Method Article

Apprentissage automatique supervisé pour la semi-quantification de l’ADN extracellulaire dans la glomerulonephrite

DOI:

10.3791/61180

⸱

June 18th, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, Monash University, 2Monash Micro Imaging, Monash University, 3Immunology Department, Monash Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’ADN extracellulaire (ECDNA) libéré pendant la mort cellulaire est proinflammatoire et contribue à l’inflammation. La mesure de l’ECDNA sur le site de la blessure peut déterminer l’efficacité du traitement thérapeutique dans l’organe cible. Ce protocole décrit l’utilisation d’un outil d’apprentissage automatique pour automatiser la mesure de l’ECDNA dans les tissus rénaux.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La mort cellulaire glomerulaire est une caractéristique pathologique de l’anticorps cytoplasmique associé à l’anticorps cytoplasmique anti neutrophile de myeloperoxidase (MPO-AAV). L’acide désoxyribonucléique extracellulaire (ECDNA) est libéré pendant différentes formes de mort cellulaire, y compris l’apoptose, la nécrose, la nécroptose, les pièges extracellulaires neutrophiles (NET) et la pyroptose. La mesure de cette mort cellulaire prend beaucoup de temps avec plusieurs biomarqueurs différents nécessaires pour identifier les différentes formes biochimiques de la mort cellulaire. La mesure de l’ECDNA est généralement effectuée dans le sérum et l’urine en tant que substitut pour les dommages rénaux, pas dans l’organe cible réel où la blessure pathologique se produit. La difficulté actuelle dans l’étude ecDNA dans le rein est le manque de méthodes pour la formaline tissu incorporé de paraffine fixe (FFPE) à la fois expérimentalement et dans les biopsies de rein humain archivées. Ce protocole fournit un résumé des étapes nécessaires pour tacher pour ecDNA dans le tissu FFPE (humain et murin), étancher l’autofluorescence et mesurer l’ECDNA dans les images résultantes à l’aide d’un outil d’apprentissage automatique de la segmentation disponible au public open source de Wbeka. La segmentation weka formable est appliquée à l’ECDNA dans le glomeruli où le programme apprend à classer l’ECDNA. Ce classificateur est appliqué aux images rénales acquises ultérieures, réduisant ainsi le besoin d’annotations manuelles de chaque image individuelle. L’adaptabilité de la segmentation weka formable est démontrée plus loin dans le tissu rénal de la glomerulonephrite expérimentale de murine (GN), pour identifier les NET et l’ecMPO, les contributeurs pathologiques communs au GN anti-MPO. Cette méthode fournit une analyse objective de l’ECDNA dans les tissus rénaux qui démontre clairement l’efficacité dans laquelle le programme de segmentation Weka moyenisable peut distinguer l’ECDNA entre les tissus rénaux normaux sains et les tissus rénaux malades. Ce protocole peut facilement être adapté pour identifier l’ECDNA, les NET et l’ecMPO dans d’autres organes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’anticorps cytoplasmique anti neutrophile de myéloperoxydase associé à la vasculite (MPO-AAV) est une maladie auto-immune qui entraîne une insuffisance rénale causée par une lésion glomerulaire pathologique avec une mort cellulaire considérable et la libération d’acide désoxyribonucléique (ADN)1,2. L’ADN peut activer le système immunitaire en agissant comme un signal de danger. Dans des conditions normales et saines, l’emplacement nucléaire de l’ADN offre une protection contre l’exposition au système immunitaire. L’auto-ADN qui est libéré extracellulairement pendant les processus pathogènes ou l’autoimmunité est considéré par le système immunitaire comme un puissant dommage proinflammatoire associé à l’auto-protéine moléculaire (DAMP)3. L’ADN cellulaire supplémentaire (ECDNA) est libéré des cellules mourantes par plusieurs mécanismes distincts qui sont régis par des voies biochimiques distinctes, telles que l’apoptose, la nécroptose neutrophile formation de piège extracellulaire (NET), la nécrose ou la pyroptose4,5,6,7,8.

Nous décrivons ici des méthodes pour tacher et mesurer l’ecDNA libéré des cellules mourantes dans des sections de formaline fixe paraffine incorporée (FFPE) des biopsies expérimentales anti-MPO GN et rénales de patients atteints de MPO-AAV9,10. Il existe de multiples méthodes pour la détection de l’ADN double brin circulant (ADN) et des complexes d’ADN à la fois du sérum et de l’urine et des essais in vitro11,12. Ces méthodes, bien qu’exactes pour déterminer la quantité d’ECDNA, ne déterminent pas où l’ECDNA est libéré anatomiquement. Il existe des méthodes qui décrivent la mesure spécifique de l’ECDNA comme le tunel pour l’apoptose et la mesure des débris cellulaires13,14. Il n’y a aucune méthode qui décrit la mesure ecDNA a culminé de toutes les formes de mort cellulaire dans les reins de FFPE où les dommages pathologiques se produisent. Ceci est important pour déterminer si les traitements thérapeutiques expérimentaux effacent l’ECDNA des sites de lésion pathologique dans l’organe cible réel.

