Décrit ici est un protocole pour étudier comment l’extrait de fumée de cigarette affecte la colonisation bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires.
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Article de méthode
Étude des effets de la fumée de cigarette sur l’infection de Pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le tabagisme est la principale cause étiologique de l’emphysème pulmonaire et de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Le tabagisme favorise également la susceptibilité aux infections bactériennes dans le système respiratoire. Cependant, les effets du tabagisme sur les infections bactériennes dans les cellules épithéliales pulmonaires humaines n’ont pas encore été étudiés en profondeur. Décrit ici est un protocole détaillé pour la préparation des extraits de tabagisme (CSE), le traitement des cellules épithéliales pulmonaires humaines avec CSE, et l’infection bactérienne et la détermination de l’infection. Le CST a été préparé selon une méthode conventionnelle. Les cellules épithéliales pulmonaires ont été traitées avec 4% de CSE pour 3 h. Les cellules traitées au CSE ont alors été infectées par Pseudomonas à une multiplicité d’infection (MOI) de 10. Les charges bactériennes des cellules ont été déterminées par trois méthodes différentes. Les résultats ont montré que le CSE a augmenté la charge de Pseudomonas dans les cellules épithéliales pulmonaires. Ce protocole fournit donc une approche simple et reproductible pour étudier l’effet de la fumée de cigarette sur les infections bactériennes dans les cellules épithéliales pulmonaires.
Introduction
Le tabagisme affecte la santé publique de millions de personnes dans le monde. De nombreuses maladies nocives, y compris le cancer du poumon et la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), seraient liées au tabagisme1,2. Le tabagisme augmente la susceptibilité aux infections microbiennes aiguës dans le système respiratoire3,4,5. En outre, les preuves de montage prouvent que le tabagisme améliore la pathogénie de nombreux troubles chroniques6,7,
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Protocole
1. Préparation du CST à 100 %
- Dessiner 10 mL de milieux de culture cellulaire sans sérum (DMEM/F12 pour les cellules BEAS-2B; milieu basal épithélial des voies respiratoires pour les cellules HSAEC) dans une seringue de 60 mL.
- Attachez à l’envers une pointe de pipette de 1 mL bien garnie à la buse de la seringue comme adaptateur pour tenir la cigarette (3R4F).
- Retirer le filtre de la cigarette. Attachez une cigarette à l’adaptateur de pointe et allumez la cigarette.
- Dessinez 40 mL d’air contenant de la fumée dans 10 mL de milieu sans sérum. Mélanger la fumée avec le milieu en secouant vigoureusement (30 s par tirage).
- ....
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Résultats
Un diagramme est utilisé pour illustrer le protocole de la figure 1. Les cellules épithéliales du poumon BEAS-2B ont été traitées avec le CST et défiées par Pseudomonas. Pseudomonas dans le milieu de culture ont été tués par la gentamycine ajoutée et les cellules ont été soumises à l’essai de plaque de chute, la détection de RT-qPCR de Pseudomonas ribosome 16S ARN, et la cytométrie de flux. Par rapport au contrôle, le traitement du CST a considérablement augmenté l.......
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Discussion
L’invasion bactérienne dans les cellules épithéliales pulmonaires est une étape cruciale dans la pathogénie des infections bactériennes. Le processus d’invasion bactérienne dans les cellules peut être divisé en trois étapes suivantes: Premièrement, les bactéries entrent en contact et adhèrent à la surface de la cellule épithéliale à l’aide de leur flagelle. Deuxièmement, les bactéries subissent une internalisation ou pénètrent dans la membrane cellulaire. Enfin, les bactéries reproduisent et colonisent les cellules si el.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Remerciements
Ce travail a été soutenu en partie par un National Institutes of Health R01 subventions HL125435 et HL142997 (à CZ).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Seringue de 50mL | BD Biosciences | ||
| cellule épithéliale des voies respiratoires milieu basal | ATCC | PCS-300-030 | |
| Agitateur de bactéries | ThermoFisher Scientific | ||
| kit de croissance des cellules épithéliales bronchiques | ATCC | PCS-300-040 | |
| Compteur de cellules | Bio-Rad | ||
| CFX96 Système | de PCR en temps réelBio-Rad | ||
| KIT ARN-ADN haute capacité | ThermoFisher Scientific | 4387406 | |
| HITES | moyenne ATCC ATCC | 30-2004 | |
| cellules humaines BEAS-2B ATCC | ATCC CRL-9609 | ||
| cellules épithéliales primaires humaines des petites voies respiratoires | ATCC | ATCC PCS-300-030 | |
| LSRII cytomètre en flux | BD Biosciences | ||
| Microscope confocal Nikkon | Nikkon | ||
| OD | USA Scientific | ||
| Amorces PCR | ITD | ||
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC ATCC | 47085 | PAO1-LAC |
| Pseudomonas fluorescens Migula | ATCC | ATCC 27853 | P.aeruginosa GFP |
| Cigarettes de qualité recherche (3R4F) | Université du Kentucky | TP-7-VA | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
| Transprent PET Transwell Insert | Corning Costar | ||
| Tryptic Bouillon de soja | BD Biosciences |
Références
- Vogelmeier, C. F., et al. Global Strategy for the Diagnosis, Management, and Prevention of Chronic Obstructive Lung Disease 2017 Report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
- Malhotra, J., Malvezzi, M., Negri, E., La Vecchia, C., Boffetta, P.
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Réimpressions et autorisations
