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Acclimatation préalable à un test de tolérance à l’insuline intrapéritonéale pour atténuer l’hyperglycémie induite par le stress chez les souris conscientes

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DOI :

10.3791/61179

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22 mai 2020

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1Division of Metabolism, Endocrinology and Nutrition, VA Puget Sound Health Care System, 2Department of Medicine, University of Washington

Dans cet article

Résumé

L’élévation de la glycémie induite par le stress peut fausser l’interprétation des données dérivées d’un test de tolérance à l’insuline intrapéritonéale conscient chez la souris. Dans cet article, nous décrivons une méthode pour acclimater les souris à la manipulation, aux injections et aux prélèvements sanguins avant la réalisation du test de tolérance à l’insuline afin de limiter l’hyperglycémie induite par le stress.

Résumé

Le test de tolérance à l’insuline est couramment utilisé dans les études métaboliques pour évaluer la sensibilité à l’insuline du corps entier chez les rongeurs. Il s’agit d’un test relativement simple qui consiste à mesurer la glycémie au fil du temps après une seule injection intrapéritonéale d’insuline. Étant donné qu’il est effectué dans un état conscient et que le sang est souvent collecté via une coupe de queue, il a le potentiel de provoquer une réponse de stress chez les animaux en raison de l’anxiété associée à la manipulation et à la collecte de sang. En tant que tel, une augmentation de la glycémie induite par le stress peut se produire, ce qui rend difficile la détection et l’interprétation du critère d’évaluation principal, à savoir une réduction de la glycémie médiée par l’insuline. Cela a été observé chez de nombreuses souches de souris et est assez courant chez les souris diabétiques db/db, où les niveaux de glucose peuvent augmenter, plutôt que diminuer, après l’administration d’insuline. Ici, nous décrivons une méthode d’acclimatation des souris à la manipulation, aux injections et aux prélèvements sanguins avant d’effectuer le test de tolérance à l’insuline. Nous constatons que cela réduit l’hyperglycémie induite par le stress et permet d’obtenir des données qui reflètent plus précisément la sensibilité à l’insuline du corps entier.

Introduction

Des tests métaboliques chez les rongeurs sont régulièrement effectués pour évaluer divers paramètres qui régulent l’homéostasie du glucose1. L’étalon-or pour évaluer l’action de l’insuline dans l’ensemble du corps in vivo est la pince hyperinsulinémique-euglycémique2. Ce test implique l’administration d’insuline pour augmenter les niveaux d’insuline circulante pendant que le glucose est perfusé pour maintenir l’euglycémie. Le débit de perfusion de glucose nécessaire pour maintenir l’euglycémie est indicatif de l’action de l’insuline. Bien qu’il s’agisse d’un outil puissant dans la recherche métabolique, la technique de la pince chez la souris est techniquement difficile et demande beaucoup de main-d’œuvre, et n’est donc pas bien adaptée comme outil de dépistage initial pour caractériser un phénotype métabolique. Pour ces raisons, le test de tolérance à l’insuline intrapéritonéale (ITT) plus simple est souvent choisi.

L’ITT est effectué dans l’état conscient après une période de jeûne (généralement de 4 à 6 heures). Un bolus d’insuline est administré par voie intrapéritonéale, après quoi la glycémie est surveillée pendant une période qui dure généralement 60 minutes. On s’attend à ce que la glycémie baisse en raison de la capacité de l’insuline à faciliter l’absorption du glucose dans les tissus sensibles à l’insuline ; Le degré auquel cela se produit est indicatif de l’action de l’insuline dans l’ensemble du corps. Dans certains cas, il a été démontré que le taux de glucose augmente paradoxalement, plutôt que de diminuer, après l’administration d’insuline. Ce phénomène est probablement attribué à une réponse au stress. La manipulation, les injections et les prélèvements sanguins peuvent tous induire un stress 3,4,5, entraînant l’activation de l’axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA) et du système nerveux autonome (SNA)6,7,8. Il est bien connu que l’HPA et l’ANS contribuent tous deux à l’augmentation des taux de glucose circulant 9,10,11. La présence d’une hyperglycémie induite par le stress au début d’un ITT est problématique, car elle interfère avec le taux et l’ampleur de la chute du glucose lors de l’administration d’insuline12. Cela peut conduire à des conclusions erronées concernant la présence d’une résistance à l’insuline. Ainsi, pour atténuer l’impact confondant du stress sur les niveaux de glucose pendant une ITT, nous avons développé une méthode d’acclimatation des souris à la manipulation, aux injections et aux prélèvements sanguins avant d’effectuer l’ITT.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du système de soins de santé VA Puget Sound.