L’acquisition de plusieurs images à partir d’échantillons de rein crée un volume élevé de données qui est analysée couramment par un seul utilisateur. Il s’agit d’un travail intensif, long et peut être soumis à une reproductibilité peu fiable par d’autres utilisateurs, en raison de biais utilisateur. La segmentation Weka formable est un plugin logiciel open-source pour ImageJ qui utilise des outils bioinformatiques de pointe pour classer les pixels à l’aide d’algorithmes d’apprentissage automatique15,16. Cette méthode est « er entraîn » par laquelle elle apprend de la classification par l’utilisateur des segments de pixels et applique la nouvelle classification apprise à d’autres images. Cette méthode s’appuie sur des outils d’analyse communs dans le programme ImageJ qui sont utilisés pour « classer » chaque pixel dans un segment comme appartenant à une « classe » spécifique. Une fois que le programme apprend les « classificateurs », ils peuvent être utilisés pour identifier d’autres segments classifiés similaires au sein d’une même image. Ce modèle est ensuite enregistré et appliqué à d’autres ensembles d’images dans la même expérience.

Les obstacles actuels à la détermination de l’ecDNA in situ dans les sections rénales sont l’autofluorescence endogène de la fixation dans la formaline et l’analyse à forte intensité de main-d’œuvre des images. Nous décrivons ici comment éteindre cette autofluorescence, détecter l’ECDNA, et utiliser l’apprentissage automatique supervisé pour la mesure à haut débit de l’ECDNA. Nous avons déjà publié la mesure des NET et du MPO extracellulaire (ecmPO) à l’aide d’une macro dans ImageJ, nous démontrons maintenant la semi-automatisation de ces méthodes en utilisant l’apprentissage automatique supervisé1. Nous démontrons l’adaptabilité de l’outil d’apprentissage automatique, pour classer une tache alternative pour les NETs et l’eCMPO dans la même image. Ces méthodes de coloration décrites ici pour détecter l’ECDNA, les NET et l’ecMPO peuvent être traduites vers d’autres organes et maladies solides où l’ECDNA, les NETS et l’ecMPO jouent un rôle dans la perpétuation de maladies telles que la polyarthrite rhumatoïde et le lupus17,18.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette méthode permet la détection de pan ecDNA à partir de toutes les formes de mort cellulaire. La même méthode et les mêmes anticorps sont utilisés pour les tissus de biopsie rénale humaine (à partir de l’étape 4). Tous les sujets animaux et humains ont reçu l’approbation de l’Éthique de l’Université Monash et de Monash Health, Clayton, Victoria, Australie.

