Un modèle de Drosophila pour étudier la polyploïdisation induite par les plaies

Résumé

La polyploïdisation induite par les plaies est une stratégie de réparation des tissus conservée où les cellules se développent en taille au lieu de se diviser pour compenser la perte de cellules. Voici un protocole détaillé sur la façon d’utiliser la mouche des fruits comme un modèle pour mesurer le stratagème et sa régulation génétique dans la réparation des plaies épithéliales.

Résumé

La polyploïdéie est un phénomène fréquent dont l’impact sur la santé et la maladie de l’organisme est encore mal compris. Une cellule est définie comme polyploïde si elle contient plus que la copie diploïde de ses chromosomes, qui est le résultat de l’endoréplication ou de la fusion cellulaire. Dans la réparation de tissu, la polyploïdisation induite par la blessure (WIP) s’est avérée être une stratégie de guérison conservée des mouches des fruits aux vertébrés. WiP a plusieurs avantages sur la prolifération cellulaire, y compris la résistance à la croissance oncogène et le stress génotoxique. Le défi a été d’identifier pourquoi les cellules polyploïdes apparaissent et comment ces cellules uniques fonctionnent. Fourni est un protocole détaillé pour étudier WIP dans l’épithélium adulte mouche des fruits où les cellules polyploïdes sont générés dans les 2 jours après une blessure de perforation. Profitant de la vaste trousse d’outils génétiques de D. melanogaster, les gènes nécessaires pour initier et réguler le WIP, y compris Myc, ont commencé à être identifiés. Les études continues utilisant cette méthode peuvent révéler comment d’autres variables génétiques et physiologiques, y compris le sexe, l’alimentation et l’âge, régulent et influencent la fonction de WIP.

Introduction

Drosophila melanogaster est un système modèle attrayant pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la réparation des plaies épithéliales. Comme chez les mammifères, les mécanismes de réparation des tissus utilisés dépendent à la fois du tissu et de son stade de développement. La cicatrisation des plaies sans cicatrice se produit dans l’embryon de mouche des fruits où une « chaîne de bourse » d’actomyosine se forme au bord d’avant épithélial permettant à la plaie de se fermer en toute transparence^1,2. La cicatrisation post-embryonnaire des plaies chez les larves, les pupes et les mouches adultes des fruits entraîne un remodelage de la matrice extracellulaire, la formation de cicatrices de mélanine et la croissance épithéliale des cellules^3,,4,5,6. Les cellules épithéliales augmentent en taille par fusion cellulaire et l’endocycle, un cycle cellulaire incomplet qui contourne la mitose^3,4,7,8. En conséquence, la perte cellulaire est compensée par la croissance des cellules polyploïdes au lieu de la division cellulaire. Le hindgut de mouche adulte, le midgut et l’épithélium folliculaire reposent également sur la croissance des cellules polyploïdes pour compenser la perte cellulaire après des lésions tissulaires^9,,10,11.

