de manière simple, reproductible et peu coûteuse. Les changements dans la peroxydation lipidique du sérum humain, des lysats d’HepG2 et des lipoprotéines de basse densité lors du traitement par des ions Cu(II) sont démontrés à titre d’applications illustratives pour le test TBARS. Les résultats démontrent que ce test TBARS est cohérent et reproductible au quotidien.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des échantillons de sérum humain ont été obtenus auprès de volontaires consentants sous l’approbation de la CISR et conformément aux principes exprimés dans la Déclaration d’Helsinki. Les échantillons ont été codés et anonymisés avant d’être transférés au laboratoire d’analyse.

1. Préparation de l’échantillon

  1. Lysats de cellules HepG2
    1. Ensemencez environ 10 x 106 cellules HepG2 par fiole dans 16 fioles T75 avec 14 mL de milieu EMEM complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et cultivez des cellules pendant 2 jours.
    2. Préparer le tampon RIPA : dans un tube de 50 mL, ajouter 1,5 mL de 5 M NaCl, 2,5 mL de 1 M Tris-HCl (pH = 7), 500 μL de réactif NP-40, puis porter le volume final à 50 mL avec de l’eau DI.
    3. Préparer le tampon de lyse : aliquote 20 mL de tampon RIPA dans un tube de 50 mL et ajouter 200 μL d’une solution inhibitrice de protéase 100x pour inhiber la dégradation des protéines et des lipides. Conserver à 4 °C.
      REMARQUE: Le tampon de lyse est compatible avec les réactifs TBARS et n’interfère pas avec l’absorbance à 532 nm. Si vous envisagez d’utiliser un tampon de lyse différent ou d’ajouter des ingrédients supplémentaires au tampon de lyse, des études de validation préliminaires doivent être effectuées pour vérifier que les composants du tampon de lyse sont compatibles avec le test TBARS.
    4. Retirer les supports contenant 10% de FBS et laver les cellules 2x avec 5 mL de PBS froid et stérile.
    5. Ajouter 1 mL de tampon de lyse aux flacons T75 contenant les cellules et les incuber pendant 10 min à température ambiante (RT) avec un tourbillon constant pour s’assurer que le tampon est bien réparti.
    6. Recueillir les lysats dans des tubes en polypropylène de 2 mL à capuchon encliquetage correctement étiquetés et incuber sur de la glace pendant 10 min.
    7. Faire tourner les lysats à 5 000 x g pendant 10 min à TA pour recueillir les débris cellulaires et aspirer les surnageants dans un seul tube de 15 mL.
    8. Concentrer le lysat de cellules surnageant quatre fois à l’aide d’un Speed Vac à 50 °C et 3 mbar et fabriquer des aliquotes de 94 μL chacune dans des tubes en polypropylène à capuchon encliquetable de 2 mL. Conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient utilisés pour l’oxydation in vitro et/ou le dosage TBARS.
      REMARQUE: Pour éviter de concentrer le surnageant de lysat cellulaire, les cellules peuvent également être détachées à l’aide de 3 mL de 1x trypsine, neutralisées avec 6 mL de milieu et lavées 2x avec 5 mL de PBS froid. Les pastilles cellulaires peuvent ensuite être reconstituées dans 250 μL de tampon de lyse, et les étapes 1.1.6 et 1.1.7 peuvent ensuite être effectuées.
    9. Préparer une solution mère de CuCl2 de 35 mM dans de l’acide acétique (pH = 4).
      1. Préparer une solution d’acide acétique (pH = 4) : Diluer 1 μL d’acide acétique glacial dans 100 mL d’eau DI (le pH doit être d’environ 4 mais confirmez cela avec un pH-mètre). Ajouter plus d’eau ou d’acide acétique pour ajuster le pH à 4.
      2. Pondérer environ 0,1936 g de chlorure de cuivre II et dissoudre dans 10 mL de la solution d’acide acétique (pH = 4) pour obtenir un stock de CuCl2 de 144 mM. Aliquoter 490 μL de cette solution et ajouter à 1 510 μL d’acide acétique (pH = 4) pour obtenir une solution de CuCl2 de 35 mM.
    10. Aliquote 6 μL de la solution mère de CuCl2 de 35 mM et ajoutez-la à six échantillons contenant 94 μL de lysat cellulaire pour obtenir une concentration finale de CuCl2 d’environ 2 mM. Ajouter 6 μL d’une solution d’acide acétique (pH = 4) qui ne contient pas de CuCl2 à six échantillons contenant 94 μL de lysats cellulaires à utiliser comme témoins. Le volume final de lysat cellulaire devrait être de 100 μL, ce qui sera utilisé pour le test TBARS.
      REMARQUE: La fabrication de la solution mère cuCl2 de 35 mM dans de l’acide acétique (pH = 4) est nécessaire pour empêcher la précipitation de l’hydroxyde de cuivre.
    11. Incuber des échantillons dans un four à 37 °C pendant 24 h et effectuer un dosage TBARS sur chaque échantillon contenant un volume final de 100 μL.