REMARQUE : Les exigences locales en matière de surveillance et/ou d’intervention auprès des animaux souffrant d’hypoglycémie peuvent différer de celles décrites ici.

1. Jeûne (t= -210 min)

  1. Une fois le cycle d’obscurité terminé, transférez les souris dans une nouvelle cage avec une litière non nutritive telle que de la cellulose ou de la litière en papier (pas de litière d’épis de maïs, qui affectera les paramètres métaboliques si elle est consommée par les souris13). Fournir aux souris un accès ad libitum à l’eau tout au long de la période de jeûne. Soyez cohérent avec l’heure du jeûne de la journée et la durée entre les groupes de souris. D’après les données présentées, la nourriture a été retirée entre 0700 et 0800 heures, soit 1 à 2 heures après la fin du cycle d’obscurité.
  2. Déplacez la ou les cages à l’endroit où l’ITT sera effectué. Il doit s’agir d’un espace calme où les facteurs de stress tels que la température, le bruit, la lumière ou le mouvement sont minimisés.

2. Acclimatation (t= -150 à -60 min)

IMPORTANT : Manipulez les souris aussi doucement que possible. Évitez d’utiliser un dispositif de contention si possible.

  1. À -150 min, mesurez le poids corporel. Celui-ci sera utilisé pour calculer le volume d’insuline qui sera administré pour l’ITT.
  2. Prenez doucement la souris par la queue et posez-vous sur une surface plane tout en saisissant doucement la queue. À l’aide d’une aiguille de 20 g (ou de ciseaux chirurgicaux), faites une petite incision à l’extrémité de la queue. Une goutte de sang devrait commencer à se former sur le site.
  3. Placez la souris sur une surface lisse et dure et retenez-la doucement par la queue.
    1. Pour enregistrer la glycémie à ce moment-là, placez une goutte de sang du bout de la queue sur la bandelette de test d’un glucomètre portable. Si nécessaire, massez très doucement la queue pour obtenir une goutte de sang.
  4. Prélever 100 μL de solution saline stérile dans une seringue à insuline. Prenez la souris en l’égratignant doucement et injectez-la par voie intrapéritonéale. Notez l’heure de l’injection de solution saline.
    1. Si plusieurs souris sont étudiées, injectez-leur une solution saline à intervalles de 1 minute pour laisser le temps aux étapes suivantes ci-dessous.
  5. À 15 min après l’injection de solution saline, prenez doucement la souris par la queue. Utilisez de la gaze pour déloger doucement tout caillot sanguin sur le bout de la queue.
    1. Facultatif : Enregistrez à nouveau la glycémie à ce moment-là, comme décrit à l’étape 2.3.
  6. 30 minutes après l’injection de solution saline, prenez doucement la souris par la queue. Si vous le souhaitez, obtenez une autre mesure de la glycémie comme décrit à l’étape 2.3.
  7. Remettez la souris dans la cage et répétez l’opération pour les autres souris si nécessaire. Laisser les souris tranquilles jusqu’à -90 min.
  8. À -90 min, répétez les étapes 2.3 à 2.6, y compris la mesure de la glycémie si vous le souhaitez.
  9. Remettez la souris dans la cage, répétez l’opération pour les autres souris si nécessaire. Laissez les souris tranquilles jusqu’à l’ITT (pour laquelle la mesure de base de la glycémie est effectuée à -5 min).