1. Coloration pour ecDNA avec DAPI et β-Actin

  1. Induire un modèle de 20 jours de glomerulonephrite anti-myeloperoxidase (anti-MPO-GN) chez les souris C57/Bl6 âgées de 8 à 10 semaines, avec des commandes9.
    1. Euthanasier les souris humainement à l’aide d’une chambre CO2.
    2. Retirez les reins en faisant une incision antérieure à travers la peau avec des ciseaux, puis coupez soigneusement le péritoine et épinglez sur une planche de dissection. L’utilisation de forceps repousse le fascia rénal antérieur et le péritoine pariétal et coupez le rein libre en coupant l’uretère et les vaisseaux sanguins (artère rénale et veine) au bassin rénal. Retirer avec des forceps et couper les reins en deux (plan sagittal) avec un scalpel de taille 22.
    3. Placez le rein dans la fixative (4% de formaline tamponnée) pendant 16 heures à température ambiante (RT). Retirer et tremper les reins fixes dans 30 % d’éthanol pendant 24 heures avant le traitement.
  2. Traiter les reins à l’aide d’un cycle standard de 6 heures :
    70% d’éthanol pendant 15 min
    90% d’éthanol pendant 15 min
    100% éthanol pendant 15 min
    100% éthanol pendant 20 min
    100% éthanol pendant 25 min
    100% éthanol pendant 30 min
    Xylène pour 20 min
    Xylène pendant 30 min
    Xylène pendant 40 min
    Cire pendant 30 min
    Cire pendant 35 min
    Cire pendant 40 min
    REMARQUE : Ceci est important car les reins ne doivent pas être soumis à une exposition prolongée à la chaleur dans la cire, car il peut détruire les antigènes d’intérêt.
  3. Couper 3 sections de μm sur un microtome et monter sur des lames de microscope en verre disponibles dans le commerce recouvertes d’une charge positive. Laisser sécher toute la nuit.
  4. Mettre les lames de verre dans une grille de diapositives dans un four à 60 °C pendant 60 min.
    REMARQUE : Les étapes 1.3 et 1.4 sont cruciales pour s’assurer que les sections ne flottent pas au cours de l’étape de récupération de l’antigène.
  5. Immerger les diapositives dans deux changements de solvant (xylène ou substitut) pendant 40 min chacun, dans un capot de fumée.
  6. Réhydrater les lames dans 100 % éthanol, 100 % éthanol, 70 % éthanol pendant 5 min chacun. Laver pendant 5 min dans l’eau du robinet.
  7. Placer une plaque chauffante dans une hotte de fumée et une solution de récupération d’antigènes préboil (10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 9.0) dans une cocotte-minute. Dès que la solution de récupération de l’antigène commence à bouillir, placez les lames dans la casserole horizontalement à l’aide d’une paire de pinces et verrouillez le couvercle. Faire bouillir à haute température (équivalent à 15 psi ou 103 kPa) pendant 10 min.
    REMARQUE : Cette étape est cruciale car elle récupère l’antigène d’intérêt en démasquant l’épitope d’antigène (croisé lié par fixation de formaline) pour permettre la liaison spécifique d’anticorps épitopes la coloration suivante ne fonctionnera pas sans elle.
  8. Retirer l’autocuiseur du feu et retirer immédiatement le couvercle en tapant à froid sur le dessus du couvercle dans un évier. Laissez les diapositives équilibrer pendant 20 min dans la solution de récupération de l’antigène.
  9. Laver les lames deux fois pendant 5 min dans 0,01 M de phosphate tamponné saline (PBS) (pH 7.4) sur un shaker orbital.
  10. Utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner des cercles autour du tissu rénal en prenant soin de ne pas laisser les tissus sécher dans ce temps.
  11. Bloc de tissu dans 10% de sérum de poulet dans l’albumine de sérum bovin (BSA) /PBS (pH 7.4, 0.01 M) pendant 30 min, 60 μL par section. Ne pas laver après cette étape, mais soigneusement enlever la solution de blocage à l’aide d’une pipette de 60 μL, ne laissez pas les sections sécher.
  12. Appliquer un cocktail d’anticorps primaires pour la β-actine diluée 1/1000 dans 1% BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M), 60 μL par section et incuber toute la nuit dans une chambre d’humidité à 4 °C.
  13. Laver les diapositives deux fois pendant 5 min en PBS (pH 7,4, 0,01 M) sur un shaker orbital.
  14. Appliquer un anticorps secondaire, poulet anti lapin 488 (1/200), 60 μL par section diluée en 1%BSA/PBS (pH 7,4, 0,01 M) pendant 40 min à RT.
  15. Laver les lames deux fois pendant 5 min en PBS (pH 7,4, 0,01 M) sur un shaker orbital.
  16. Plongez les lames dans 0,3% Soudan Noir dans 70% d’éthanol pendant 30 min dans un bocal Coplin.
    REMARQUE : Cette étape est importante car elle étanche l’autofluorescence causée par la fixation de la formaline.
  17. Laver les lames dans l’eau du robinet pour enlever le précipité, puis plonger dans pbs (pH 7.4, 0.01 M) pendant 10 min pour empêcher d’autres précipités du Soudan Noir de se former.
  18. Montez les diapositives sur des couvercles de verre confocal à l’aide de trois gouttes de 60 μL de solution de montage avec DAPI et scellez les couvercles avec du vernis à ongles en appliquant autour du périmètre de la couverture.
  19. Laisser les lames guérir pendant 24 heures à RT (pour permettre au DAPI de pénétrer) puis les conserver à 4 °C à l’abri de la lumière.
    REMARQUE : Important de rester dans l’obscurité pour éviter la décoloration des sondes fluorescentes.
  20. Diapositives d’image utilisant une tête de balayage de laser confocale attachée à un microscope. Excite glisse avec le laser 405 pour DAPI et le Laser 488 pour Beta Actin. Capturez des images monoplaces 1024 x1024 pixels à l’aide d’une capture séquentielle en ligne et d’une moyenne en 4 lignes, ce qui est essentiel pour détecter l’ECDNA. 40x 1.0 L’objectif d’huile de NA est utilisé.
    1. Imagez un minimum de 20 glomeruli par échantillon. Enregistrez des images sous forme de fichiers ND2.

