Apprentissage automatique supervisé pour la semi-quantification de l’ADN extracellulaire dans la glomerulonephrite

Summary

L’ADN extracellulaire (ECDNA) libéré pendant la mort cellulaire est proinflammatoire et contribue à l’inflammation. La mesure de l’ECDNA sur le site de la blessure peut déterminer l’efficacité du traitement thérapeutique dans l’organe cible. Ce protocole décrit l’utilisation d’un outil d’apprentissage automatique pour automatiser la mesure de l’ECDNA dans les tissus rénaux.

Abstract

La mort cellulaire glomerulaire est une caractéristique pathologique de l’anticorps cytoplasmique associé à l’anticorps cytoplasmique anti neutrophile de myeloperoxidase (MPO-AAV). L’acide désoxyribonucléique extracellulaire (ECDNA) est libéré pendant différentes formes de mort cellulaire, y compris l’apoptose, la nécrose, la nécroptose, les pièges extracellulaires neutrophiles (NET) et la pyroptose. La mesure de cette mort cellulaire prend beaucoup de temps avec plusieurs biomarqueurs différents nécessaires pour identifier les différentes formes biochimiques de la mort cellulaire. La mesure de l’ECDNA est généralement effectuée dans le sérum et l’urine en tant que substitut pour les dommages rénaux, pas dans l’organe cible réel où la blessure pathologique se produit. La difficulté actuelle dans l’étude ecDNA dans le rein est le manque de méthodes pour la formaline tissu incorporé de paraffine fixe (FFPE) à la fois expérimentalement et dans les biopsies de rein humain archivées. Ce protocole fournit un résumé des étapes nécessaires pour tacher pour ecDNA dans le tissu FFPE (humain et murin), étancher l’autofluorescence et mesurer l’ECDNA dans les images résultantes à l’aide d’un outil d’apprentissage automatique de la segmentation disponible au public open source de Wbeka. La segmentation weka formable est appliquée à l’ECDNA dans le glomeruli où le programme apprend à classer l’ECDNA. Ce classificateur est appliqué aux images rénales acquises ultérieures, réduisant ainsi le besoin d’annotations manuelles de chaque image individuelle. L’adaptabilité de la segmentation weka formable est démontrée plus loin dans le tissu rénal de la glomerulonephrite expérimentale de murine (GN), pour identifier les NET et l’ecMPO, les contributeurs pathologiques communs au GN anti-MPO. Cette méthode fournit une analyse objective de l’ECDNA dans les tissus rénaux qui démontre clairement l’efficacité dans laquelle le programme de segmentation Weka moyenisable peut distinguer l’ECDNA entre les tissus rénaux normaux sains et les tissus rénaux malades. Ce protocole peut facilement être adapté pour identifier l’ECDNA, les NET et l’ecMPO dans d’autres organes.

Introduction

L’anticorps cytoplasmique anti neutrophile de myéloperoxydase associé à la vasculite (MPO-AAV) est une maladie auto-immune qui entraîne une insuffisance rénale causée par une lésion glomerulaire pathologique avec une mort cellulaire considérable et la libération d’acide désoxyribonucléique (ADN)^1,2. L’ADN peut activer le système immunitaire en agissant comme un signal de danger. Dans des conditions normales et saines, l’emplacement nucléaire de l’ADN offre une protection contre l’exposition au système immunitaire. L’auto-ADN qui est libéré extracellulairement pendant les processus pathogènes ou l’autoimmunité ....

Protocol

Cette méthode permet la détection de pan ecDNA à partir de toutes les formes de mort cellulaire. La même méthode et les mêmes anticorps sont utilisés pour les tissus de biopsie rénale humaine (à partir de l’étape 4). Tous les sujets animaux et humains ont reçu l’approbation de l’Éthique de l’Université Monash et de Monash Health, Clayton, Victoria, Australie.

1. Coloration pour ecDNA avec DAPI et β-Actin

1. Induire un modèle de 20 jours de glomerulonephrite anti-myeloperoxidase (anti-MPO-GN) chez les souris C57/Bl6 âgées de 8 à 10 semaines, avec des commandes⁹.
   1. Euthanasier les souris humainement à l’ai....

Results

Ces images représentent les multiples étapes nécessaires pour utiliser avec succès la segmentation weka formable pour minimiser la mesure manuelle à forte intensité de main-d’œuvre de l’ecDNA dans le tissu rénal ffpe fluorescent d’une souris avec anti-MPO GN induit. Ces étapes sont résumées à la figure 1 et à la figure 2 avec des images prises directement du programme de segmentation Weka, décrivant chaque étape du processus d’an.......