3. Test de tolérance à l’insuline (t= -5 à +60 min)

  1. Préparez une solution efficace d’insuline ordinaire (ATTENTION) dans une solution saline stérile, de sorte que la dose souhaitée puisse être injectée à 4 μL/g de poids corporel.
    REMARQUE : Des précautions doivent être prises lors de la manipulation de l’insuline car une injection accidentelle peut entraîner une hypoglycémie.
  2. Préparez une solution de dextrose à 25 % (v/v) dans une solution saline stérile à avoir à portée de main au cas où les souris développeraient une hypoglycémie nécessitant une intervention.
  3. À -5 min, prenez doucement la souris par la queue. Déterminez la glycémie de base à ce moment-là, en plaçant une goutte de sang du bout de la queue sur la bandelette de test d’un glucomètre portable. Si nécessaire, massez très doucement la queue pour obtenir une goutte de sang.
  4. Prélever la solution d’insuline dans une seringue à insuline (4 μL/g de poids corporel, pour une dose typique de 0,5 à 2,0 U/kg). Prenez la souris en l’égratignant doucement et injectez-la par voie intrapéritonéale. Temps record d’injection d’insuline.
    1. Si plusieurs souris sont étudiées, injectez-leur de l’insuline à des intervalles de 1 minute pour laisser le temps de prélever du sang et d’enregistrer les données ci-dessous.
  5. À 15 minutes après l’injection d’insuline, prenez doucement la souris par la queue. Utilisez de la gaze pour déloger doucement tout caillot sanguin sur le bout de la queue. Déterminez à nouveau la glycémie à ce moment-là, comme décrit à l’étape 3.3.
  6. Remettez la souris dans la cage et surveillez les signes d’hypoglycémie (par ex. une léthargie excessive). Si les souris développent des symptômes d’hypoglycémie, mesurez la glycémie comme décrit à l’étape 5 et administrez du dextrose si nécessaire. Une souris subissant une intervention au dextrose serait retirée du protocole ITT à ce moment-là.
  7. Répétez les étapes 3.5 et 3.6 30 minutes après l’injection d’insuline.
  8. Répétez les étapes 3.5 et 3.6 45 min après l’injection d’insuline.
  9. Répétez les étapes 3.5 et 3.6 à 60 minutes après l’injection d’insuline.
  10. Remettez les souris dans leur cage domestique, contenant quelques granulés de nourriture sur le sol de la cage pour aider à se remettre de l’ITT. Continuez à surveiller pendant 30 minutes et si les souris n’ont pas retrouvé une activité/un comportement normal, suivez la procédure décrite à l’étape 3.6.
    REMARQUE : La figure 1 résume la procédure d’acclimatation et d’ITT ci-dessus.

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Résultats

Les figures 2A et 3A sont des données représentatives (données individuelles et moyennes, respectivement) montrant une augmentation paradoxale de la glycémie chez les souris diabétiques db/db dans les 15 minutes suivant l’administration d’insuline, compatible avec une hyperglycémie induite par le stress. Notez qu’aucune augmentation de la glycémie n’a été observée chez les compagnons de portée non diabétiques témoins (db/+ ou +/+) qui ont subi la même procédure....

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Discussion

La pince hyperinsulinémique-euglycémique est considérée comme l’étalon-or pour évaluer l’action de l’insuline in vivo. Des modifications apportées à la méthodologie d’exécution de la clampe ont fait en sorte que la technique a été appliquée à des souris conscientes et non retenues2 qui avaient déjà été cathétérisées à l’aide d’un système à deux cathéters14 pour permettre le prélèvement sanguin via l’artère carotide et les perfusions via la ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la subvention P30 DK-017047 des National Institutes of Health (Centre de recherche sur le diabète de l’Université de Washington, Cell Function Analysis Core) et le Département des anciens combattants des États-Unis, VA Puget Sound Health Care System (Seattle, WA). Le contenu de ce manuscrit ne représente pas les opinions du ministère américain des Anciens combattants ou du gouvernement des États-Unis.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Dextrose-50Pfizer Injectables00409-6648-16À utiliser si la souris souffre d’hypoglycémie.
Coussinets de gazeFisher Scientific22037907Pour déloger le caillot sanguin sur le bout de la queue.
GlucomètreAccu-ChekM001_usPour mesurer la glycémie.
Balanceen grammes Pour mesurer le poids corporel.
Insuline (Novolin R)Novo Nordisk0169-1833-11Pour injection.
Seringues à insulineVWRBD-329461Pour injections.
Minuterie
Stérile 20 G aiguilleVWRBD-305175Pour coupe de queue.
Saline stérileLifeshield1261699Pour injections.
Ciseaux chirurgicauxFine Science Tools14088-10Pour couper la queue.
Bandelettes de testAccu-Chek06908217001_usPour mesurer la glycémie.

Références

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  2. Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3188(2011).
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