2. Analyse DAPI et β-Actin

  1. Installer ImageJ : https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Vérifiez que la segmentation Weka trainable est disponible sous Plugins | Segmentation | Segmentation Weka trainable.
  3. Déposez l’image sur la barre d’outils ImageJ. Cliquez sur Image | Couleur | Split Channels. Une image avec DAPI en bleu tachant tous les noyaux apparaîtra et 1 image avec β-actine en vert apparaîtra, qui délimite le glomeruli.
    1. Créer un fichier fusionné des images simples pour dessiner une région d’intérêt (ROI) pour le glomerulus en cliquant sur Couleur | Fusionner les canaux. Une boîte contextuele vous demandera d’attribuer une couleur à chaque canal. Après avoir attribué une couleur à chaque canal, cochez la zone Créer un composite et la zone Conserver des images sources, puis cliquez sur Ok. Une image composite fusionnée s’affiche.
    2. En utilisant la coloration β-actine comme guide, dessinez un retour sur investissement autour de la touffe glomerulaire. Gardez cette image de côté pour utiliser le retour sur investissement à la fin de ce protocole.
  4. Effectuez un flou gaussien sur l’image DAPI bleue unique. Cliquez sur Processus | Filtres | Gaussian Blur, mis en 1-2.00. L’image aura maintenant l’air un peu floue, mais les noyaux sont maintenant lisses et le fond adouci.
    REMARQUE : Cette étape est préformée pour supprimer le bruit afin de nettoyer l’image des artefacts qui peuvent empêcher la détection pertinente des attributs d’image à analyser.
  5. Cliquez sur Plugins | Segmentation | Segmentation Weka trainable.
  6. À l’aide de l’outil de ligne de la barre d’outils dans ImageJ, tracez d’abord les noyaux intacts à l’aide des outils à main libre (il existe des options d’outils de ligne, circulaire et carrée disponibles) puis ajoutez à ajouter la boîte Ajouter la classe 1.
  7. À l’aide de l’outil de ligne de la barre d’outils dans ImageJ, délimiter les zones d’arrière-plan de la zone classe 2.
  8. Cliquez sur l’étiquette du bouton Créer une nouvelle classe dans la fenêtre de segmentation Weka et sur l’étiquette « ecDNA ». Utilisez l’outil de ligne (à partir de la barre d’outils ImageJ) pour délimiter l’ADN extranucléaire taché par DAPI.
  9. Cliquez sur le bouton Classificateur de train dans le menu de formation dans la fenêtre de segmentation Weka trainable.
    REMARQUE : Le bouton STOP apparaîtra à la place du bouton Classificateur de train et restera jusqu’à la fin de la formation. Ne cliquez pas sur ce bouton pendant la formation car le processus sera interrompu.
  10. Cliquez sur le bouton Créer un résultat pour créer une image avec tous les composants classifiés, composé de noyaux intacts, l’arrière-plan et l’ecDNA identifié.
  11. Cliquez sur le bouton Obtenir des probabilités. Basculez la souris pour donner une image en noir et blanc de toutes les classes avec l’objet de sélection mis en évidence en blanc.
  12. Dupliquer cette image en cliquant sur Image | Dupliquer.
  13. Basculez à l’écran à l’aide du bouton de la souris qui contient l’ecDNA. Appliquez un seuil pour obtenir uniquement ce qui a été identifié comme ecDNA. Cliquez sur Appliquer lorsque le seuil est suffisant.
  14. Si après le seuil, il y a plus de zones d’ADN qui ne sont pas ecDNA, revenir à l’image d’origine formée, ajouter plus de classificateurs, et répéter les étapes 2.1-2.13.
  15. Cliquez sur Image | Ajustement de l’image | Faire binaire. Copiez le roi glomerulaire effectué à l’étape 2.3 et cliquez sur Ctrl+Maj+E. Activer la fenêtre Weka par Modifier | Sélections | Restaurer, qui restaure la sélection. Cliquez sur Analyser les particules, qui mesurera uniquement les particules ecDNA dans le glomerulus.
    REMARQUE : Une feuille de résultats est calculée avec le nombre de particules, la zone, les pixels moyens et le pourcentage du glomerulus contenant l’ecDNA. Ces résultats peuvent être exportés dans une feuille de calcul et enregistrés, pour une analyse statistique ultérieure.
  16. Enregistrez le classificateur en tant que classificateur ecDNA.classifier en cliquant sur Enregistrer le classificateur du menu options dans l’application ImageJ sur le Bureau. Cliquez ensuite sur Enregistrer les données dans le menu options et enregistrer en tant qu’ecDNA.arff dans le dossier ImageJ. Le retour sur investissement devra être ajouté manuellement chaque fois que la taille et la forme glomerulus changeront, mais le programme a appris ce qu’est l’ECDNA.
  17. Pour réappliquer le modèle aux images suivantes, répétez les étapes 2.1-2.5 avec une nouvelle image. Cliquez sur Classificateur de charge dans le menu d’option, puis ecDNAmodel.classifier dans le dossier ImageJ à partir de l’étape 2.16. Le menu en rondins apparaîtra et exécutera le modèle.
  18. Une fois le modèle exécuté, cliquez sur Charger les données dans le menu Options et sélectionnez le fichier ecDNA.arff enregistré dans le dossier ImageJ à partir de l’étape 2.16. Cliquez sur Créer un résultat. Si l’image résultante n’a pas réussi à ramasser tous les noyaux, en arrière-plan ou ecDNA cliquez sur le classificateur re-train et ajouter plus de classificateurs et enregistrer le nouveau modèle. Terminez le processus d’analyse en répétant les étapes 2.9-2.16.
    REMARQUE : Plusieurs images peuvent être utilisées pour générer le modèle final utilisé pour détecter l’ecDNA. Ceci est réalisé en appliquant le modèle aux images suivantes, en ajoutant plus de classificateurs et en sauvant le nouveau modèle et les données dans le dossier ImageJ. Cela peut être particulièrement important lorsque différents échantillons ont un fond plus élevé. Le programme Weka Segmentation est également compatible avec le langage macro ImageJ qui permet à de nombreuses commandes d’être macro recordable pour automatiser certaines des étapes.

