Évaluation du stress oxydatif dans des échantillons biologiques à l’aide du test des substances réactives de l’acide thiobarbiturique

Résumé

L’objectif du test des substances réactives à l’acide thiobarbiturique est d’évaluer le stress oxydatif dans des échantillons biologiques en mesurant la production de produits de peroxydation lipidique, principalement du malondialdéhyde, en utilisant la spectrophotométrie de longueur d’onde visible à 532 nm. La méthode décrite ici peut être appliquée au sérum humain, aux lysats cellulaires et aux lipoprotéines de basse densité.

Résumé

Malgré sa spécificité analytique et sa robustesse limitées, le dosage des substances réactives à l’acide thiobarbiturique (TBARS) a été largement utilisé comme mesure générique de la peroxydation lipidique dans les fluides biologiques. Il est souvent considéré comme un bon indicateur des niveaux de stress oxydatif dans un échantillon biologique, à condition que l’échantillon ait été correctement manipulé et stocké. Le test implique la réaction de produits de peroxydation lipidique, principalement le malondialdéhyde (MDA), avec l’acide thiobarbiturique (TBA), ce qui conduit à la formation d’adduits MDA-TBA2 appelés TBARS. TBARS donne une couleur rouge-rose qui peut être mesurée spectrophotométriquement à 532 nm. Le test TBARS est effectué dans des conditions acides (pH = 4) et à 95 °C. Le MDA pur est instable, mais ces conditions permettent la libération de MDA à partir du MDA bis(diméthylacétal), qui est utilisé comme norme analytique dans cette méthode. Le test TBARS est une méthode simple qui peut être complétée en environ 2 h. La préparation des réactifs d’essai est décrite en détail ici. Les chercheurs soucieux de leur budget peuvent utiliser ces réactifs pour plusieurs expériences à faible coût plutôt que d’acheter un kit de test TBARS coûteux qui ne permet la construction que d’une seule courbe standard (et ne peut donc être utilisé que pour une seule expérience). L’applicabilité de ce test TBARS est démontrée dans le sérum humain, les lipoprotéines de basse densité et les lysats cellulaires. Le test est cohérent et reproductible, et des limites de détection de 1,1 μM peuvent être atteintes. Des recommandations pour l’utilisation et l’interprétation du test spectrophotométrique TBARS sont fournies.

Introduction

La peroxydation lipidique est un processus dans lequel les radicaux libres, tels que les espèces réactives de l’oxygène et les espèces réactives de l’azote, attaquent les doubles liaisons carbone-carbone dans les lipides, un processus qui implique l’extraction d’un hydrogène à partir d’un carbone et l’insertion d’une molécule d’oxygène. Ce processus conduit à un mélange de produits complexes, y compris les radicaux peroxyles lipidiques et les hydroperoxydes comme produits primaires, ainsi que le malondialdéhyde (MDA) et le 4-hydroxynonénal comme produits secondaires ^{prédominants1}.

Le MDA a été largement utilisé dans ....

Protocole

Des échantillons de sérum humain ont été obtenus auprès de volontaires consentants sous l’approbation de la CISR et conformément aux principes exprimés dans la Déclaration d’Helsinki. Les échantillons ont été codés et anonymisés avant d’être transférés au laboratoire d’analyse.

1. Préparation de l’échantillon

1. Lysats de cellules HepG2
   1. Ensemencez environ 10 x ¹⁰⁶ cellules HepG2 par fiole dans 16 fioles T75 avec 14 mL de milieu EMEM complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et cultivez des cellules pendant 2 jours.
   2. Préparer le tampon RIPA : dans un tube de 50 mL, ajouter 1,5 mL de 5 ....

Résultats

Dans des conditions acides (pH = 4) et à 95 °C, le malondialdéhyde (MDA) bis(diméthylacétal) donne du ^MDA23. Le MDA et les congénères chimiques étroitement apparentés réagissent avec deux molécules d’acide thiobarbiturique (TBA) pour produire des composés appelés substances réactives de l’acide thiobarbiturique (TBARS), qui donnent une couleur rouge-rose et ont une absorbance _λmax à 532 nm (Figure 1, Figure 2). En utilisant MDA.......

Discussion

Malgré ses limites1,3,4,7,8,9,10,12,13,14,15,19 et un manque d’aptitude à la comparaison entre laboratoires, le test TBARS est l’un des plus .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1x Stérile PBS pH 7,4 1 L	VWR, PA	--262	réactif de lyse cellulaire
50 mL tube centrifuge autoportant	Corning, NY	CLS430897	Matériau général Plaque
96 puits, Non traité, transparent, avec couvercle, Non stérile	Thermo Fisher Scientific, MA	280895	Pour mesurer l’absorbance
Dispositif de filtre centrifuge à spin Amicon Ultra-0,5 100 kD	Fisher Scientific, NH	UFC510024	purification LDL
pour tubes en verre	Thermo Fisher Scientific, MA	14-930-15D	pour le dosage TBARS
Chlorure de cuivre II	SIGMA, MO	222011-250G	pour induire l’oxydation
Tubes de culture, jetables, avec finition à bouchon à vis, Verre borosilicaté (13 x 100 mm)	VWR, PA	53283-800	pour le dosage TBARS
Eagle’s Minimum Essential Medium (EMEM)	ATCC, VA	HB-8065	Milieu cellulaire HepG2
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1,5 mL	eppendorf, NY	22363204	Matériel général
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2,0 mL	Genesee Sceitific, CA	22363352	Matériel général
Sérum de veau fœtal US Source Omega	Scientific, CA	FB-11	pour la culture cellulaire
Acide acétique glacial	SIGMA, MO	27225-1L-R	TBARS Réactif
Halt Cocktail d’inhibiteur de protéase (100x)	Thermo Scientific, MA	87786	réactif de lyse cellulaire
HEPES	SIGMA, MO	H3375-250G	LDL solvant
HepG2 Cellules	ATCC, VA	HB-8065	Prototype de matrice biologique
Acide chlorhydrique (HCl)	Fisher Scientific, NH	A144-212	réactif
de lyse cellulaireLegend Micro 17 Centrifugeuse	Thermo Scientific, MA	75002431	Matériau général
Lipoprotéines de basse densité, Plasma humain	Athènes Recherche & Technologie, GA	12-16-120412	Prototype de matrice biologique
Barres d’agitation magnétiques, Octogone 6-Assortiment VWR	, PA	58948-025	Matériau général
Malondialdéhyde bis (acétal de diméthyle)	SIGMA, MO	8207560250	TBARS Standard
Multiskan Go Spectrophotomètre à microplaques	Fisher Scientific, NH	51119200	Pour mesurer l’absorbance
NP-40	EMD Millipore Corp, MA	492016-100ML	réactif de lyse cellulaire
Chlorure de sodium	SIGMA, MO	S7653-1KG	réactif de lyse cellulaire
Dodécylsulfate de sodium (SDS)	SIGMA, MO	436143-100G	Réactif TBARS
Hydroxyde de sodium	SIGMA, MO	367176-2.5KG	Réactif TBARS
Concentrateur	SpeedVac Thermo Scientific, MA	SC250EXP	pour lysats cellulaires concentrés
T-75 Fliole, culture tissulaire traitée, 250 mL, avec capuchon filtrant	USA Scientific, FL	658175	culture cellulaire
Acide thiobarbiturique	SIGMA, MO	T5500-100G	TBARS
Réactif TRIS base	Fluka, GA	93362	réactif de lyse cellulaire
Trypsine (1x)	VWR, PA	16777-166	Pour détacher les cellules HepG2

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