Ici, nous introduisons et décrivons des méthodologies largement accessibles utilisant certains modèles de nématodes polyvalents, y compris la nécrose induite par le canal ione hyperactivé et la neurotoxicité induite par l’agrégat de protéines, pour surveiller et disséquer les fondements cellulaires et moléculaires des maladies neurodégénératives associées à l’âge.
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Article de méthode
Modélisation des maladies neurodégénératives associées à l’âge à Caenorhabditis elegans
Dans cet article
Résumé
Résumé
Lutter contre les pathologies neurodégénératives humaines et gérer leur impact socio-économique omniprésent devient une priorité mondiale. Malgré leurs effets néfastes sur la qualité de la vie humaine et le système de santé, la majorité des troubles neurodégénératifs humains restent incurables et non évitables. Par conséquent, le développement de nouvelles interventions thérapeutiques contre de telles maladies devient une urgence urgente. La détérioration des circuits et de la fonction neuronales associé à l’âge est conservée évolutionnellement dans des organismes aussi divers que le ver faible Caenorhabditis elegans et les humains, ce qui signifie des similitudes dans les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents. C. elegans est un modèle génétique hautement malléable, qui offre un système nerveux bien caractérisé, la transparence du corps et un répertoire diversifié de techniques génétiques et d’imagerie pour évaluer l’activité neuronale et le contrôle de la qualité pendant le vieillissement. Ici, nous introduisons et décrivons des méthodologies utilisant certains modèles de nématodes polyvalents, y compris la nécrose induite par le canal d’ion hyperactivé (p. ex., deg-3(d) et le mec-4(d)) et l’agrégat protéique (p. ex., la nécrose induite par la α-syuncleine et le poly-glutamate) pour surveiller et disséquer les fondements cellulaires et moléculaires de la rupture neuronale liée à l’âge. Une combinaison de ces modèles de neurodégénérescence animale, ainsi que des écrans génétiques et pharmacologiques pour les modulateurs de la mort cellulaire, permettra de comprendre sans précédent la dégradation de la fonction neuronale liée à l’âge et fournira des informations critiques ayant une grande pertinence pour la santé humaine et la qualité de vie.
Introduction
Au cours des deux dernières décennies, C. elegans a été largement utilisé comme un organisme modèle pour étudier les mécanismes moléculaires de la mort des cellules nécrotiques. C. elegans offre un système nerveux exceptionnellement bien caractérisé et cartographié, une structure corporelle transparente et un répertoire diversifié de méthodes génétiques et d’imagerie pour surveiller la fonction cellulaire in vivo et la survie tout au long du vieillissement. Ainsi, plusieurs modèles génétiques de neurodégénérescence de C. elegans ont déjà été développés pour évaluer la viabilité neuronale. En particulier, les modèles de nématodes bien décrits et utilisés comprennent la nécrose induite par le canal d’ions hyperactif1,2,3 et la mort cellulaire déclenchée par l’agrégation accrue deprotéines 4,5,6,7,8,9,10 et coup de chaleur11,12, entre autres.
L’exposition à court terme aux températures sub létales a conféré une résistance contre la mort des cellules nécrotiques, déclenchée par un stress thermique subséquent à la fois dans les nématodes et les neurones mammifères11. Fait intéressant, le préconditionnement quotidien des nématodes à une température élevée douce protège contre la neurodégénérescence, qui est infligée par divers stimuli, tels que le déséquilibre ionique (p. ex., mec-4(u231) et/ou deg-3(u662)) et l’agrégation de protéines (p. ex., α-synucléine et polyQ40)11,13.
Ici, nous décrivons des méthodologies polyvalentes utilisant C. elegans pour surveiller et évaluer la neurodégénérescence dépendante de l’âge dans des modèles bien établis de maladies humaines, telles que la mort cellulaire déclenchée par l’excitotoxicité, la maladie de Parkinson et la maladie de Huntington. En outre, nous soulignons le rôle neuroprotecteur de la condition préalable à la chaleur dans plusieurs modèles de neurodégénérescence. Une combinaison de ces techniques ainsi que des écrans génétiques et/ou pharmacologiques se traduira par l’identification et la caractérisation de nouveaux modulateurs de la mort cellulaire, avec un intérêt thérapeutique potentiel.