3. Mesure des pièges extracellulaires neutrophiles et ecMPO

NOTE : Cette méthode identifie les NET par colocalisation de l’ADN extracellulaire, de Citrullintinated Histones peptidyl arginase 4 (PAD4) et MPO.

  1. Induire un modèle de 20 jours de glomerulonephrite anti-myeloperoxidase (anti-MPO-GN) chez les souris C57/Bl6 âgées de 8 à 10 semaines, avec des commandes9.
    1. Euthanasier les souris humainement à l’aide d’une chambre CO2.
    2. Retirez les reins en faisant une incision antérieure à travers la peau avec des ciseaux, puis coupez soigneusement le péritoine et épinglez sur une planche de dissection. L’utilisation de forceps repousse le fascia rénal antérieur et le péritoine pariétal et coupez le rein libre en coupant l’uretère et les vaisseaux sanguins (artère rénale et veine) au bassin rénal. Retirer avec des forceps et couper les reins en deux (plan sagittal) avec un scalpel de taille 22.
    3. Placez le rein dans la fixative (4% de formaline tamponnée) pendant 16 heures à température ambiante (RT). Retirer et tremper les reins fixes dans 30 % d’éthanol pendant 24 heures avant le traitement.
  2. Traiter les reins à l’aide d’un cycle standard de 6 heures :
    70% d’éthanol pendant 15 min
    90% d’éthanol pendant 15 min
    100% éthanol pendant 15 min
    100% éthanol pendant 20 min
    100% éthanol pendant 25 min
    100% éthanol pendant 30 min
    Xylène pour 20 min
    Xylène pendant 30 min
    Xylène pendant 40 min
    Cire pendant 30 min
    Cire pendant 35 min
    Cire pendant 40 min
    REMARQUE : Les reins ne doivent pas être exposés à une exposition prolongée à la chaleur dans la cire, car ils peuvent détruire les antigènes d’intérêt.
  3. Couper 3 sections de μm sur un microtome et monter sur des lames de microscope en verre disponibles dans le commerce recouvertes d’une charge positive. Laisser sécher toute la nuit
  4. Mettre les lames de verre dans une grille de diapositives dans un four à 60 °C pendant 60 min.
    REMARQUE : Les étapes 3.3-3.4 sont cruciales pour s’assurer que les sections ne flottent pas au cours de l’étape de récupération de l’antigène.
  5. Immerger les diapositives dans deux changements de solvant (xylène ou substitut) pendant 40 min chacun, dans un capot de fumée.
  6. Réhydrater les lames dans 100 % éthanol, 100 % éthanol, 70 % éthanol pendant 5 min chacun.
  7. Laver pendant 5 min dans l’eau du robinet.
  8. Placer une plaque chauffante dans une hotte à fumée et une solution de récupération d’antigènes préboil (10 mM Tris-1 mM EDTA pH 9.0) dans un autocuiseur. Dès que la solution de récupération d’antigène commence à bouillir placer les diapositives dans la casserole horizontalement à l’aide d’une paire de pinces et verrouiller le couvercle. Faire bouillir à haute température (équivalent à 15 psi ou 103 kPa) pendant 10 min.
    REMARQUE : Cette étape récupère l’antigène d’intérêt en démasquant l’épitope d’antigène (croisé par fixation de formaline) pour permettre la liaison spécifique d’anticorps épitopes la coloration suivante ne fonctionnera pas sans cette étape.
  9. Retirer l’autocuiseur du feu et retirer le couvercle immédiatement en appuyant à froid sur le dessus du couvercle dans un évier. Laissez les diapositives équilibrer pendant 20 min dans la solution de récupération de l’antigène.
  10. Laver les diapositives deux fois pendant 5 min dans la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) (pH 7,4, 0,01 M) sur un shaker orbital.
  11. Utilisez un stylo hydrophobe pour dessiner des cercles autour du tissu rénal en prenant soin de ne pas laisser les tissus sécher dans ce temps.
  12. Bloc de tissu dans 10% de sérum de poulet dans l’albumine de sérum bovin (BSA) /PBS (pH 7.4, 0.01 M) pendant 30 min, 60 μL par section. Ne pas laver après cette étape, mais retirez soigneusement la solution de blocage à l’aide d’une pipette de 60 μL. Ne laissez pas les sections sécher.
  13. Faire un cocktail des anticorps primaires dilués dans 1%BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) dans 1 tube. Appliquer 60 μL par section rénale. La concentration des anticorps primaires est la suivante :
    Lapin anti humain/souris H3Cit 1/100
    Souris anti humain/souris PAD4 1/50
    Chèvre anti humain/souris MPO 1/200
  14. Incuber toute la nuit à 4 °C dans une chambre d’humidité.
  15. Laver les diapositives deux fois pendant 5 min en PBS (pH 7,4, 0,01 M) sur un shaker orbital.
  16. Faire un cocktail des anticorps secondaires dans 1 tube. Les anticorps secondaires sont appliqués dans 1 % BSA/PBS, 60 μL par section comme suit :
    Poulet anti lapin 488 1/200.
    Poulet anti souris 647 1/200.
    Poulet anti chèvre 594 1/200.
  17. Incuber à RT pendant 40 min.
  18. Laver les diapositives deux fois pendant 5 min en PBS (pH 7,4, 0,01 M) sur un shaker orbital.
  19. Appliquer un anticorps secondaire 1:200 en 1%BSA/PBS (pH 7.4, 0.01 M) pendant 40 min à RT 60 μL par section.
  20. Laver les diapositives deux fois pendant 5 min en PBS (pH 7,4, 0,01 M) sur un shaker orbital.
  21. Plongez des diapositives dans 0,3% Soudan Noir dans 70% d’éthanol pendant 30 min.
  22. Laver les diapositives dans l’eau du robinet pour enlever le précipité, puis plonger dans pbs (pH 7,4, 0,01 M) pendant 10 min pour empêcher la formation d’un nouveau précipité du Soudan noir.
  23. Montez les diapositives sur des couvercles de verre confocal à l’aide de trois gouttes de 60 μL de solution de montage avec DAPI. Sceller les couvercles avec du vernis à ongles en appliquant autour du périmètre de la couverture.
  24. Laisser les lames guérir pendant 24 heures à RT (pour permettre au DAPI de pénétrer) puis les conserver à 4 °C à l’abri de la lumière. Restez dans l’obscurité pour éviter la décoloration des sondes fluorescentes.
  25. Diapositives d’image utilisant une tête de balayage de laser confocale attachée à un microscope. Excitez les diapositives avec le laser 405 pour DAPI et le Laser 488 pour H3Cit, 561 pour MPO et 647 pour PAD4. Capturez des images monoplaces 1024x1024 pixels à l’aide d’une capture séquentielle en ligne et d’une moyenne en 4 lignes, ce qui est essentiel pour détecter l’ECDNA. Utilisez un objectif d’huile NA 40x 1.0. Imagez un minimum de 20 glomeruli par échantillon. Enregistrez des images sous forme de fichiers ND2.

