Article de méthode

Utilisation de Caenorhabditis elegans pour dépister les interactions tissulaires spécifiques des chaperons

DOI :

10.3791/61140

⸱

7 juin 2020

 ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Ben-Gurion University of the Negev

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour étudier les interactions chaperon-chaperon et chaperone-substrat, nous effectuons des écrans d’interaction synthétique chez Caenorhabditis elegans en utilisant l’interférence ARN en combinaison avec des mutations légères ou une sur-expression des chaperons et surveillons le dysfonctionnement protéique spécifique des tissus au niveau de l’organisme.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le repliement et l’assemblage corrects des protéines et des complexes protéiques sont essentiels à la fonction cellulaire. Les cellules utilisent des voies de contrôle de la qualité qui corrigent, séquestrent ou éliminent les protéines endommagées pour maintenir un protéome sain, assurant ainsi la protéostasie cellulaire et prévenant d’autres dommages aux protéines. En raison de fonctions redondantes au sein du réseau de protéostasie, le dépistage des phénotypes détectables à l’aide de knockdown ou de mutations dans des gènes codant pour chaperon dans l’organisme multicellulaire Caenorhabditis elegans entraîne la détection de phénotypes mineurs ou nuls dans la plupart des cas. Nous avons développé une stratégie de dépistage ciblée pour identifier les accompagnateurs nécessaires à une fonction spécifique et ainsi combler le fossé entre le phénotype et la fonction. Plus précisément, nous surveillons de nouvelles interactions de chaperon à l’aide d’écrans d’interaction synthétiques de l’ARNi, renversant l’expression du chaperon, un chaperon à la fois, chez les animaux porteurs d’une mutation dans un gène codant pour chaperon ou surexprimant un chaperon d’intérêt. En perturbant deux chaperons qui ne présentent individuellement aucun phénotype brut, nous pouvons identifier les chaperons qui aggravent ou exposent un phénotype spécifique lorsque les deux sont perturbés. Nous démontrons que cette approche permet d’identifier des ensembles spécifiques d’accompagnateurs qui fonctionnent ensemble pour moduler le repliement d’une protéine ou de complexes protéiques associés à un phénotype donné.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules font face aux dommages causés par les protéines en utilisant des machines de contrôle de la qualité qui réparent, séquestrent ou éliminent toutes les protéines endommagées1,2. Le repliement et l’assemblage des complexes protéiques sont soutenus par des chaperons moléculaires, un groupe diversifié de protéines hautement conservées qui peuvent réparer ou séquestrer les protéines endommagées3,4,5,6,7. L’élimination des protéines endommagées est médiée par le système ubiquitine-protéasome (UPS)8 ou par la machinerie d’autophagie9 en collaboration avec les chaperons10,11,12. L’homéostasie protéique (protéostasie) est donc maintenue par des réseaux de contrôle de la qualité composés de machines de repliement et de dégradation3,13. Cependant, comprendre les interactions entre les différentes composantes du réseau de protéostasie in vivo est un défi majeur. Alors que les écrans d’interaction protéine-protéine fournissent des informations importantes sur les interactions physiques et les complexes chaperons14,15, la compréhension de l’organisation et des mécanismes compensatoires au sein des réseaux de chaperons spécifiques aux tissus in vivo fait défaut.

Les interactions génétiques sont souvent utilisées comme un outil puissant pour examiner la relation entre les paires de gènes impliqués dans les voies biologiques communes ou compensatoires16,17,18. De telles relations peuvent être mesurées en combinant des paires de mutations et en quantifiant l’impact d’une mutation dans un gène sur la gravité phénotypique causée par une mutation dans le second gène16. Bien que la plupart de ces combinaisons ne montrent aucun effet en termes de phénotype, certaines interactions génétiques peuvent aggraver ou atténuer la gravité du phénotype mesuré. Des mutations aggravantes sont observées lorsque le phénotype du mutant à double délétion est plus grave que le phénotype attendu observé lors de la combinaison des mutants de délétion unique, ce qui implique que les deux gènes fonctionnent dans des voies parallèles, affectant ensemble une fonction donnée. En revanche, des mutations atténuantes sont observées lorsque le phénotype du mutant à double délétion est moins sévère que le phénotype observé avec les mutants à délétion simple, ce qui implique que les deux gènes agissent ensemble comme un complexe ou participent à la même voie16,18. En conséquence, divers phénotypes qui peuvent être quantifiés, y compris des phénotypes larges, tels que la létalité, les taux de croissance et la taille du couvain, ainsi que des phénotypes spécifiques, tels que les rapporteurs transcriptionnels, ont été utilisés pour identifier les interactions génétiques. Par exemple, Jonikas et al. se sont appuyés sur un rapporteur de stress ER pour examiner les interactions du réseau de protéostasie de réponse protéique déployée par ER à l’aide d’analyses de délétion de gènes par paires19.