    12. Répétez les étapes 1.1.9 et 1.1.11 2x sur des jours distincts pour vérifier la reproductibilité du test TBARS pour les lysats de cellules HepG2.
  2. Lipoprotéines de basse densité
    REMARQUE: En règle générale, les lipoprotéines de basse densité (LDL) pré-purifiées contiennent une certaine quantité d’EDTA. Les échantillons de LDL utilisés ici contiennent 0,01% d’EDTA. L’EDTA peut inhiber l’oxydation in vitro du LDL médiée par le Cu(II). Par conséquent, il peut être nécessaire de retirer l’EDTA des échantillons de LDL avant les expériences ou les analyses. Les étapes 1.2.1 à 1.2.5 décrivent ce processus.
    ATTENTION : L’hydroxyde de sodium est corrosif et provoque une irritation de la peau et des yeux. Utilisez un équipement de protection individuelle approprié.
    1. Aliquote 24 μL à partir d’un stock de LDL de 5,51 mg/mL (concentration en protéines déterminée par la méthode de Lowry modifiée en utilisant la BSA comme norme) dans des tubes en polypropylène à capuchon encliquetable de 1 mL correctement étiquetés. Faire autant d’aliquotes que nécessaire et conserver à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient utilisées dans l’oxydation et/ou le dosage TBARS.
    2. Préparer un tampon HEPES de 10 mM dans 0,15 M de NaCl ajusté au pH = 7 avec des billes de NaOH : dissoudre 4,39 g de NaCl dans 0,49 L d’eau, puis ajouter 1,19 g de HEPES. Bien dissoudre avec une barre de remuage. Ajouter les billes d’hydroxyde de sodium jusqu’à ce que le pH soit de 7. Diluer à 0,5 L avec de l’eau. Conserver le tampon à 4 °C et l’utiliser dans les 3 mois.
    3. Ajouter 476 μL du tampon HEPES de 10 mM dans 0,15 M de NaCl (pH = 7) aux échantillons de LDL aliquotes pour porter le volume final à 500 μL. Ajouter un échantillon de LDL dilué à un dispositif de filtre à spin centrifuge de 0,5 mL avec une limite de poids moléculaire de 100 K.
    4. Spin des échantillons à 14 000 x g pendant 10 min à TA, laissant un volume de rétentat final d’environ 30 μL. Reconstituer des échantillons dans 480 μL du tampon HEPES de 10 mM dans 0,15 M de NaCl (pH = 7) et tourner à nouveau à 14 000 x g pendant 10 min à RT. Effectuez cette étape 2x pour un total de quatre spin-throughs.
    5. Placez le dispositif filtrant à l’envers dans un nouveau tube en polypropylène à capuchon encliquetable de 2 mL et centrifugez à 1000 x g pendant 2 min pour prélever un échantillon de LDL (volume final = environ 30 μL).
    6. Échantillon aliquote dans un tube de 1 mL correctement étiqueté et ajouter 20 μL d’eau à chaque échantillon pour obtenir un volume final de 50 μL.
    7. Préparation de 200 μM de solution mère de CuCl2 dans de l’acide acétique (pH = 4)
      1. Préparer une solution d’acide acétique (pH = 4): voir étape 1.1.9.1.
      2. Préparer une solution mère de CuCl2 de 144 mM (voir étape 1.1.9.2), puis aliquoter 5,5 μL du bouillon de CuCl2 de 144 mM et dissoudre dans un volume final de 4 mL d’acide acétique (pH = 4) pour obtenir la solution de 200 μM.
    8. Aliquote 2,7 μL de la solution mère de CuCl2 de 200 μM et ajoutez-la à six échantillons contenant 50 μL de LDL pour obtenir une concentration finale de CuCl2 d’environ 10 μM. Ajouter 2,7 μL provenant d’une solution d’acide acétique (pH = 4) qui ne contient pas de CuCl2 à six échantillons contenant 50 μL de LDL à utiliser pour les témoins.
    9. Incuber des échantillons de LDL pendant 2 h dans un four à 37 °C. Après 2 h, porter le volume final à 100 μL pour chaque échantillon avec un tampon HEPES de 10 mM dans 0,15 M de NaCl (pH = 7). Effectuez immédiatement un test TBARS.
    10. Répétez les étapes 1.2.3 à 1.2.9 2x deux jours différents pour tester la reproductivité du test TBARS.
  3. Sérum humain
    1. À partir d’un échantillon de sérum humain, fabriquer des aliquotes de 94 μL chacune dans des tubes de polypropylène à capuchon encliquetable de 2 mL et conserver les échantillons à -80 °C.
    2. Préparer une solution mère de CuCl2 de 35 mM dans de l’acide acétique (pH = 4) : voir étape 1.1.9.
    3. Aliquote 6 μL de la solution mère de CuCl2 et ajoutez-la à six échantillons contenant 94 μL de sérum humain pour obtenir une concentration finale de CuCl2 d’environ 2 mM. Ajouter 6 μL d’une solution d’acide acétique (pH = 4) qui ne contient pas de CuCl2 à six échantillons contenant 94 μL de sérum humain à utiliser comme témoins.
    4. Incuber des échantillons de sérum humain pendant 24 h dans un four à 37 °C et déterminer les niveaux d’oxydation avec le test TBARS (section 4).
    5. Répétez les étapes 1.3.2 à 1.3.4 2x sur deux jours distincts pour déterminer la reproductibilité du test TBARS.