4. Pièges extracellulaires neutrophiles et analyse ecMPO

  1. Installer ImageJ : https://imagej.net/Fiji/Downloads.
  2. Vérifiez que la segmentation Weka trainable est disponible sous Plugins | Segmentation | Segmentation Weka trainable.
  3. Déposez l’image dans ImageJ. Cliquez sur Image | Couleur | Split Channels. Une image avec DAPI en bleu tachant tous les noyaux apparaîtra, une image avec H3Cit en vert, une image avec MPO en rouge, et une image avec PAD4 en blanc apparaîtra.
    1. Créer un fichier fusionné des images simples pour dessiner un retour sur investissement pour le glomerulus en cliquant sur Couleur | Fusionner les canaux. Une boîte contextuele vous demandera d’attribuer une couleur à chaque canal. Après avoir attribué une couleur à chaque canal, cochez la zone Créer un composite et la zone Conserver des images sources, puis cliquez sur Ok. Une image fusionnée s’affiche. Contrairement au protocole pour ecDNA précédemment, nous allons utiliser l’image composite pour effectuer le reste des étapes.
  4. Exécutez un flou gaussien sur l’image composite. Cela permet de lisser les noyaux. Cliquez sur Processus | Filtres | Gaussian Blur, mis en 1.00-2.00. L’image aura maintenant l’air un peu floue, mais les noyaux sont maintenant lisses et le fond adouci.
    REMARQUE : Cette étape est préformée pour supprimer le bruit afin de nettoyer l’image des artefacts qui peuvent empêcher la détection pertinente des attributs d’image à analyser.
  5. Cliquez sur Plugins | Segmentation | Segmentation Weka trainable. Une toute nouvelle fenêtre apparaîtra avec l’image à analyser et les outils de menu spécifiques à la segmentation Weka.
  6. À l’aide de l’outil de ligne de la barre d’outils (dans ImageJ), tracez d’abord les noyaux intacts non positifs pour les 4 composants NET (MPO, PAD4, DAPI et H3Cit) à l’aide de l’outil main libre, puis ajoutez à la zone Ajouter la classe 1.
  7. À l’aide de l’outil de ligne de la barre d’outils ImageJ, délimiter les zones d’arrière-plan de la zone classe 2.
  8. Cliquez sur l’étiquette du bouton Créer une nouvelle classe dans le menu étiquette et sur l’étiquette « ET ». Utilisez l’outil de ligne pour délimiter les FILETS identifiés comme des dipis co-localisation (bleu), MPO (rouge), PAD4 (blanc) et citrullinés histones (vert).
  9. Cliquez sur l’étiquette du bouton Créer une nouvelle classe dans le menu de l’étiquette et sur l’étiquette « ecMPO ». Utilisez l’outil de ligne pour délimiter MPO (rouge) qui est sans cellule.
  10. Cliquez sur le bouton Classificateur de train dans le menu formation de la fenêtre Segmentation Weka trainable.
    REMARQUE : Le bouton STOP apparaîtra à la place du bouton Classificateur de train et restera jusqu’à la fin de la formation. Ne cliquez pas sur ce bouton pendant la formation et le processus sera interrompu.
  11. Cliquez sur le bouton Créer un résultat dans le menu formation et une image est créée avec tous les composants classifiés, composé de noyaux intacts, l’arrière-plan et ce qui a été identifié comme ecMPO.
  12. Cliquez sur le bouton Obtenir des probabilités dans le menu formation. Basculez la souris pour donner une image en noir et blanc de toutes les classes avec l’objet de sélection mis en évidence en blanc.
  13. Dupliquer à la fois la probabilité NET et l’image de probabilité ecMPO en cliquant sur Image | Dupliquer.
  14. Basculez à l’écran à l’aide du bouton de la souris qui contient des NET. Appliquer un seuil pour s’assurer que la mise en évidence des NET identifiés. Dans la barre d’outils du menu ImageJ, cliquez sur Image | Ajuster | Seuil. Déplacez les barres de bascule coulissantes jusqu’à ce que les composants NET soient mis en surbrillance. Cliquez sur Appliquer lorsqu’il est satisfait du seuil. Répétez les mêmes étapes pour ecMPO.
