Article de méthode

Fabrication de guides d’ondes en mode zéro pour la microscopie à molécule unique à haute concentration

DOI :

10.3791/61154

⸱

12 mai 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pennsylvania Muscle Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 2Department of Physics, West Chester University

Dans cet article

Avis d’erratum

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Résumé

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Décrit ici est une méthode de lithographie de nanosphère pour la fabrication parallèle de guides d’ondes en mode zéro, qui sont des réseaux de nanoapertures dans une lame de couverture de microscopie en verre revêtu de métal pour l’imagerie à molécule unique à des concentrations nano- à micromolaires de fluorophores. La méthode tire parti de l’auto-assemblage de cristaux colloïdaux pour créer un modèle de guide d’ondes.

Résumé

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En enzymologie de fluorescence à molécule unique, la fluorescence de fond à partir de substrats marqués en solution limite souvent la concentration de fluorophores à des plages pico- à nanomolaires, plusieurs ordres de grandeur inférieures à de nombreuses concentrations physiologiques de ligands. Les nanostructures optiques appelées guides d’ondes en mode zéro (ZMW), qui ont des ouvertures de 100−200 nm de diamètre fabriquées dans un métal conducteur mince tel que l’aluminium ou l’or, permettent l’imagerie de molécules individuelles à des concentrations micromolaires de fluorophores en limitant l’excitation de la lumière visible à des volumes efficaces zéptolitres. Cependant, le besoin d’équipements de nanofabrication coûteux et spécialisés a empêché l’utilisation généralisée des ZMW. En règle générale, les nanostructures telles que les ZMW sont obtenues par écriture directe à l’aide de la lithographie par faisceau d’électrons, qui est séquentielle et lente. Ici, colloïdale, ou nanosphère, la lithographie est utilisée comme une stratégie alternative pour créer des masques à l’échelle nanométrique pour la fabrication de guides d’ondes. Ce rapport décrit l’approche en détail, avec des considérations pratiques pour chaque phase. La méthode permet de faire des milliers de ZMW en aluminium ou en or en parallèle, avec des diamètres et des profondeurs de guide d’ondes finaux de 100−200 nm. Seuls l’équipement de laboratoire commun et un évaporateur thermique pour le dépôt de métaux sont requis. En rendant les ZMW plus accessibles à la communauté biochimique, cette méthode peut faciliter l’étude des processus moléculaires aux concentrations et aux taux cellulaires.

Introduction

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Les techniques monomoléculaires telles que le transfert d’énergie de résonance de fluorescence à molécule unique (smFRET) ou la spectroscopie de corrélation de fluorescence à molécule unique (FCS) sont des outils puissants pour la biophysique moléculaire, permettant l’étude des mouvements dynamiques, des conformations et des interactions de biomolécules individuelles dans des processus tels que la transcription1,2,3,la traduction4,5,6,et bien d’autres7. Pour s....

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Protocole

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REMARQUE: Toutes les étapes peuvent être effectuées dans l’espace de laboratoire général.

1. Nettoyage des lamaux de couverture en verre

  1. Pour fournir une surface propre pour le dépôt par évaporation de particules colloïdales, placez des lamelle de verre borosilicate optique de 24 x 30 mm (épaisseur de 0,16 à 0,19 mm) dans les inserts rainurés d’un bocal de coloration en verre coplin pour le nettoyage.
    REMARQUE: Assurez-vous que les lamures de couverture sont verticales et bien séparées afin que toutes les surfaces soient clairement exposées pendant le processus de nettoyage.
  2. Verser suffisamment d’acétone dans le bocal....

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Résultats

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L’auto-assemblage des particules colloïdales de polystyrène par sédimentation par évaporation (étapes 2.1 à 2.13) peut produire une gamme de résultats puisqu’il nécessite un contrôle du taux d’évaporation du solvant. Cependant, comme les dépôts sont rapides (10 à 15 min par tour), la procédure peut être rapidement optimisée pour différentes conditions ambiantes de laboratoire. La figure 3A montre un gabarit colloïdal bien formé après dépôt et évaporation. Macroscopiquement, la région des per.......

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Discussion

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Pour l’auto-assemblage colloïdal (protocole section 2), l’utilisation d’éthanol plutôt que d’eau comme solvant de suspension accélère le processus d’évaporation de sorte que les gabarits soient prêts en 2−3 min après dépôt plutôt qu’en 1−2 h comme dans les méthodes précédentes48,49. Le protocole de sédimentation par évaporation présenté ici est également plus simple que les protocoles de sédimentation précédents qui nécessitent de contrôler l’inclinaison de la su.......

