Cartographie à haute résolution des interactions protéine-ADN dans les neurones dérivés des cellules souches de souris à l’aide de l’immunoprécipitation-exonucléase chromatine (ChIP-Exo)

Résumé

La détermination précise des emplacements liant les protéines dans l’ensemble du génome est importante pour comprendre la régulation des gènes. Ici nous décrivons une méthode génomique de cartographie qui traite l’ADN chromatin-immunoprécipité avec la digestion d’exonuclease (ChIP-exo) suivie du séquençage à haut débit. Cette méthode détecte les interactions protéine-ADN avec une résolution cartographique proche de la paire de base et un rapport signal-bruit élevé chez les neurones mammifères.

Résumé

L’identification d’interactions protéine-ADN spécifiques sur le génome est importante pour comprendre la régulation des gènes. L’immunoprécipitation de la chromatine couplée au séquençage à haut débit (ChIP-seq) est largement utilisée pour identifier les emplacements de liaison à l’échelle du génome des protéines liant l’ADN. Cependant, la méthode ChIP-seq est limitée par son hétérogénéité dans la longueur des fragments d’ADN sonicated et de l’ADN de fond non spécifique, ayant pour résultat la résolution de cartographie basse et l’incertitude dans les emplacements ADN-liants. Pour surmonter ces limitations, la combinaison du ChIP avec la digestion d’exonucléase (ChIP-exo) utilise la digestion d’exonuclease de 5' à 3' pour couper l’ADN immunoprécipité de taille hétérogène au site de liaison croisée protéine-ADN. Le traitement d’exonucléase élimine également l’ADN non spécifique de fond. L’ADN préparé par la bibliothèque et digéré par l’exonucléase peut être envoyé pour le séquençage à haut débit. La méthode ChIP-exo permet une résolution cartographique proche de la paire de base avec une plus grande sensibilité de détection et un signal d’arrière-plan réduit. Un protocole ChIP-exo optimisé pour les cellules mammifères et le séquençage de prochaine génération sont décrits ci-dessous.

Introduction

Les emplacements des interactions protéine-ADN donnent un aperçu des mécanismes de régulation des gènes. L’immunoprécipitation de la chromatine couplée au séquençage à haut débit (ChIP-seq) est utilisée depuis une décennie pour examiner les interactions protéine-ADN à l’échelle du génome dans les cellules^{vivantes 1,2}. Cependant, la méthode ChIP-seq est limitée par l’hétérogénéité dans la fragmentation de l’ADN et la contamination non lié de l’ADN qui conduisent à une faible résolution cartographique, de faux positifs, des appels manqués et un signal d’arrière-plan non spécifique. La combinaison du ChIP avec la....

Protocole

REMARQUE : L’eau distillée et déionisée autoclavée (ddH₂O) est recommandée pour la fabrication de tampons et de mélanges maîtres de réaction. Les sections 1−4 décrivent la lyse et la sonication cellulaires, les sections 5−7 décrivent l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP), les sections 8−11 décrivent les réactions enzymatiques sur les perles, les sections 12 et 13 décrivent l’élitution du ChIP et la purification de l’ADN, et les sections 14−19 décrivent la préparation de la bibliothèque.

1. Cellules de récolte et de liaison croisée

1. Après avoir différeté les cellules ES de souris en neurones postm....

Résultats

La figure 2A illustre les résultats de sonication après la lyse cellulaire et la sonication, avec divers cycles, des cellules de neurones moteurs différenciées des cellules ES de souris. Le nombre optimal de cycles de sonication (par exemple, 12 cycles de la figure 2A) agénéré une forte intensité d’ADN dans des fragments d’ADN de 100 à 400 pb. Les bibliothèques ChIP-exo de haute qualité sont basées sur la taille et la quantité d’ADN chromatine fragmenté. Ainsi, .......