Le polyploïdé est un aspect bien connu du développement de l’organisme chez les plantes et les insectes, mais au cours des dernières années, il est devenu plus évident que le polyploïdé est une stratégie de réparation des tissus conservés chez les vertébrés¹². Le poisson zèbre, qui a la capacité de régénérer son cœur, s’appuie sur la croissance des cellules polyploïdes pour guérir l’épicardium^{endommagé 13}. Polyploïdé contribue également à la régénération du foie des mammifères et la réparation de l’épithélium tubule des reins après une blessure aiguë^14,15. Dans ces exemples, les cellules polyploïdes sont générées par endorepplication par l’intermédiaire de l’endocycle ou de l’endomitose, ce qui entraîne une cellule binucléisée due à un bloc dans la cytokinesis¹². L’énigme est pourquoi les cellules polyploïdes apparaissent pendant la réparation de blessure et comment le polyploïdage affecte la fonction tissulaire. Des études récentes ont fourni un nouvel aperçu de la question de savoir si la polyploïdité offre un avantage ou un désavantage de guérison. Dans l’épicardium de poisson zèbre, le polyploïdoïde a augmenté la vitesse de la cicatrisation de blessure^13. Dans le foie postérieur de D. melanogaster et le foie de mammifère, le polyploïdage s’est avéré protecteur contre la croissance oncogène^11,14. Dans l’épithélium de mouche adulte, il a été récemment constaté que le polyploïdité permet la réparation de blessure en présence du stress génotoxique¹⁶. L’endoréplication est résistante aux dommages à l’ADN, permettant la cicatrisation des plaies lorsque la prolifération cellulaire serait autrement compromise¹⁷. Pour les cardiomyocytes dans les cœurs de souris et de poissons zèbres, cependant, polyploïdage ralentit la guérison, résultant en une formation accrue de cicatrice^18,19. Par conséquent, selon l’organe et/ou le type de cellule, le polyploïdage peut être une stratégie de réparation de tissu bénéfique ou préjudiciable. L’accessibilité de la génétique de D. melanogaster couplée à l’analyse de la réponse de polyploïdisation induite par la plaie (WIP) en font un système modèle idéal pour élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires qui guident cette stratégie de cicatrisation des plaies.

Ici, nous présentons un protocole pour analyser WIP dans l’épithélium adulte de D. melanogaster. Sont inclus des instructions pour les dommages de mouche de fruit, dissection, immunostaining, montage, imagerie, et l’analyse de la ré-épithélialisation, la fusion cellulaire, et l’endorepplication (ployage). L’imagerie et l’analyse de stratagème peuvent également être adaptées à d’autres modèles pour tester si wip se produit. Il convient de noter qu’avec une augmentation de la teneur en ADN nucléaire, il y a souvent une augmentation correspondante de la taille du nucléaire. Cependant, il existe de nombreux exemples en biologie où la taille nucléaire ne reflète pas un changement correspondant dans le ploidy²⁰. Il faut faire preuve d’une plus grande prudence lors de l’interprétation de la taille nucléaire dans le contexte d’un environnement de plaie où les cellules se propagent ou s’étirent souvent pour couvrir le site de la plaie. Par conséquent, la seule preuve définitive de changement dans le ploidy est de mesurer la teneur en ADN par cette méthode (ou d’autres, comme le séquençage du génome entier)²¹. Cette méthode augmente la pertinence de l’épithélium abdominal adulte de D. melanogaster comme modèle pour étudier le rôle et la régulation du polyploïdage dans la réparation de blessure.

Protocole

1. Mise en scène et blessures de mouches à fruits adultes

1. Sélectionnez la souche de choix D. melanogaster (c.-à-d. souche epi-Gal4/UAS, voir Tableau des matériaux).
   REMARQUE : Ici, le système Gal4/UAS est utilisé pour permettre l’expression épithéliale spécifique aux gènes (épi-Gal4) d’un gène ou d’un RNA en aval de la SAMU. Cette étude utilise des protéines membranaires fluorescentes (UAS-Cd8.mRFP), un inducteur mitotique (UAS-fzr^RNAi, UAS-stg) et un inhibiteur du WIP (UAS-E2F1^RNAi; UAS-Rac^DN).
2. Recueillir deux flacons de 10-15 mouches de fruits femelles nouvellement fermées chacun et l’âge sur les flacons d’aliments frais à 25 °C jusqu’à l’âge de 3-5 jours. Un flacon servira de contrôle indemne et l’autre flacon sera blessé comme décrit ci-dessous. Les mouches femelles doivent être maintenues avec des mâles (~5/flacon).
3. Pour blesser les mouches, assembler plusieurs porte-épingles chacun avec une seule broche en acier inoxydable de 0,10 mm. Assurez-vous que l’extrémité nette de la goupille est orientée vers l’extérieur. Les broches peuvent facilement se plier ou copeaux après avoir perforé la mouche et les broches accrochées ou endommagées doivent être jetées.
4. Anesthéser les mouches femelles âgées sur un tampon de co_2-mouchesous un stéréomicroscope et les aligner dans une rangée à l’aide d’un pinceau. Porter des lunettes de sécurité, tenir le porte-épingles dans une main et les forceps dans l’autre, utiliser des forceps pour positionner une mouche avec son abdomen ventral vers le haut.
5. Perforation de la femelle adulte vole dans la région pleurite épithéliale de la tergitite A4 de chaque côté des sternites de ligne médiane ventrales (Figure 1A). La perforation de cette région ventrale fournit un espace optimal loin des sites de dissection où les bords de tissu seront déchirés par le traitement mécanique.
6. Retour des mouches blessées à la fiole de nourriture et l’âge à la journée désirée après blessure (dpi). La cicatrisation épithéliale commence à 1 dpi et se termine par 3 dpi. L’endoréplication culmine à 2 dpi, ce qui est idéal pour l’essai EdU (section 4, figure 2).