Les tests d’interaction génétique impliquent de croiser systématiquement les mutations de délétion par paires pour générer un ensemble complet de doubles mutants20. Cependant, dans les modèles animaux, et en particulier chez C. elegans,cette approche à grande échelle n’est pas réalisable. Au lieu de cela, les souches mutantes peuvent être testées pour leurs modèles d’interaction génétique en régulant à la baisse l’expression des gènes à l’aide de l’interférence ARN (ARNi)21. C. elegans est un système puissant pour les écrans basé sur l’ARNi22,23. Chez C. elegans,l’administration d’ARN double brin (ARNds) est obtenue par alimentation bactérienne, ce qui conduit à la propagation des molécules d’ARNds à de nombreux tissus. De cette manière, les molécules d’ARNd introduites impactent l’animal via une procédure rapide et simple21. Un criblage d’interaction génétique utilisant l’ARNi peut donc révéler l’impact de la régulation à la baisse d’un ensemble de gènes ou de la plupart des gènes codant pour C. elegans à l’aide de bibliothèques d’ARNi24. Dans un tel écran, les hits qui impactent le comportement du mutant d’intérêt mais pas la souche de type sauvage sont des modificateurs potentiels du phénotype surveillé25. Ici, nous appliquons une combinaison de mutations et de dépistage de l’ARNi pour cartographier systématiquement les interactions de chaperon spécifiques aux tissus chez C. elegans.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparation de plaques de milieux de croissance de nématodes pour l’ARNi

  1. Dans une bouteille de 1 L, ajouter 3 g de NaCl, 2,5 g de Bacto-Peptone, 17 g de gélose et d’eau distillée jusqu’à 1 L et autoclave.
  2. Refroidir la bouteille à 55 °C.
  3. Ajouter 25 mL de 1 M KH2PO4,pH 6,0, 1 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M MgSO4et 1 mL de solution de cholestérol (Tableau 1) pour fabriquer un milieu de croissance des nématodes (NGM).
  4. Ajouter 1 mL d’ampicilline (100 mg/mL) et 0,5 mL de 1 M IPTG (Tableau 1) pour faire une solution de NGM-ARNi.
    REMARQUE: Les bactéries HT115 (DE3) E. coli couramment utilisées contiennent une ADN polymérase T7 inductible IPTG utilisée pour exprimer les plasmides codant pour l’ARNd. Ces plasmides codent également pour la résistance à l’ampicilline.
  5. Mélanger la solution chaude en faisant tourbillonner la bouteille.
  6. Dans la hotte ou en utilisant des procédures stériles, versez la solution de NGM dans des plaques ou à l’aide d’une pompe péristaltique, distribuez la solution dans des plaques. Utilisez des plaques de 6 puits, 12 puits, 40 mm ou 60 mm pour cet écran. La gélose devrait remplir environ 2/3 de la profondeur de la plaque.
  7. Laissez les assiettes sécher pendant la nuit sur le banc à température ambiante, en gardant les plaques couvertes. Les plaques NGM pour ARNi peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à un mois.