2. Préparation du réactif

ATTENTION: L’acide thiobarbiturique provoque une irritation de la peau et des yeux et peut être nocif par inhalation ou absorption cutanée. L’acide acétique peut endommager les organes internes s’il est inhalé. Préparer toutes les solutions acides dans une hotte.

  1. Préparation d’une solution de dodécylsulfate de sodium (FDS) à 8,1 % (p/v)
    1. Poids 32,4 g de FDS et dissoudre dans 350 mL d’eau DI dans un bécher. Utilisez une barre d’agitation magnétique pour dissoudre doucement les FDS et éviter de faire des bulles. Porter le volume final à 400 mL avec de l’eau DI et stocker la solution SDS à RT.
      REMARQUE: Ici, une solution de FDS excédentaire à 8,1% est préparée; toutefois, pour 96 échantillons, seulement environ 20 mL de la solution de FDS à 8,1 % sont nécessaires. Préparez cette solution en fonction du nombre d’échantillons analysés.
  2. Préparation d’un tampon d’acétate de sodium de 3,5 M (pH = 4)
    1. Diluer 100 mL d’acide acétique glacial dans 350 mL d’eau DI dans un bécher. Utilisez une barre d’agitation magnétique pour le dissoudre doucement.
    2. Préparer une solution de NaOH de 6,5 M à l’aide de billes d’hydroxyde de sodium dans l’eau. Dissoudre 13 g de billes de NaOH dans 40 mL d’eau DI et porter à un volume final de 50 mL avec de l’eau DI.
    3. Ajouter lentement environ 46 mL de la solution de NaOH de 6,5 M à la solution d’acide acétique tout en mélangeant avec la barre d’agitation (cela devrait augmenter le pH à 4, mais confirmer en ajoutant lentement la solution de NaOH tout en mesurant à l’aide d’un pH-mètre).
    4. Porter le volume final à 500 mL avec de l’eau DI et conserver le tampon d’acétate de sodium à TA.
  3. Préparation d’une solution aqueuse à 0,8% d’acide thiobarbiturique (ajustée au pH = 4)
    REMARQUE: Dans cette étape, la préparation de l’acide thiobarbiturique est optimisée pour de grands volumes, car un grand nombre d’échantillons vont être analysés (108 échantillons, sans compter les normes). Préparez cette solution en fonction du nombre d’échantillons prévus pour l’analyse.
    1. Préparer une solution d’hydroxyde de sodium de 5 M à l’aide de billes d’hydroxyde de sodium et d’eau : dissoudre 4 g de billes d’hydroxyde de sodium dans un volume final de 20 mL d’eau. Conserver dans un récipient en plastique. Cette solution doit être fraîchement préparée pour chaque lot.
    2. Poids 4 g d’acide thiobarbiturique et ajouter 450 mL d’eau DI. Utilisez une barre d’agitation magnétique pour le dissoudre doucement.
      REMARQUE: Cette solution sera finalement portée à un volume total de 500 mL.
    3. Lors de la dissolution de l’acide thiobarbiturique avec une barre d’agitation, ajouter (lentement et goutte à goutte) environ 3 mL de la solution de NaOH 5 M par incréments de 100 μL. Après avoir ajouté la solution de NaOH, les particules d’acide thiobarbiturique commenceront à se dissoudre.
    4. Si les particules d’acide thiobarbiturique ne sont toujours pas complètement dissoutes, ajouter plus de la solution de NaOH 5 M par incréments de 100 μL jusqu’à ce que toutes les particules d’acide thiobarbiturique soient complètement dissoutes. Pour ce volume particulier de solution, un total de 4 mL de la solution de NaOH 5 M est ajouté pour dissoudre complètement les particules d’acide thiobarbiturique.
      REMARQUE: À cette concentration, l’acide thiobarbiturique ne se dissoudra pas complètement à moins que le pH ne soit proche de 4.
    5. Arrêtez d’ajouter du NaOH une fois que tout l’acide thiobarbiturique s’est complètement dissous. Évitez de dépasser un pH de 4. Le pH final peut être vérifié en prenant 1 μL de la solution d’acide thiobarbiturique mélangée et en la plaçant sur du papier pH.
    6. Porter le volume final à 500 mL avec de l’eau DI et conserver une solution aqueuse d’acide thiobarbiturique à 0,8 % à TA.

3. Préparation de l’échantillon étalon de malondialdéhyde bis(diméthylacétal)

REMARQUE: Le malondialdéhyde (MDA) est instable et n’est pas disponible dans le commerce. Cependant, il existe différentes formes chimiques de MDA qui sont disponibles dans le commerce, telles que le sel de tétrabutylammonium MDA, le MDA bis (diméthylacétal) et le MDA bis (diéthyl acétal). De ces trois formes chimiques, MDA bis(diméthyl acétal) est utilisé ici, car la majorité des études utilisent cette même norme21,22. Si vous choisissez d’utiliser les deux autres formes chimiques de MDA, une validation préalable de leur adéquation doit être effectuée.