  15. Si, après le seuil, il y a encore des zones de détection des ECMPO ou des NET, retournez à l’image d’origine et ajoutez d’autres classificateurs et réappliquez les étapes 4.1-4.14.
  16. Cliquez sur Image | Ajustement de l’image | Faire binaire. Copiez le roi glomerulaire effectué à l’étape 4.3, cliquez sur Ctrl+Maj+E. Activer la fenêtre Weka par Edit | Sélections | Restaurer, qui restaure la sélection. Cliquez sur Analyser les particules pour mesurer uniquement les particules NET dans le glomerulus.
  17. Basculez à l’écran à l’aide du bouton de la souris qui contient ecMPO. Appliquer un seuil pour vous assurer que seuls les ecMPO identifiés sont obtenus. Cliquez sur Appliquer lorsqu’il est satisfait du seuil. Répétez l’étape 4.16 ci-dessus.
    REMARQUE : Une feuille de résultats est calculée avec le nombre de particules, la zone, les pixels moyens et le pourcentage du glomerulus contenant à la fois des NET et de l’eCMPO. Ces résultats peuvent ensuite être mis dans une feuille de calcul et enregistrés, pour une analyse statistique ultérieure.
  18. Enregistrez le classificateur en tant que nets.classifier en cliquant sur Enregistrer le classificateur du menu options et enregistrez le fichier dans l’application ImageJ sur le bureau (dossier ImageJ). Cliquez ensuite sur Enregistrer les données dans le menu options et enregistrer en tant que fichier NETs.arff. Le roi glomerulaire devra être ajouté manuellement à chaque fois que la taille et la forme glomerulus changeront, mais le programme a appris ce que sont les NET et l’eMPO.
  19. Pour réappliquer le modèle aux images suivantes, répétez les étapes 4.1-4.5 avec une nouvelle image. Cliquez sur Classificateur de charge dans le menu d’option. Cliquez sur Nets.classificateur dans le dossier ImageJ. Le menu journal apparaît et exécute le modèle, une fois que le modèle a exécuté cliquez sur Charger des données dans le menu options et sélectionnez le fichier NETs.arff.
    1. Cliquez sur Créer un résultat. Si l’image résultante n’a pas réussi à ramasser tous les noyaux, en arrière-plan ou ecDNA cliquez sur le classificateur re-train et ajouter plus de classificateurs et enregistrer le nouveau modèle. Terminez le processus d’analyse en répétant les étapes 4.11-4.19.
      REMARQUE : Plusieurs images peuvent être utilisées pour générer le modèle final utilisé pour détecter les ECDNA, les ecMPO et les NET. Ceci est réalisé en appliquant le modèle aux images suivantes, en ajoutant plus de classificateurs et en sauvant le nouveau modèle et les données dans le dossier ImageJ. Cela peut être particulièrement important lorsque différents échantillons ont un fond plus élevé. Le programme De segmentation Weka est compatible avec le langage macro ImageJ qui permet à de nombreuses commandes d’être macro recordable pour automatiser certaines des étapes.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces images représentent les multiples étapes nécessaires pour utiliser avec succès la segmentation weka formable pour minimiser la mesure manuelle à forte intensité de main-d’œuvre de l’ecDNA dans le tissu rénal ffpe fluorescent d’une souris avec anti-MPO GN induit. Ces étapes sont résumées à la figure 1 et à la figure 2 avec des images prises directement du programme de segmentation Weka, décrivant chaque étape du processus d’an...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il existe de multiples protocoles qui mesurent les marqueurs proinflammatoires dans le sérum et l’urine des patients et des modèles de souris de glomerulonephrite. Ce protocole décrit permet l’analyse des produits de la mort cellulaire (ecDNA, NETs et ecMPO) dans le glomerulus directement. Les étapes les plus cruciales de ce protocole sont la préparation et l’imagerie des tissus. Le principal élément limitant de l’utilisation d’une méthode de coloration fluorescente pour l’analyse est l’autofluorescence des tissus. Le ti...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous reconnaissons Monash Micro Imaging pour l’utilisation du microscope à balayage laser confocal vertical Nikon C1 et de la plate-forme d’histologie Monash pour le traitement des tissus rénaux.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Les solutions d’albumine sérique bovineSIGMAA2153à 5 % et à 1 % sont constituées de PBS, peuvent être préparées en vrac et congelées - jetées une fois décongelées.