2. Cultiver des bactéries ARNi et ensemencer les plaques

  1. Dans la hotte ou à l’aide de procédures stériles, ajouter 1 mL d’ampicilline (100 mg/mL) et 2,5 mL de tétracycline (5 mg/mL)(tableau 1)à une solution et un mélange pré-autoclavés de 1 L de LB.
    REMARQUE: Les bactéries HT115 (DE3) E. coli couramment utilisées sont résistantes à la tétracycline.
  2. Dans la hotte ou à l’aide de procédures stériles, ajouter 600 μL de solution LB à chaque puits dans des plaques stériles de 96 puits de profondeur de 2 mL. Il est préférable d’utiliser une pipette multicanal pour distribuer le média.
  3. À l’aide de procédures stériles, inoculer des puits avec des bactéries HT115(DE3) E. coli transformées avec un plasmide codant pour l’ARNdS ciblant un gène d’intérêt ou un plasmide vide, comme témoin. Couvrir les plaques et incuber à 37 °C pendant la nuit. Les bibliothèques constituées de clones bactériens exprimant l’ARNds, correspondant à environ 94% des gènes prédits de C. elegans, ont été précédemment construites22,23 et sont disponibles dans le commerce. La bibliothèque d’accompagnateurs utilisée ici a été construite par le laboratoire du Dr Richard Morimoto26.
  4. À l’aide de procédures stériles, ensemencez 75, 150 ou 250 μL de bactéries sur les plaques d’ARNi NGM de 12 puits, 40 mm et 6 puits ou 60 mm, respectivement. Marquez clairement le nom du gène cible sur la plaque. Les bactéries doivent couvrir 30 à 50% de la surface de la gélose et ne doivent pas toucher les bords de la plaque.
  5. Laissez les assiettes sécher pendant au moins 2 jours sur le banc à température ambiante, en gardant les plaques couvertes.
    REMARQUE: Les assiettes peuvent être incubées à 37 ° C pendant la nuit. Assurez-vous que les puits intérieurs sont secs avant d’utiliser ou de stocker les plaques. À toutes fins à long terme (c.-à-d. séchage ou entreposage), gardez les plaques dans l’obscurité. Les assiettes séchées et ensemencées peuvent être conservées à 4 °C jusqu’à un mois.

3. Synchronisation non stressante des embryons

  1. Utilisez un pic à vers pour déplacer environ 100 œufs d’une plaque de ver non synchronisée vers une plaque NGM nouvellement ensemencée.
  2. Cultiver des animaux pendant 5 jours à 15 °C, 3,5 jours à 20 °C ou 2,5 jours à 25 °C. Les animaux devraient atteindre le premier jour de ponte.
    REMARQUE: Les vers sont généralement cultivés à 20 ° C. Cependant, différentes souches mutantes chaperonnes peuvent nécessiter des températures de culture spécifiques. Par exemple, de nombreuses souches sensibles à la température sont cultivées à 15 °C mais décalées à 25 °C pour exposer leur phénotype.
  3. Ajouter 1 mL de tampon M9 (Tableau 1) lentement et loin de la pelouse bactérienne. Faites pivoter la plaque de sorte que le tampon recouvre complètement la plaque. Ensuite, inclinez-le d’un côté et retirez le liquide de la plaque et lavez les animaux de la plaque.
    REMARQUE: Lors de l’utilisation d’animaux sensibles à la température ou de mutants chaperons, il est préférable de maintenir les tampons utilisés dans le protocole à la température de culture des animaux.
  4. Répétez l’étape 3.3 trois fois ou jusqu’à ce que tous les animaux soient lavés de la plaque.
  5. À l’aide d’une pointe en plastique standard, coupez un carré de gélose dans la plaque lavée où les œufs sont concentrés et placez le morceau de gélose sur une plaque NGM nouvellement ensemencée.
    REMARQUE: ~ 200 œufs sont nécessaires pour produire suffisamment d’animaux pondeurs; trop d’animaux consomment les bactéries trop rapidement. De faibles niveaux d’aliments peuvent avoir un impact sur la protéostasie27.
  6. Cultiver les animaux pendant 5 jours à 15 °C, 3,5 jours à 20 °C ou 2,5 jours à 25 °C. À ce stade, les plaques doivent être recouvertes d’œufs synchronisés.
    REMARQUE: Les animaux peuvent être déplacés vers une nouvelle plaque pendant une courte durée pour une synchronisation plus stricte. Cependant, il est important de n’utiliser que des adultes aux premiers stades de la ponte, car les animaux peuvent conserver des œufs dans leur utérus, ce qui a un impact sur la synchronisation.
  7. Ajouter 1 mL de tampon M9 lentement et loin de la pelouse bactérienne.
  8. Faites pivoter la plaque de sorte que le tampon recouvre complètement la plaque. Ensuite, inclinez-le d’un côté et retirez le liquide de la plaque et lavez les animaux de la plaque.
  9. Répétez l’étape 3.7 trois fois ou jusqu’à ce que tous les animaux soient lavés de la plaque.
  10. Ajouter 1 mL de tampon M9 et utiliser un grattoir à cellules pour libérer les œufs de la plaque.
  11. Recueillir le tampon M9 contenant les œufs des assiettes.
  12. Centrifuger le tampon M9 contenant les œufs à 3 000 x g pendant 2 min.
  13. Retirez le surnageant et ajoutez un tampon M9 pour atteindre un volume de 1 mL.
  14. Resuspendez les œufs pour perturber les morceaux d’œufs et de bactéries.
  15. Répétez cinq fois la procédure de lavage décrite aux étapes 3.11 à 3.13. La pastille d’œuf doit apparaître blanche. S’il est encore jaune/brun, répétez le lavage jusqu’à ce qu’une pastille blanche soit obtenue.
    REMARQUE: Les bactéries qui restent sur les œufs peuvent contaminer les bactéries exprimant l’ARNd.
  16. Retirez la majeure partie du surnageant, en laissant environ 200 μL. Les œufs synchronisés peuvent être utilisés pour les écrans aRNi.