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par les subventions R01GM080376, R35GM118139 et NSF Center for Engineering MechanoBiology CMMI: 15-48571 à Y.E.G., et par une bourse nrsa pré-doctorale NIAID F30AI114187 à R.M.J.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1. Couvercle en verre Nettoyage
acétoneSigma322011 L
Pot de coloration en verre CoplinFisher Scientific08-817Pot de coloration avec 8 rainures et couvercle en verre moulé
Couvre-objectifsVWR48404-46724 mm x 30 mm (N° 1½ ;, rectangulaire)
EthanolSigmaE70231 L
KOHSigma30603hydroxyde de potassium
Fisher ScientificR80115TS100 mm de diamètre, 15 mm de profondeur
SonicatorBransonZ245143Nettoyeur à ultrasons de table, 5510
2. Dépôt par évaporation de billes de polystyrène
Clear contenant de stockageFisher Scientific50-110-822226 x 18 x 15 po.
Ventilateur de bureauO2CoolFD05001ATout petit ventilateur de bureau (~5 po) fonctionnera
Bécher en verreFisher Scientific02-555-25B250 mL
HygromètreFisher Scientific11-661-19
Microtubes à centrifugerFisher Scientific21-402-9031,5 mL
Microsphères de polystyrènePolysciences18602-151,00 et micro ; m de diamètre, non fonctionnalisé
Triton X-100 dépressuriséSigmaX100100 mL
3. Recuit de billes pour réduire la taille des pores dans le cristal colloïdal Plaque en aluminium
Fisher ScientificAA11062RYPersonnalisée en interne à 14 cm x 14 cm
Plaque chauffante en céramiqueFisher ScientificHP8885710013 x 8,2 x 3,8 po.
Régulateur de températureMcMaster-Carr38615K71Lire la température avec sonde thermocouple
Sonde thermocoupleMcMaster-Carr9251T93Type K, sonde de surface
4/5. Nanofabrication de guides d’ondes en mode zéro à l’aide du modèle de cristal colloïdal
Agent de gravure d’aluminiumTransènePastilles
Kurt J. LeskerEVMAL40QXHBPour l’évaporation par faisceau d’électrons
ChloroformSigma2883061 L
Agent de gravure de cuivreTransene49-1
Pastilles de cuivreKurt J. LeskerEVMCU40QXQAPour l’évaporation par faisceau d’électrons
Pastilles d’orKurt J. LeskerEVMAUXX40GPour l’évaporation par faisceau d’électrons
Papier lentilleThorlabsMC-5
Nettoyeur plasmaHarrick PlasmaPDC-32G
Ruban adhésifStaplesMMM119
Système de dépôt de couche mincesystème d’évaporation thermique de tableKurt J. LeskerPVD-75
Pastilles de titaneKurt J. LeskerEVMTI45QXQAPour l’évaporation par faisceau d’électrons
TolueneSigma2445111 L
Representative Results
COMSOL Logiciel de modélisation multiphysiqueCOMSOL, Inc.
Séparateur spectral Dual ViewPhotometrics, Inc.
Boîtes de Pétri à d’aluminium de type A Le fonctionnera également

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapanidis, A. N., et al. Initial transcription by RNA polymerase proceeds through a DNA-scrunching mechanism. Science. 314 (5802), 1144-1147 (2006).
  2. Santoso, Y., et al. Confor....

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Réimpressions et autorisations

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Erratum

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Formal Correction: Erratum: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy
Posted by JoVE Editors on 8/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Fabrication of Zero Mode Waveguides for High Concentration Single Molecule Microscopy. A figure was updated.

Figure 3 was updated from:

Colloidal crystal patterns, optical micrographs, grain structure, diffraction patterns, scale bars.
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Colloidal crystal diffraction patterns and SEM images; microscopy analysis of photonic structures.
Figure 3: Representative results from evaporative deposition of colloids. (A) Example of optimal colloid deposition. (B) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were more humid (80% RH) than ideal. Holes in the crystal monolayer are apparent. (C) Example of an acceptable colloid deposition in which conditions were drier (65% RH) than optimal. The monolayer regions are slightly translucent while multilayered areas are white and opaque (perimeter and streaks inward). (D) A colloidal crystal illuminated with white light to highlight the rainbow diffraction from the crystals. (E) AFM image (tapping probe AFM in air) of a monolayer of hexagonally packed polystyrene beads from a successful colloid deposition (scale bar = 10 µm). (F) Expanded AFM image of packed beads (scale bar = 2 µm). Please click here to view a larger version of this figure.

Mots-clés

Lithographie par nanosph reslithographie collo daled p t par vaporation thermiqueguides d ondes en aluminiumpiliers de cuivremicroscopie force atomiqueFRET de mol cule uniquechambre humidit

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