  1. Préparer une solution mère de MDA bis(diméthylacétal) de 550 μM en diluant 92 μL de MDA bis(diméthylacétal) pur dans 1 L d’eau DI. Utilisez une barre d’agitation magnétique pour bien mélanger la solution pendant 10 min. Conserver la solution à 4 °C et l’utiliser dans un délai de 1 mois.
  2. Préparer un bis(diméthylacétal) MDA de 200 μM en diluant 726 μL du bouillon de 550 μM de MDA bis(diméthylacétal) dans 1274 μL d’eau DI. Cette solution de MDA bis(diméthylacétal) de 200 μM doit être préparée fraîche chaque fois qu’un test TBARS est effectué.
  3. Préparation de courbe standard : prendre huit tubes en polypropylène à capuchon de 2 mL et les étiqueter avec les lettres A à H. Ajouter du MDA bis(diméthylacétal) à partir du stock de 200 μM et diluer dans l’eau comme décrit dans le tableau 1.
  4. Prenez huit tubes en verre (13 mm x 100 mm) et étiquetez-les de A à H, puis ajoutez 100 μL de norme aux tubes correspondants. Effectuer six répétitions pour l’étalon vierge (échantillon A) afin de calculer les limites de détection du test TBARS.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici pendant 1 h maximum.

4. Dosage TBARS

REMARQUE: Une fois que le test TBARS est démarré, il doit être terminé sans s’arrêter.