Anticorps à absorption croisée IgG (H+L) de poulet Alexa Fluor 594ThermoFisher ScientificA-21468Tourner dans une mini-centrifugeuse pendant 1 minute avant l’utilisation pour éviter tout conjugué libre dans votre cocktail d’anticorps
Anticorps IgG (H+L) de poulet anti-souris, anticorps à absorption croisée Alex Fluor 647ThermoFisher ScientificA-121468Tourner dans une mini-centrifugeuse pendant 1 minute avant l’utilisation pour éviter tout conjugué libre dans votre cocktail
d’anticorpsPoulet anti lapin IgG (H+L) Anticorps à absorption croisée Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA-21441Tourner dans une mini centrifugeuse pendant 1 minute avant utilisation pour éviter tout conjugué libre dans votre cocktail d’anticorps
Sérum de pouletSIGMAC5405Composé de 1 % BSA/PBS
Lamelles 24 x60 mmAzerscientificES0107222#1.5 Ce n’est pas une épaisseur standard - conçu pour une utilisation en microscopie
confocaleEDTA 10mMSIGMAE6758Ajouter TRIS et EDTA ensemble dans de l’eau distillée et un pH à 9, pour la récupération de l’antigène, peut être préparé dans une solution 10x
Éthanol 30 %, 70 % et 100 %Chem SupplyUN1170Fourni sous forme d’éthanol 100 % non dénaturé - dilué à 30 % et 70 % avec de l’eau distillée
Formaldéhyde, 4 % (10 % Formalin tamponné neutre)TRAJANNBF-500Le rein est placé dans un tube de 5 ml contenant 3 ml de formol pendant 16 heures à RT, le formol doit être utilisé dans une hotte
Lames d’histologie en verre - Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mmTRAJANJ3800AM4L’utilisation de lames à revêtement chargé positif est essentielle. Nous ne recommandons pas l’utilisation de la poly-L-lysine pour le revêtement des lames, car les tissus se délogent des lames pendant l’étape de récupération de l’antigène.
DAF3667Aliquote et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée
HistosolClini PureCPL HISTOSOL 08Utilisé pur, dans des récipients de 200 ml de support de coloration, utilisation dans une hotte
Stylo hydrophobeVECTORLabs H-400Utilisation pour dessiner un cercle autour du tissu rénal
Souris anti humain/souris Peptidyl arginase 4 (PAD4)ABCAMab128086Aliquote et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée
Tête laser à balayage confocal Nikon C1 fixée au microscope inversé Nikon Ti-EAliquote scientifiqueet congélation à moins 80 degrés à l’arrivée
Saline tamponnée au phosphateSIGMAP381350,01M PB/0,09 % NaCl Maquillage jusqu’à 5L à la fois
Autocuiseur 6L Tefal secure 5 Neo stainlessTefalGSA-P2530738Acheté dans un magasin d’articles ménagers
local Prolong Gold DAPILife TechnologiesP36962Appliquer les gouttes directement sur la lamelle
Anticorps anti-actine bêta humain / souris de lapinABCAMab8227Aliquote et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée
Chien anti humain / souris Anticorps H3CitABCAMab5103Aliquote et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée
Rack de coloration 24 lamesProScitechH4465La grille de coloration choisie doit pouvoir résister à l’ébullition sous pression et à l’incubation dans un four à 60 degrés
Sudan Black BSIGMA1996640,3 % Ajouter 3g à une bouteille de 1L dans 70 % d’éthanol, filtrer et protéger de la lumière - stable pendant 6 mois à température ambiante
Tris 10mMSIGMAT4661Ajouter TRIS et EDTA ensemble dans de l’eau distillée et pH à 9, pour le prélèvement d’antigènes, peut être préparé dans une solution 10x
XyleneTrajanXL005/20Doit être utilisé dans une hotte
cohérente

References

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