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Protocole
1. Mort de cellules nécrotiques induites par des canaux ions hyperactifs
NOTE : Les mutations de gain-de-fonction dans la famille de gènes des degenerines, y compris le mec-4 et le dég-3 entre autres, ont comme résultats dans la génération de canaux ioniques hyperactifs déclenchant la mort des cellules nécrotiques de six neurones récepteurs tactiles requis pour la mécanosensation chez les vers3. La nécrose induite par la stimulation aberrante des dégénérines présente plusieurs similitudes mécanistes et morphologiques à l’excitotoxicité chez les mammifères. Le maintien du métabolisme énergétique et de l’homéostasie du calcium a un rôle crucial sur la survie neuronale pendant la nécrose11. Les souches suivantes peuvent être utilisées pour surveiller la mort des cellules nécrotiques déclenchées par des canaux ioniques hyperactifs, mec-4(u231)X et deg-3(u662)V.
- Entretien, synchronisation et préparation des vers mutants pour l’examen de la mort des cellules nécrotiques
- Jour 1 : Choisissez des larves L4 de mec-4(u231) ou deg-3(u662) de nématodes mutants sur les médias de croissance de Nématode (NGM; Tableau 1) plaques ensemencées avec Escherichia coli (OP50) à l’aide d’un stéréomicroscope disséquant.
- Placer 10 nématodes L4 par plaque NGM ensemencée et les cultiver à la température standard de 20 °C.
- Jour 5 : Laver les plaques avec 1 ml de tampon M9 (tableau 1) et recueillir les animaux dans un tube de 1,5 mL.
- Centrifugeuse à 10 000 x g pour 30 s et retirer le supernatant.
- Ajouter 0,5 mL de solution de blanchiment (7 mL de H2O, 1 mL de 5 N NaOH et 2 mL d’eau de Javel).
REMARQUE : La solution de blanchiment perd peu à peu son efficacité; par conséquent, il doit être préparé tous les jours. - Vortex et surveiller périodiquement jusqu’à ce que les vers se soient dissous.
REMARQUE : Évitez le blanchiment pendant des périodes de plus de 5 min parce que la viabilité des embryons sera affectée. - Centrifugeuse à 10 000 x g pour 30 s et retirer le supernatant.
- Laver deux fois le granulé (oeufs) avec 1 mL de tampon M9.
- Après le lavage, resuspendez les œufs dans 200 μL de tampon M9 et incuber pendant 25 min à 34 °C dans un bain d’eau.
- Maintenir un groupe distinct d’échantillons témoins (oeufs) à 20 °C.
- Pipette 100 μL d’œufs témoins ou traités par choc thermique et placez-les sur des plaques NGM non ensemencées. Chaque assiette contient au moins 100-200 œufs.
- Incubé les œufs à 20 °C jusqu’à l’éclosion.
- Le montage des larves de L1 pour examen à l’aide d’un contraste différentiel d’interférence (DIC; Nomarsky) microscopie
- Préparer 2% de coussinets agarose.
- Utilisez 1 mL de tampon M9 pour laver les plaques et recueillir les nématodes des larves de L1 dans des tubes de 1,5 mL.
- Centrifugeuse à 10 000 x g pour 30 s.
- Retirer le supernatant et conserver le granulé (nématodes).
- Ajouter 100 μL de tampon M9/levamisole de 20 mM pour anesthésier les nématodes.
REMARQUE : Évitez l’azide de sodium comme anesthésique. L’azide de sodium déclenche des dommages mitochondriaux et un stress oxydatif conduisant éventuellement à l’induction de la mort cellulaire - Pipette 10 μL de tampon M9/levamisole contenant des vers L1 et les monter sur des coussinets d’agarose à 2 % (tableau 1).
- Placez délicatement un couvercle sur le dessus de l’échantillon.
REMARQUE : Sceller le couvercle avec du vernis à ongles pour préserver l’humidité tout au long du processus d’imagerie. - Observer les vers à l’aide d’un contraste d’interférence différentielle (DIC; Nomarsky) microscopie.
- Score neurodégénérescence des six neurones récepteurs tactiles en comptant les cellules avec l’apparence vacuolated caractéristique par nématode.
2. Neurodégénérescence induite par l’agrégat protéique
REMARQUE : Les souches suivantes peuvent être utilisées pour étudier la neurotoxicité induite par les agrégats protéiques : (A) surexpression de l’α-synucléine humaine dans les neurones dopaminergiques, UA44: Est[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP] et (B) surexpression de la protéine de polyglutamine humaine (PolyQ) pan-neuronally, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]6,10.
- Entretien, synchronisation et préparation de nématodes transgéniques pour l’essai de neurodégénérescence
- Utilisez un stéréomicroscope disséquant pour surveiller le développement et la croissance de C. elegans.