2. Dissection abdominale de mouche

REMARQUE : Au cours de cette étape, il est important d’éviter de toucher le tissu abdominal ventral avec les outils de dissection, car il compromettra l’intégrité de l’épithélium.

1. Obtenez tous les matériaux nécessaires à la dissection : solution de Grace, forceps, ciseaux de ressort de Vanna, broches de 0,10 mm, plaques de dissection, plat de dissection de 9 puits en verre, solution fixative (4 % de paraformaldéhyde en 1x PBS), 1x PBS, lingettes, pipettes et pointes pour 30 μm, et gants (voir tableau des matériaux).
2. Confirmer que les mouches ont été blessées avec succès par des mouches blessées anesthésives sur un coussin de co₂sous un stéréomicroscope et vérifier la présence de la cicatrice de la plaie (c.-à-d. une tache de mélanine sur l’abdomen, voir la figure 1B). Jetez toutes les mouches du groupe expérimental qui n’ont pas été blessées avec succès.
3. Pour commencer la dissection, remplissez un puits d’un plat de dissection en verre de 9 puits avec la solution de Grace. Utilisez une paire de forceps pour saisir une mouche femelle blessée par le côté dorsal du thorax et submerger la mouche dans le puits contenant la solution de Grace.
4. En utilisant des forceps dans la main opposée sans relâcher le thorax, percer la cuticule dorsale sous la tergite A6 et tirer la cuticule de l’extrémité arrière de la mouche des fruits. Les organes internes (ovaire et intestin) sortent habituellement à cette étape. Si ce n’est pas le cas, poussez doucement sur le côté dorsal de l’abdomen avec les forceps pour presser les organes restants et jeter dans un puits vide.
5. Casser l’abdomen complet à la jonction du thorax au-dessus de la terrgite A2 à l’aide des forceps et transférer l’abdomen dans un puits vide contenant ~100 μL de la solution de Grace.
6. Répétez les étapes 2.3-2.5 jusqu’à ce que tous les abdomens volants soient disséqués.
7. Réduisez le volume de la solution de Grace à 30 μL dans le puits contenant des abdomens disséqués et en commun.
8. Filet les abdomens s’ouvrent en positionnant l’abdomen sur le côté dorsal avec les forceps dans une main, puis en insérant la lame inférieure des ciseaux de ressort de Vanna dans la cavité abdominale avec l’autre main. Couper le long de la ligne médiane dorsale jusqu’à ce que l’abdomen soit entièrement ouvert, ce qui peut nécessiter jusqu’à trois coupures(figure 1C, 1D).
9. Installez une plaque de dissection sèche avec quatre broches de 0,10 mm par zone de montage abdominale. Chaque plaque de dissection de 35 mm peut s’adapter jusqu’à sept zones de montage. Pipette 30 μL de la solution de Grace sur chaque zone de montage et transférer un abdomen fileté à chaque gouttelette.
10. Épingler les abdomens filetés dans le plat sur les quatre coins dorsaux (figure 1E). Assurez-vous que le tissu se trouve à plat sans déchirer ou surmener le tissu abdominal.
11. Pour fixer le tissu, pipette hors de la solution de la Grâce et ajouter 30 μL de la solution de correction à l’abdomen épinglé.
    ATTENTION : Portez des gants pendant la manipulation de la solution fixe, car le paraformaldéhyde est toxique.
12. Répétez les étapes 2.10-2.11 jusqu’à ce que tous les abdomens filetés soient épinglés sur la plaque de dissection.
13. Placez une étiquette de bande sur le fond de chaque plat pour marquer chaque groupe témoin et expérimental. Fixer les échantillons pendant 30-60 min à température ambiante (RT).
14. Laver la solution de correction en pipeting sur 1,5 mL de 1x PBS à chaque plaque. Disposer de solutions fixes et de plastiques dans des contenants de déchets chimiques liquides ou secs appropriés conformément aux directives institutionnelles.
15. Laver les plaques 2x avec 1,5 ml de PBS 1x et stocker les tissus fixes recouverts de 1,5 mL de 1x PBS dans un récipient en plastique avec couvercle. Ajouter une couche de papier absorbant humide au fond du récipient et conserver les échantillons à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à immunostain dans les 1 semaine suivant la dissection.