  1. Prenez autant de tubes de verre que nécessaire pour le nombre d’échantillons à analyser et étiquetez-les avec les noms des échantillons. Ensuite, ajoutez 100 μL de chaque échantillon préparé (comme décrit ci-dessus) à chaque tube de verre.
  2. Ajouter 200 μL de FDS à 8,1 % à chaque échantillon et étalon et faire tourbillonner doucement le tube de verre dans un mouvement circulaire pour mélanger l’échantillon.
  3. Ajouter 1,5 mL du tampon d’acétate de sodium de 3,5 M (pH = 4) à chaque échantillon et étalon.
  4. Ajouter 1,5 mL de solution aqueuse d’acide thiobarbiturique à 0,8 % (pH = 4) à chaque échantillon et étalon.
  5. Porter le volume final à 4 mL pour chaque échantillon et étalon en ajoutant 700 μL d’eau DI.
  6. Boucher hermétiquement chaque tube de verre et incuber dans un bloc chauffant réglé à 95 °C pendant 1 h. Couvrez les tubes de verre avec du papier d’aluminium pour éviter la condensation au sommet des tubes.
  7. Retirez les tubes de verre du bloc chauffant et incubez sur de la glace pendant 30 min.
  8. Échantillons et étalons de centrifugeuse à 1500 x g pendant 10 min à 4 °C. Après centrifugation, maintenir les tubes de verre contenant les échantillons et les étalons à RT.
    REMARQUE : Le fait de garder les échantillons sur de la glace ou à 4 °C entraînera la précipitation de l’échantillon entier ou de l’étalon.
  9. Immédiatement après la centrifugation, aliquoter 150 μL de surnageant de chaque tube et placer dans un puits séparé d’une plaque de 96 puits.
  10. Retirez les bulles de chaque puits à l’aide d’une pointe de pipette.
    REMARQUE: La présence de bulles donnera des lectures d’absorbance incohérentes, ce qui entraînera une imprécision élevée du test.
  11. Lire les absorbances à 532 nm. Soustrayez la lecture moyenne de l’absorbance des échantillons vierges de toutes les autres lectures d’absorbance.
  12. Créez une courbe standard en traçant les lectures d’absorbance soustraites à blanc à 532 nm par rapport à la concentration connue de chaque étalon. Ajuster les points de données à l’aide de la régression linéaire. Calculer les concentrations inconnues de l’échantillon en utilisant l’équation de la droite de régression linéaire obtenue à partir de la courbe standard.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans des conditions acides (pH = 4) et à 95 °C, le malondialdéhyde (MDA) bis(diméthylacétal) donne du MDA23. Le MDA et les congénères chimiques étroitement apparentés réagissent avec deux molécules d’acide thiobarbiturique (TBA) pour produire des composés appelés substances réactives de l’acide thiobarbiturique (TBARS), qui donnent une couleur rouge-rose et ont une absorbance λmax à 532 nm (Figure 1, Figure 2). En utilisant MDA...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Malgré ses limites1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 et un manque d’aptitude à la comparaison entre laboratoires, le test TBARS est l’un des plus ...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents ou d’autres conflits d’intérêts à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La recherche rapportée ici a été soutenue en partie par l’Institut national du cancer des National Institutes of Health sous le numéro de bourse. R33 CA217702 et le programme Initiative pour maximiser le développement des élèves (IMSD). Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement le point de vue officiel des National Institutes of Health.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1x Stérile PBS pH 7,4 1 LVWR, PA--262réactif de lyse cellulaire