4. Essais phénotypiques courants

  1. Culture d’animaux pendant les expériences
    1. Placez une goutte d’environ 30 œufs près de la pelouse bactérienne dans chaque assiette ensemencée d’ARNi. Pour référence, placez également environ 30 œufs sur des assiettes ensemencées de bactéries vides contenant des vecteurs (L4440).
    2. Cultivez des animaux synchronisés avec l’âge sur des plaques ensemencées d’ARNi NGM. La durée de l’expérience dépendra du stade auquel les animaux doivent être surveillés et de la température de culture. Ajuster la température de culture lors de l’utilisation d’animaux mutants sensibles à la température. Ajuster la durée de culture lors de l’utilisation d’animaux mutants retardés par le développement.
      REMARQUE: Bien que le moment puisse varier, une fois que les animaux atteignent l’âge adulte, la ponte (et la consommation alimentaire rapide qui en résulte), ainsi que la protéostse dépendante de l’âge s’effondrent28, pourraient avoir un impact sur les résultats. Il est donc recommandé de noter les animaux avant le début de la ponte (jour 1 de l’âge adulte). Les animaux de type sauvage atteignent ce stade après 4,5 jours à 15 °C, 3 jours à 20 °C ou 2 jours à 25 °C.
    3. Le nombre de répétitions utilisées dépendra de la taille de l’ensemble de gènes examiné. Pour la bibliothèque de chaperons (97 gènes), répétez les expériences au moins quatre fois. La taille de la population dépend du dosage utilisé. Dans les tests comportementaux discutés ici, le score >15 animaux par condition expérimentale dans chaque répétition. Les données et les analyses statistiques dépendent également fortement du type de test utilisé. Les données des essais discutés ici peuvent être présentées comme des moyens ± SEM.
    4. Comparer les animaux traités par ARNi et les animaux à vecteurs vides en tant que populations indépendantes. Les valeurs P peuvent être calculées à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle ou bidirectionnelle, en fonction des changements examinés, à savoir aggraver ou atténuer seul ou les deux. Lors de l’examen d’un seul traitement aRNi par rapport au contrôle, les valeurs de P peuvent être calculées à l’aide d’un test de somme de rang de Mann-Whitney unidirectrotique ou bidirectionnel. Outre la signification statistique, considérez un seuil de résultats en fonction du degré d’impact sur le phénotype.
  2. Arrêt/retard de développement
    1. Cultivez des animaux synchronisés avec l’âge comme à l’étape 4.1 jusqu’à ce que les animaux élevés sur des bactéries témoins contenant des vecteurs vides atteignent l’âge adulte, mais avant le début de la ponte.
    2. Surveillez les animaux à l’aide d’un stéréomicroscope et comptez le nombre de larves et d’adultes pour noter le pourcentage d’animaux ayant un retard de développement. À titre de référence, comparez avec des animaux mutants élevés sur des bactéries témoins vides contenant des vecteurs. Le traitement aRNi hsp-1 ou hsp-90 entraîne l’arrêt du développement des animaux de type sauvage et peut être utilisé comme témoin positif.
    3. Pour noter le pourcentage d’animaux retardés dans le développement au fil du temps, répétez l’étape 4.2.2.
      REMARQUE: S’il y a des adultes pondeurs dans l’assiette, transférez les animaux ayant un retard de développement vers une nouvelle plaque NGM-ARNi étiquetée pour le même gène cible afin d’éviter toute confusion avec la progéniture.
  3. Stérilité ou défauts de ponte
    1. Cultivez des animaux synchronisés avec l’âge comme à l’étape 4.1 jusqu’à ce que les animaux élevés sur des bactéries anti-vecteurs vides commencent à pondre des œufs.
    2. Surveillez les animaux à l’aide d’un stéréomicroscope et notez le pourcentage d’animaux sans œufs visibles dans leur utérus. À titre de référence, comparez avec des animaux mutants élevés sur des bactéries vectorielles vides.
    3. Alternativement, surveillez les animaux à l’aide d’un stéréomicroscope et notez le pourcentage d’animaux avec un utérus plein d’œufs, défini comme EGg Pondeur défectueux (Egl-d) phénotype29.
  4. Létalité embryonnaire
    1. Cultivez des animaux synchronisés avec l’âge comme à l’étape 4.1 jusqu’à ce que les animaux commencent à pondre des œufs.
    2. Transférer environ 100 œufs dans une assiette vide. Étalez les œufs en rangées pour simplifier le comptage.
    3. Marquez le pourcentage d’œufs non échatchés dans l’assiette après 24 à 48 heures. À titre de référence, comparez aux œufs d’animaux traités avec des bactéries antivectorielles vides.
  5. Test de paralysie
    1. Pour les adultes du jour 1, cultivez des animaux synchronisés avec l’âge comme à l’étape 4.1 jusqu’à ce que les animaux élevés sur des bactéries vectorielles vides atteignent l’âge adulte, mais avant le début de la ponte.
    2. Tracez une ligne au dos d’une plaque de gélose NGM ordinaire à l’aide d’un marqueur fin.
    3. Placez 5 à 10 animaux sur la ligne marquée.
    4. Réglez une minuterie et attendez 10 min.
    5. Marquez le pourcentage d’animaux restant sur la ligne en tant que vers paralysés. À titre de référence, comparez avec des animaux mutants élevés sur des bactéries vectorielles vides. Les animaux de type sauvage traités avec de l’ARNi unc-45 présentent un phénotype de paralysie sévère et peuvent être utilisés comme témoin positif.
      REMARQUE: Ce test met en évidence les animaux présentant une paralysie moyenne à sévère. Ces animaux sont généralement allongés droit sur la plaque, plutôt que de présenter la forme incurvée commune. De plus, un patch débarrassé des bactéries est visible autour de la tête des vers paralysés.
  6. Essai de thrashing
    1. Cultivez des animaux synchronisés avec l’âge comme à l’étape 4.1 jusqu’à ce que les animaux élevés sur des bactéries vectorielles vides atteignent l’âge adulte, mais avant le début de la ponte.
    2. Pipet 100 μL de tampon M9 à la température de culture des animaux dans une plaque de 96 puits.
    3. Placez environ 15 vers, un par puits, dans les puits contenant le tampon M9.
    4. Laissez les animaux s’ajuster pendant 5 min.
    5. Examinez chaque animal sous le stéréomicroscope, démarrez un compte à rebours de 15 s et comptez le nombre de flexions corporelles que chaque animal effectue au cours de cette période. Les valeurs comptées peuvent être normalisées en courbes corporelles par minute. À titre de référence, comparez avec des animaux mutants élevés sur des bactéries vectorielles vides.
      REMARQUE: Ce test de motilité est très sensible et peut détecter des différences très légères entre les traitements. Cependant, la motilité dans le liquide et la motilité sur la gélose peuvent différer.