3. Immunofluorescence

1. Préparer fraîchement les réactifs (voir tableau des matériaux): solution tampon de lavage (0,3 % Triton X 100, 0,3 % BSA en 1x PBS). Les restes de tampon de lavage peuvent être enregistrés à 4 °C et utilisés pendant la durée du protocole de coloration de 2 jours. Préparer suffisamment de solution d’anticorps primaires par essai (figure 2) à l’aide d’Anti-FasIII (1:50 souris anti-Fasciclin-III) dans la tampon de lavage avec anti-Grh (1:300 affinité lapin purifié anti-Grainyhead⁸) ou anti-RFP (1:1,000 lapin anti-DP). Les solutions d’anticorps primaires peuvent être enregistrées à 4 °C et réutilisées plusieurs fois jusqu’à ce que le signal soit considérablement réduit.
2. Permeabiliser le tissu en coupant 1x PBS, en ajoutant 1,5 mL de tampon de lavage, et en coussant pendant au moins 30 min sur un shaker orbital (80 tr/min) à RT.
3. Retirer le tampon de lavage et tacher le tissu pendant la nuit avec 1,5 mL de solution d’anticorps primaires, en couve sur un shaker orbital (80 tr/min) à 4 °C. Recueillir la solution d’anticorps primaires et enregistrer dans un tube à 4 °C pour de futures expériences.
4. Rincez d’abord l’échantillon rapidement avec 1x PBS, puis lavez 3x avec 1,5 mL de tampon de lavage. Pour chaque lavage, incuber des échantillons à RT sur un shaker orbital pendant au moins 30 min.
5. Pendant le lavage final, préparer la solution d’anticorps secondaire: 1:1,000 âne anti-lapin Alexa 488 ou 568 et 1:1.000 chèvre anti-souris Alexa 488 ou 568 (ou fluorophores de choix) dans tampon de lavage.
6. Retirez le tampon de lavage et tachez les tissus avec 1,5 mL de solution d’anticorps secondaires. Couvrir les échantillons de papier d’aluminium et incuber sur un shaker orbital à RT pendant 3 h. Alternativement, les échantillons peuvent être incubés pendant la nuit à 4 °C sur un shaker orbital.
7. Laver les échantillons en jetant d’abord la solution d’anticorps secondaire, puis rincer rapidement l’échantillon avec 1x PBS suivi de trois lavages avec 1,5 mL de tampon de lavage. Pour chaque lavage, incuber des échantillons à RT sur un shaker orbital pendant au moins 30 min.
8. Préparer la solution DAPI en diluant le DAPI à 10 μg/mL dans la mémoire tampon de lavage. Après le lavage final, tachez les échantillons avec une solution DAPI de 1,5 mL qui couve à RT pendant 30 min.
9. Jeter la solution DAPI et rincer les échantillons 2x en 1,5 mL de 1x PBS. Conserver les tissus tachés dans 1,5 mL de 1x PBS dans l’obscurité, recouverts de papier d’aluminium, à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à être montés sur une lame de verre avec couvercle. L’étape de montage doit être effectuée dans un délai d’une semaine.

