Amélioration de la fécondité et de la fertilité pour Aedes aegypti à l’aide de 24 plaques de culture tissulaire de puits (plaques EAgaL)

Résumé

Décrit est une méthode permettant de gagner du temps et de l’espace pour compter les œufs et déterminer les taux d’éclosion des moustiques individuels à l’aide de 24 plaques de culture tissulaire dans les puits, ce qui peut augmenter considérablement l’échelle et la vitesse des essais de fécondité et de fertilité.

Résumé

Les moustiques représentent un problème de santé publique important en tant que vecteurs de divers agents pathogènes. Pour les études qui nécessitent une évaluation des paramètres de condition physique des moustiques, en particulier la production d’œufs et les taux d’éclosion au niveau individuel, les méthodes conventionnelles ont imposé un fardeau substantiel aux chercheurs en raison de l’intensité de travail élevée et des exigences en matière d’espace de laboratoire. Décrit est une méthode simple utilisant 24 puits plaque de culture de tissus avec de l’agarose dans chaque puits et l’imagerie numérique de chaque puits pour déterminer le nombre d’œufs et les taux d’éclosion à un niveau individuel avec des besoins en temps et en espace considérablement réduits.

Introduction

La lutte contre les moustiques pour protéger les humains contre les agents pathogènes à transmission vectorielle est un objectif de santé publique important, principalement en raison du manque de vaccins efficaces pour la plupart des agents pathogènes transportés par les moustiques. De nombreuses études visent à réduire la condition physique des moustiques en conjonction avec une stratégie de réduction de la population applicable sur le terrain^1,2,3. Cela comprend des études approfondies pour créer des moustiques transgéniques et / ou des lignes knockout CRISPR / Cas9. De tel....

Protocole

1. Préparation des assiettes

1. Forez des trous dans 24 couvercles de plaques de culture tissulaire de puits (4−6 trous par puits) à l’aide d’une foreuse domestique avec un trépan d’environ 1,6 mm (1/16 in)(figure 2).
   REMARQUE: Ces trous empêchent la condensation de l’eau de l’agarose de s’accumuler sur le couvercle, où les moustiques peuvent pondre des œufs. La taille standard de la femelle Ae. aegypti (souche « Liverpool ») est d’environ 3,11 mm d’envergure. Il est recommandé de réduire la taille des trous lors de l’utilisation de moustiques plus petits pour éviter de s’échapper de la plaque.
2. La veille de l’....

Résultats

Les moustiques ont reçu une injection d’ARNdb ciblant un transporteur de fer candidat (FeT) ou un gène témoin (EGFP), nourris dans le sang, et mesurés pour la fécondité et la fertilité à l’aide de la méthode de la plaque EAgaL, suivant la procédure décrite ci-dessus.

Les moustiques chez lesquels l’expression de feT a été réduite au silence après l’injection d’ARNdb ont montré une réduction significative du nombre d’œufs et du taux d’éclosion(figure 11A−C)........

Discussion

La plaque EAgaL réduit considérablement le travail, le temps et l’espace pour effectuer des tests individuels de fécondité et de fertilité dans Aedes aegypti par rapport à la méthode FT. La comparaison préliminaire entre la méthode FT et la plaque EAgaL a donné lieu à des temps plus courts pour toutes les étapes (la technique d’imagerie a été appliquée à la méthode FT)(tableau 1). À titre de référence, une estimation des coûts de démarrage et par essai (une plaque EAgaL de 24 puits cont.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Mèche de 1,6 mm &Phi ; Les			clous chauffés alternativement peuvent être utilisés
1000 &mu ; Pointes de pipette L (longues)	Olympus plastics	24-165RL
Plaque de culture tissulaire 24 puits	Thermo Scientific	930186	transparente, à fond plat avec couvercle annelé
Agarose	VWR	0710-500G
Appareil photo numérique compact	Olympus	TG-5/TG-6
Ordinateur (Windows, Mac ou Linux)
Eau déminéralisée
Fidji (imageJ) téléchargement du logiciel			à partir de : https://fiji.sc/
Forceps	Dumont		pince pointue peut briser le corps du moustique
Boîtes de Pétri en verre	VWR
Eau de Javel
Perceuse
illuminateur pour stéréomicroscope (col de cygne)
Pipette P-1000	Pinceaux Gilson
Élastiques
Carte			pour enregistrer des images d’appareil photo numérique (DSHC, SDXC devrait être mieux)
Tableur (Microsoft Excel)	Microsoft		N’importe quel tableur fonctionne
Nourriture pour poissons TetraMin	Tetra		moulue avec moulin à café, mixeur ou mortier & pilon
Pipettes de transfert	VWR	16011-188

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