5. Validation de l’élimination des protéines

  1. Placer 250 à 300 œufs synchronisés sur une plaque NGM-ARNi de 60 mm ensemencée avec la bactérie L4440 (L4440) exprimant l’ARNdS ou contenant un vecteur vide.
    REMARQUE: L’aRNi pourrait entraîner une accumulation aberrante d’embryons, un manque d’embryons ou un arrêt du développement qui pourrait avoir un impact sur l’expression des gènes. Cela doit être pris en compte lors de la détermination de l’âge des animaux à examiner.
  2. Pour les adultes du jour 1, cultiver des animaux pendant 4,5 jours à 15 °C, 3 jours à 20 °C ou 2 jours à 25 °C.
  3. Cueillez et transférez un total de 200 jeunes animaux adultes dans le bouchon d’un tube de remplissage de 1,5 mL avec 200 μL de PBS-T.
    REMARQUE: Lors de l’utilisation d’animaux sensibles à la température ou de mutants chaperons, il est préférable de maintenir les tampons utilisés dans le protocole à la température de culture des animaux.
  4. Fermez soigneusement le bouchon et centrifugez à 1 000 x g pendant 1 min.
  5. Ajouter 800 μL de PBS-T(tableau 1)et centrifuger à 1 000 x g pendant 1 min.
  6. Retirez délicatement les 900 μL supérieurs.
  7. Répétez les étapes 5.4 à 5.6 trois fois.
  8. Retirer 900 μL, en laissant 100 μL de solution contenant les 200 vers.
  9. Ajouter 25 μL de tampon d’échantillon 5x (Tableau 1).
  10. Chauffer les échantillons pendant 10 min à 92°C tout en agitant à 1000 tr/min. Les échantillons peuvent ensuite être congelés et conservés à -20 °C.
  11. Chargez 20 μL de chaque échantillon et exécutez sur un gel SDS-PAGE.
  12. Effectuer une analyse par transfert western à l’aide d’anticorps appropriés pour déterminer la stabilité relative de la protéine.
  13. Déterminez l’intensité des bandes à l’aide d’un logiciel densitométrie, tel que le module gel ImageJ disponible gratuitement. Normaliser toutes les valeurs par rapport à celles mesurées dans le(s) échantillon(s) témoin(s).
    REMARQUE: L’objectif de l’ARNi dans nos écrans est de réduire les niveaux de protéines d’un chaperon / co-chaperon spécifique. Ainsi, la meilleure façon d’évaluer l’efficacité de l’ARNi knockdown est par l’analyse par transfert western. Cela nécessite des anticorps spécifiques. Alternativement, la qPCR peut être utilisée pour quantifier les niveaux d’ARNm.