- Jour 1 : Synchronisez la population de nématodes transgéniques en cueillant et en transférant 15 à 20 larves de L4 de chaque souche sur des plaques de NGM fraîchement ensemencées op50.
REMARQUE : Utilisez au moins trois plaques de chaque souche par condition. - Incuber et laisser pousser les nématodes à la température standard de 20 °C.
- Jour 2 : Effectuer des conditions préalables quotidiennes pendant 30 minutes en transférant les plaques dans un incubateur réglé à 34 °C. Ensuite, renvoyez les nématodes préconditionnés à la température standard de 20 °C.
REMARQUE : Différents milieux génétiques peuvent être sensibles à la température élevée pendant de longues périodes d’exposition. - (A) Si l’étude de la surexpression de l’homme α-synucléine dans les neurones dopaminergiques, UA44: Est[baIn1; pdat-1α-syn, pdat-1GFP]: le jour 9, surveiller 7 jours-vieux nématodes transgéniques pour la mort des cellules neuronales dopaminergiques.
- (B) Si l’étude de la surexpression de la protéine de polyglutamine humaine (PolyQ) pan-neuronalally, AM101: rmsIs110[prgef-1Q40::YFP]: le jour 5, mesurer les agrégats neuronaux PolyQ dans la région de la tête des animaux transgéniques 4 jours exprimant Q40::YFP.
- Montage des échantillons pour examen microscopique
- Préparer 2% de coussinets agarose (Tableau 1).
- Ajouter 10 μL de 20 mM M9/levamisole goutte tampon au centre de la garniture agarose.
- Choisissez les nématodes transgéniques respectifs et transférez-les dans une goutte de M9/levamisole.
REMARQUE : Placez 20 à 30 nématodes par goutte. - Placez délicatement un couvercle sur le dessus de l’échantillon.
REMARQUE : Sceller le couvercle avec du vernis à ongles pour préserver l’humidité tout au long du processus d’imagerie. - Procéder à l’examen microscopique des échantillons respectifs.
- Processus d’acquisition et analyse de données des nématodes transgéniques co-exprimant la GFP α-synucléine et cytosolique dans les neurones dopaminergiques
- Utilisez un microscope à épifluorescence combiné à une caméra (p. ex., EVOS FL Auto 2).
- Détecter et capturer des images z-stack de la région de la tête à grossissement 20x.
- Enregistrez et collectez les images de projection d’intensité maximale.
- Procédez à l’analyse des images acquises.
- Examiner les vers transgéniques pour la neurodégénérescence en marquant les caractéristiques cellulaires suivantes, (i) la perte de fluorescence des neurones exprimant GFP sous le promoteur de dat-1, (ii) neurones montrant le bêlement soma et/ou axonal, les excroissances ou la perte dendritique.
- Importer et analyser les données à l’aide d’un logiciel (p. ex., Excel).
3. Processus d’acquisition et analyse de données des nématodes transgéniques exprimant le PolyQ40 pan-neuronal fusionné avec YFP
- Utilisez un microscope à épifluorescence combiné à une caméra (p. ex., EVOS FL Auto 2).
- Détecter et capturer des images z-stack de la région de la tête à grossissement 20x.
- Enregistrez et collectez les images de projection d’intensité maximale.
- Procéder à l’analyse des images acquises à l’aide du logiciel Fidji.
- Images ouvertes avec fidji programme14.
- Sélectionnez Commande Split Channels via le menu déroulant Image et Couleur.
REMARQUE : Conservez l’image du canal vert. - Utilisez l’outil de sélection à main levée pour définir manuellement la région fluorescente d’intérêt (ROI, p. ex., tête).
- Ajoutez le roi respectif dans le gestionnaire de retour sur investissement via le menu déroulant Analyser et outils.
- Soustrayez l’arrière-plan à 50 % en sélectionnant Processus et Soustraire l’arrière-plan.
- Configurer et appliquer des valeurs de seuil via la commande de menu Image | Ajuster | Seuil. Conservez et définissez les mêmes valeurs de seuil tout au long de l’analyse d’image de l’ensemble de l’expérience.
- Sélectionnez le ROI respectif dans le Gestionnaire de retour sur investissement.
- Analyser le nombre d’agrégats de protéines à l’aide de la commande de menu Analyser et analyser les particules.
- Répétez les étapes 3.5-3.12 pour chaque image acquise.
- Copiez les valeurs d’affichage de la fenêtre Résultats séparé.