50 mL tube centrifuge autoportantCorning, NYCLS430897Matériau général Plaque
96 puits, Non traité, transparent, avec couvercle, Non stérileThermo Fisher Scientific, MA280895Pour mesurer l’absorbance
Dispositif de filtre centrifuge à spin Amicon Ultra-0,5 100 kDFisher Scientific, NHUFC510024purification LDL
pour tubes en verreThermo Fisher Scientific, MA14-930-15Dpour le dosage TBARS
Chlorure de cuivre IISIGMA, MO222011-250Gpour induire l’oxydation
Tubes de culture, jetables, avec finition à bouchon à vis, Verre borosilicaté (13 x 100 mm)VWR, PA53283-800pour le dosage TBARS
Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM)ATCC, VAHB-8065Milieu cellulaire HepG2
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1,5 mLeppendorf, NY22363204Matériel général
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2,0 mLGenesee Sceitific, CA22363352Matériel général
Sérum de veau fœtal US Source OmegaScientific, CAFB-11pour la culture cellulaire
Acide acétique glacialSIGMA, MO27225-1L-RTBARS Réactif
Halt Cocktail d’inhibiteur de protéase (100x)Thermo Scientific, MA87786réactif de lyse cellulaire
HEPESSIGMA, MOH3375-250GLDL solvant
HepG2 CellulesATCC, VAHB-8065Prototype de matrice biologique
Acide chlorhydrique (HCl)Fisher Scientific, NHA144-212réactif
de lyse cellulaireLegend Micro 17 CentrifugeuseThermo Scientific, MA75002431Matériau général
Lipoprotéines de basse densité, Plasma humainAthènes Recherche & Technologie, GA12-16-120412Prototype de matrice biologique
Barres d’agitation magnétiques, Octogone 6-Assortiment VWR, PA58948-025Matériau général
Malondialdéhyde bis (acétal de diméthyle)SIGMA, MO8207560250TBARS Standard
Multiskan Go Spectrophotomètre à microplaquesFisher Scientific, NH51119200Pour mesurer l’absorbance
NP-40EMD Millipore Corp, MA492016-100MLréactif de lyse cellulaire
Chlorure de sodiumSIGMA, MOS7653-1KGréactif de lyse cellulaire
Dodécylsulfate de sodium (SDS)SIGMA, MO436143-100GRéactif TBARS
Hydroxyde de sodiumSIGMA, MO367176-2.5KGRéactif TBARS
ConcentrateurSpeedVac Thermo Scientific, MASC250EXPpour lysats cellulaires concentrés
T-75 Fliole, culture tissulaire traitée, 250 mL, avec capuchon filtrantUSA Scientific, FL658175culture cellulaire
Acide thiobarbituriqueSIGMA, MOT5500-100GTBARS
Réactif TRIS baseFluka, GA93362réactif de lyse cellulaire
Trypsine (1x)VWR, PA16777-166Pour détacher les cellules HepG2
101642 à Capuchons de

Références

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TBARS AssayLipid PeroxidationMalondialdehydeSpectrophotometric AnalysisStandard Curve PreparationHeating Block IncubationAbsorbance Measurement

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