Discussion

Il existe de multiples protocoles qui mesurent les marqueurs proinflammatoires dans le sérum et l’urine des patients et des modèles de souris de glomerulonephrite. Ce protocole décrit permet l’analyse des produits de la mort cellulaire (ecDNA, NETs et ecMPO) dans le glomerulus directement. Les étapes les plus cruciales de ce protocole sont la préparation et l’imagerie des tissus. Le principal élément limitant de l’utilisation d’une méthode de coloration fluorescente pour l’analyse est l’autofluorescence des tissus. Le ti.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Les solutions d’albumine sérique bovine	SIGMA	A2153	à 5 % et à 1 % sont constituées de PBS, peuvent être préparées en vrac et congelées - jetées une fois décongelées.
Anticorps à absorption croisée IgG (H+L) de poulet Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-21468	Tourner dans une mini-centrifugeuse pendant 1 minute avant l’utilisation pour éviter tout conjugué libre dans votre cocktail d’anticorps
Anticorps IgG (H+L) de poulet anti-souris, anticorps à absorption croisée Alex Fluor 647	ThermoFisher Scientific	A-121468	Tourner dans une mini-centrifugeuse pendant 1 minute avant l’utilisation pour éviter tout conjugué libre dans votre cocktail
d’anticorpsPoulet anti lapin IgG (H+L) Anticorps à absorption croisée Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-21441	Tourner dans une mini centrifugeuse pendant 1 minute avant utilisation pour éviter tout conjugué libre dans votre cocktail d’anticorps
Sérum de poulet	SIGMA	C5405	Composé de 1 % BSA/PBS
Lamelles 24 x60 mm	Azerscientific	ES0107222	#1.5 Ce n’est pas une épaisseur standard - conçu pour une utilisation en microscopie
confocaleEDTA 10mM	SIGMA	E6758	Ajouter TRIS et EDTA ensemble dans de l’eau distillée et un pH à 9, pour la récupération de l’antigène, peut être préparé dans une solution 10x
Éthanol 30 %, 70 % et 100	%Chem Supply	UN1170	Fourni sous forme d’éthanol 100 % non dénaturé - dilué à 30 % et 70 % avec de l’eau distillée
Formaldéhyde, 4 % (10 % Formalin tamponné neutre)	TRAJAN	NBF-500	Le rein est placé dans un tube de 5 ml contenant 3 ml de formol pendant 16 heures à RT, le formol doit être utilisé dans une hotte
Lames d’histologie en verre - Ultra Super Frost, Menzel Glaze, 25x75 x1.0mm	TRAJAN	J3800AM4	L’utilisation de lames à revêtement chargé positif est essentielle. Nous ne recommandons pas l’utilisation de la poly-L-lysine pour le revêtement des lames, car les tissus se délogent des lames pendant l’étape de récupération de l’antigène.
	D	AF3667	Aliquote et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée
Histosol	Clini Pure	CPL HISTOSOL 08	Utilisé pur, dans des récipients de 200 ml de support de coloration, utilisation dans une hotte
Stylo hydrophobe	VECTOR	Labs H-400	Utilisation pour dessiner un cercle autour du tissu rénal
Souris anti humain/souris Peptidyl arginase 4 (PAD4)	ABCAM	ab128086	Aliquote et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée
Tête laser à balayage confocal Nikon C1 fixée au microscope inversé Nikon Ti-E	Aliquote scientifique		et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée
Saline tamponnée au phosphate	SIGMA	P38135	0,01M PB/0,09 % NaCl Maquillage jusqu’à 5L à la fois
Autocuiseur 6L Tefal secure 5 Neo stainless	Tefal	GSA-P2530738	Acheté dans un magasin d’articles ménagers
local Prolong Gold DAPI	Life Technologies	P36962	Appliquer les gouttes directement sur la lamelle
Anticorps anti-actine bêta humain / souris de lapin	ABCAM	ab8227	Aliquote et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée
Chien anti humain / souris Anticorps H3Cit	ABCAM	ab5103	Aliquote et congélation à moins 80 degrés à l’arrivée
Rack de coloration 24 lames	ProScitech	H4465	La grille de coloration choisie doit pouvoir résister à l’ébullition sous pression et à l’incubation dans un four à 60 degrés
Sudan Black B	SIGMA	199664	0,3 % Ajouter 3g à une bouteille de 1L dans 70 % d’éthanol, filtrer et protéger de la lumière - stable pendant 6 mois à température ambiante
Tris 10mM	SIGMA	T4661	Ajouter TRIS et EDTA ensemble dans de l’eau distillée et pH à 9, pour le prélèvement d’antigènes, peut être préparé dans une solution 10x
Xylene	Trajan	XL005/20	Doit être utilisé dans une hotte