- Collez/importez et analysez les résultats à l’aide d’un package logiciel.
4. Analyse statistique du rapport
- Utilisez au moins 30 nématodes pour chaque condition expérimentale. Effectuer trois répliques biologiques.
- Utiliser un logiciel d’analyse statistique pour effectuer le test t-étudiant(comparaison entre deux groupes) ou ANOVA (comparaison entre plusieurs groupes) pour l’analyse statistique avec p < 0,05 comme significatif.
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Résultats
Mort cellulaire nécrotique induite par des canaux ions hyperactifs
À l’aide des procédures présentées ici, les embryons mutants mec-4(u231) et deg-3u662) ont été incubés pendant 25 min à 34 °C ou conservés à la température normale de 20 °C. Lors de l’éclosion, le nombre de cadavres de cellules neuronales a été déterminé au stade larvaire L1 des deux groupes. La mort des cellules nécrotiques est diminuée chez les nématodes qui ont éclos à partir d’œufs sous-titrés par choc thermique (...
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Discussion
Ici, nous introduisons et décrivons des méthodologies largement accessibles pour la croissance, la synchronisation et l’examen microscopique de certains modèles polyvalents de C. elegans étudiant la neurodégénérescence âge-dépendante. En particulier, nous évaluons et disséquons les fondements cellulaires et moléculaires de la dégradation neuronale liée à l’âge en utilisant la nécrose induite par le canal d’ions hyperactivé et la neurotoxicité induite par l’agrégat de protéines1,
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.
Remerciements
Nous remercions Chaniotakis M. et Kounakis K. pour l’enregistrement vidéo et le montage. K.P. est financé par une subvention de la Fondation hellénique pour la recherche et l’innovation (HFRI) et du Secrétariat général de la recherche et de la technologie (GSRT). N.T. est financé par des subventions du Conseil européen de la recherche (ERC – GA695190 – MANNA), des programmes-cadres de la Commission européenne et du ministère grec de l’Éducation.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Agarose | Biozym | 8,40,004 | |
| AM101 : rmsIs110[prgef-1Q40 ::YFP] | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Chlorure de calcium déshydraté (CaCl2 ?2H2O) | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cholestérol | SERVA Électrophorèse | 17101.01 | |
| deg-3(u662)V ou deg-3(d) | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Maintenir les animaux à 20 ° ; Microscope C | |
| DIC (Nomarsky) | Stéréomicroscope de dissection Zeiss | Axio Vert A1 | |
| Nikon Corporation | SMZ645 | ||
| Microscope à épifluorescence | Thermo Fisher Scientific | EVOS Cell Imaging Systems | |
| em/em<> OP50 souche | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Greiner Petri paraboles (60 mm x 15 mm) | Logiciel d’analyse d’images Sigma-Aldrich | P5237 | |
| Fidji | https://fiji.sc | ||
| KH2PO4 | EMD Millipore | 1,37,010 | |
| K2HPO4 | EMD Millipore | 1,04,873 | |
| Sulfate de magnésium (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| mec-4(u231)X ou mec-4(d)Centre | de Génétique Caenorhabditis (CGC) | Maintenir les animaux à 20 ° ; C | |
| Lames de microscope (75 mm x 25 mm x 1 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 10 006 12 | |
| Verre de protection de microscope (18 mm x 18 mm) | Marienfeld, Lauda-Koenigshofen | 01 010 30 | |
| Microsoft Office 2011 Progiciel Excel | Microsoft Corporation, Redmond, États-Unis | ||
| Na2HPO4 | EMD Millipore | 1,06,586 | |
| Milieu de croissance des nématodes (NGM) plaques | |||
| Solution mère de nystatine | Sigma-Aldrich | N3503 | |
| Peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Tampon | |||
| Chlorure de sodium (NaCl) | EMD Millipore | 1,06,40,41,000 | |
| Équipement standard pour la préparation des plaques de gélose ( autoclave, boîtes de Pétri, etc.) | |||
| Équipement standard pour l’entretien des vers (pic à fil de platine, incubateurs, etc.) | |||
| logiciel d’analyse statistique | GraphPad Software Inc., San Diego, États-Unis | Progiciel GraphPad Prism | |
| Streptomycine | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Chlorhydrate de tétramisole | Sigma-Aldrich | L9756 | |
| UA44 : Is[baIn1 ; pdat-1&alpha ;-syn, pdat-1GFP] | Sur demande : G. Caldwell (Université de l’Alabama, Tuscaloosa, Alabama) |
Références
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Réimpressions et autorisations