Discussion

Dans ce protocole, le ChIP suivi de la digestion de l’exonucléase est utilisé pour obtenir des bibliothèques d’ADN pour l’identification des interactions protéine-ADN dans les cellules mammifères à une résolution cartographique ultra-élevée. De nombreuses variables contribuent à la qualité de l’expérience ChIP-exo. Les paramètres expérimentaux critiques incluent la qualité des anticorps, l’optimisation de la sonication, et le nombre de cycles LM-PCR. Ces paramètres expérimentaux critiques sont également ce qui peut limit.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose, UltraPure	Invitrogen	16500	Vérification de la sonication (Section 4.3.6) et purification sur gel de l’ADN amplifié LM-PCR (Section 19.1)
Albumine, sérum bovin (BSA), sans protéase, isolation par choc thermique, Min. 98 %	BioShop	ALB003	Solution bloquante
Anticorps contre Isl1	DSHB	39.3F7	Incuetion d’anticorps avec des billes (Section 5.6)
Bioruptor Pico& nbsp ;	Diagenode	B01060010	Chromatine sonicante (Section 3.3)
Albumine sérique bovine (BSA), Biologie moléculaire New	England BioLabs	B9000S	Réaction de remplissage sur billes (Section 10.2) et Dénaturation, Recuit d’amorce et Extension d’amorce (Section 14.2)
Centrifugeuse 5424 R	Eppendorf	5404000138	Chromatine sonicante (Section 3.5), Vérification de la sonication (Section 4.3.1, 4.3.3 et 4.3.4)
Centrifugeuse 5804	R Eppendorf	22623508	Cellules de récolte, de réticulation et de congélation (Section 1.3), Lyse cellulaire (Section 2.2 et 2.3), Chromatine sonicante (Section 3.1)
Cocktail d’inhibiteurs de protéase	Roche	4693159001	Ajouté à tous les tampons, à l’exception du tampon Proteinase K et du tampon d’élution
ChIP Solution dATP	New England BioLabs	N0440S	dA-Tailing Reaction (Section 15.1)
Sel de sodium d’acide désoxycholique	Fisher scientific	BP349	Tampon de lyse 3, tampon de lavage à haute teneur en sel et tampon de lavage LiCl
dNTP Mix, biologie moléculaire grade	Thermo Scientific	R0192	Réaction de remplissage sur billes (section 10.2) et dénaturation, recuit d’amorce et extension d’amorce (section 14.2)
DreamTaq Green PCR Master Mix, 2x  ;	Thermo Scientific	K1081	PCR médiée par ligature (Section 18.1)
EDTA, 0,5 M, Solution stérile, pH 8,0	BioShop	EDT111	Tampon de lyse 1-3, Vérification de la sonication (Section 4.1), Tampon de lavage à haute teneur en sel, Tampon de lavage LiCl et Tampon d’élution ChIP
Alcool éthylique anhydre, 100	Alcools commerciaux	P006EAAN	Vérification de la sonication (Section 4.3.3)
Formaldéhyde, 36,5-38 %, contient 10-15 % méthanol	Sigma	F8775	Cellules de récolte, de réticulation et de congélation (Section 1.1)
Glycérol, qualité réactif, min 99,5	BioShop	GLY002	Tampon de lyse 1
Glycine, qualité biotechnologique, min. 99 %	BioShop	GLN001	Cellules de récolte, de réticulation et de congélation (Section 1.2)
Glycogène, qualité ARN	Thermo Scientific	R0551	Vérification de la sonication (Section 4.3.3)
HEPES, 1 M de solution stérile filtrée, pH 7,3	BioShop	HEP003	Tampon de lyse 1, tampon de lavage au sel élevé
Fragment de Klenow (3->5 exo-)	New England BioLabs	M0212S	dA-Tailing Reaction (Section 15.1)
Exonucléase Lambda	New England BioLabs	M0262S	Exonucléase Lambda Digestion sur billes (Section 11.2)
Amplificateur de ligase	New England BioLabs	E7645S	Kit de bibliothèque d’ADN NEBNext Ultra II. Ligature de l’adaptateur d’index sur billes (section 9.1) et ligature de l’adaptateur universel (section 16.1)
Ligase Master Mix	New England BioLabs	E7645S	NEBNext Ultra II DNA Library Kit. Ligature de l’adaptateur d’index sur billes (Section 9.1) et ligature de l’adaptateur universel (Section 16.1)
Chlorure de lithium (LiCl), qualité réactif	Bioshop	LIT704	LiCl