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Résultats

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Utilisation de mutations sensibles à la température dans l’UNC-45 pour dépister les interactions aggravantes ou atténuantes dans des conditions permissives ou restrictives, respectivement
L’assemblage et l’entretien musculaires offrent un système efficace pour étudier les interactions des chaperons spécifiques aux tissus. L’unité fonctionnelle des muscles contractiles, le sarcomère, présente un arrangement cristallin de protéines structurelles et régulatrices. La stabilité de la protéine motrice myosi...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une image intégrée du réseau de protéostasie reflétant son organisation et son fonctionnement dans différentes cellules et tissus métazoaires fait toujours défaut. Pour remédier à cette lacune, des informations spécifiques sur les interactions des différents composants de ce réseau, tels que les chaperons moléculaires, dans des tissus spécifiques au cours du développement et du vieillissement sont nécessaires. Ici, nous avons montré comment l’utilisation de perturbations spécifiques aux tissus nous a permis d’examiner le...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions le Caenorhabditis Genetics Center, financé par le NIH National Center for Research Resources (NCRR), pour certaines des souches de nématodes. Les anticorps monoclonaux développés par H.F. Epstein ont été obtenus à partir de la Developmental Studies Hybridoma Bank développée sous les auspices du NICHD et maintenue par le Département de biologie de l’Université de l’Iowa. Cette recherche a été soutenue par une subvention de la Fondation israélienne pour la science (subvention n° 278/18) et par une subvention du ministère israélien de la Science et de la Technologie et du ministère des Affaires étrangères et de la Coopération internationale, Direction générale de la promotion des pays, République italienne (subvention n° 3-14337). Nous remercions les membres du laboratoire Ben-Zvi pour leur aide dans la préparation de ce manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaques 12 puitsSPLBA3D16B
plaques de 40 mmGreiner Bio-one627160
Plaques de 60 mmGreiner Bio-one628102
plaques 6 puitsThermo Scientific140675
96 puits 2 mL 128.0/85mmGreiner Bio-one780278
agarFormediumAGA03
AmpicillineFormedium69-52-3
bleu bromophénolSigmaBO126-25G
CaCl2Merck1.02382.0500
Appareil photoQimagingq30548
CholestérolAmresco0433-250G
ConfocalLeicaDM5500
Filtre (0,22 & micro ; m)SigmaSCGPUO2RE
Stéréomicroscope fluorescentLeicaMZ165FC
GlycerolFrutarom2355519000024
IPTGFormedium367-93-1
KClMerck104936
KH2PO4Merck1.04873.1000
KOHBio-Lab001649029100
MgSO4Fisher22189-08-8Don du laboratoire Morimoto
Myosin MHC A (MYO-3) Anticorps Banque d’hybridomes5-6
Na2HPO4· ; 7H2OSigmas-0751
NaClBio-Lab001903029100
PeptoneMerck61930705001730
Pompe verseuse à plaquesIntegrale fait p920
RNAi Chaperonelibrary NANA
SDSVWR Life Science0837-500
ß ;- mercaptoéthanolBio world41300000-1
stéréomicroscopeLeicaMZ6
TetracyclineDuchefa Biochemie64-75-5
TrisBio-Lab002009239100
Tween-20FisherBP337-500

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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