Wash Buffer Perles magnétiques pour ChIP (Dynabeads Protein G)	Dynabeads Protein G (billes magnétiques pour ChIP)	Dynabeads Protein G (billes magnétiques pour ChIP)	Incubation d’anticorps avec des billes (Section 5)
Perles magnétiques pour la purification de l’ADN (billes AMPure XP)	Beckman Coulter	A63880	Extraction de l’ADN (Section 13.3) et nettoyage de l’ADN (Section 17.1)
Rack magnétique (Aimant DynaMag-2)	Invitrogen	12321D	Utilisé dans de nombreuses étapes dans les Sections : 5 - 11, 13
Kit d’extraction de gel MinElute	Qiagen  ;	28604	Purification sur gel d’ADN amplifié par PCR (Section 19.2)
Solution de sel de sodium N-Lauroylsarcosine, solution aqueuse à 30 %, &ge ; 97.0 % (HPLC)	Sigma	61747	Tampon de lyse 3
Éthoxylate d’octylphénol (IGEPAL CA630)	BioShop	NON999	Tampon de lyse 1 et tampon de lavage LiCl
Phénol :Chloroforme :Alcool isoamylique, qualité biotechnologie (25:24:1)	BioShop	PHE512	Vérification de la sonication (Section 4.3.1)
phi29 ADN polymérase	New England BioLabs	M0269L	Réaction de remplissage sur billes (Section 10.2) et Dénaturation, Recuit d’Amorce et Extension d’Apprêt (Section 14.3 et 14.4)
Saline tamponnée au phosphate (PBS), 1x  ;	Corning	21040CV	Cellules de récolte, de réticulation et de congélation (Section 1.3) et chromatine sonicante (Section 3.1), Incuetion d’anticorps avec des billes (Section 5.1)
Alimentation de base	PowerPac BioRad	1645050	Vérification de la sonication (Section 4.3.6) et purification sur gel de l’ADN amplifié LM-PCR (Section 19.1)
Système PCR ProFlex	Système	PCR	ProFlexUtilisé dans les sections : 14.2, 14.4, 15.2, 16.2 et 18.2
Tube LoBind protéique, 2,0 mL  ;	Eppendorf	22431102	Incubation d’anticorps avec billes (Section 5.2) et immunoprécipitation de la chromatine (Section 6.3)
Solution de protéinase K,	Invitrogen	de	vérification de la sonication (Section 4.2) et élution et réticulation inverse (Section 12.3)
Fluorimètre Qubit 4.0	Invitrogen	Q33226	Purification sur gel de l’ADN amplifié par PCR (Section 19.3)
Dosage Quibit dsDNA BR kit	Invitrogen	Q32853	Purification sur gel de l’ADN amplifié par PCR (Section 19.3)
Rnase A, Dnase et Protéase sans	Thermo Scientific	EN0531	sonication (Section 4.3.2) et de l’extraction de l’ADN (Section 13.2)
Chlorure de sodium (NaCl), BioReagent  ;	Sigma	S5886	Tampon de lyse 1-3, tampon de lavage au sel élevé
Dodécylsulfate de sodium (SDS), bioShop		SDS001	Sonication (section 4.1), tampon de lavage au sel élevé et tampon à élution ChIP
billes de sonication et tubes Bioruptor de 15 mL	diagénode	C01020031	chromatine sonicante (sections 3.1 et 3.2)
ThermoMixer F1.5  ;	Eppendorf	5384000020	Section 4.2, 4.3.2, 4.3.5, 8.2, 9.2, 10.3, 11.2, 12.2, 12.3, 13.2 et 16.2
Solution de chlorhydrate de Trizma (Tris-HCl), certifiée BioPerformance, 1 M, pH 7,4	Sigma	T2194	10 mM Tampon Tris-HCl
Solution de chlorhydrate de Trizma (Tris-HCl), certifiée BioPerformance, 1 M, pH 8,0	Sigma	T2694	Tampon de lyse 2, tampon de lyse 3, vérification de la sonication (section 4.1), tampon de lavage LiCl et tampon d’élution ChIP
Ultra II End Repair/dA-Tailing Module (24 rxn -> 120 rxn)	New England BioLabs	E7546S	Mélange de réaction de préparation d’extrémité et mélange d’enzyme de préparation d’extrémité. Réparation en bout et réaction de résidus dA sur les billes (section 8.2)
VWR Mini Tube Rocker, vitesse variable	VWR	10159-752	Utilisé dans de nombreuses étapes dans les sections : 1, 2, 5, 6 et 7
2-[4-(2,4,4-triméthylpentan-2-yl)phénoxy]éthanol, Triton X-100,	BioShop	TRX506	1, chromatine sonicante (section 3.4) et tampon de lavage au sel élevé

 %  % qualité ARN 25530049 Vérification de la de qualité électrophorèse tampon de lyse de qualité réactif