4. Activité du cycle cellulaire (essai edu)

1. Composez une solution de stock EdU de 10 mM à partir du kit Click-iT (voir Tableau des matériaux)en dissolvant la poudre EdU en dH₂0 et en mélangeant pendant ~15 min jusqu’à dissolution complète. La solution de stock peut être aliquoted (250 μL par tube) et stockée à -80 °C.
2. Nourrir les mouches EdU en diluant d’abord le stock d’EdU à 5 mM en dH₂O. Ajouter la levure sèche jusqu’à ce que la solution soit trouble et brièvement vortex pour mélanger. Couper un bouchon de tube de 0,5 mL et le placer au fond du flacon de nourriture à mouches. Poussez le bouchon dans la nourriture, de sorte qu’il est stable.
3. Anesthésiez les mouches et transférez des mouches de 3 à 5 jours dans la fiole. Appuyez sur les mouches à un bord afin qu’aucun ne soit coincé dans le bouchon.
4. Pipette 75 μL de levure-EdU solution dans le bouchon. Les mouches doivent être nourries chaque jour à la levure fraîche et transférées dans un flacon d’aliments frais avec un bouchon tous les deux jours pour s’assurer que les mouches ne restent pas coincées au fond du flacon.
5. Pour transférer les mouches, retournez à une nouvelle fiole avec un bouchon, mettez les mouches à dormir, appuyez sur les mouches d’un côté, et ajoutez la solution fraîche de levure-EdU.
6. Le troisième jour, blesser les mouches et continuer à nourrir la levure-EdU jusqu’à la dissection à 2 dpi (Figure 4A). Voir la section 2 du protocole pour les méthodes de dissection et de fixation.
7. Préparer les réactifs de coloration EdU : tampon de lavage (0,3 % Triton X 100, 0,3 % de BSA en 1x PBS), tampon de perméabilisation (0,5 % Triton X 100 en 1x PBS), tampon de blocage (3 % de BSA en 1x PBS) et préparation des réactifs à partir du kit d’essai EdU (voir tableau des matériaux),y compris le tampon de réaction 1x et l’additif de réaction tampon 1x tel que dirigé par le fabricant.
8. Laver les échantillons pendant 1 h, en mélangeant à RT dans 1,5 mL de tampon de lavage.
9. Ajouter 1,5 mL de tampon de perméabilisation et incuber des échantillons pendant 20 min.
   REMARQUE : Décongeler et préparer une solution de cocktail de réaction à l’aide d’un volume de 500 μL/plaque.
10. Laver les échantillons 1x rapidement avec 1x PBS, puis 3x rapidement avec 1 mL de tampon de blocage.
11. Pipette hors de tout tampon de blocage restant et ajouter 500 μL de solution de cocktail de réaction par assiette. Agiter les plaques pour s’assurer que les tissus sont complètement couverts. Incuber dans un tiroir dans l’obscurité pendant 1 h à RT.
12. Laver les échantillons 1x rapidement avec 1,5 mL de tampon de blocage.
13. Tacher avec 1,5 mL de solution DAPI à 1:5,000 dans la mémoire tampon de lavage pendant 30 min.
14. Laver 2x avec 1x PBS rapidement, envelopper dans du papier d’aluminium et conserver dans l’obscurité à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à monter les échantillons dans les 3 jours.

5. Mont tissu taché

1. Obtenez tous les matériaux nécessaires pour le montage : lames en verre, couvercles en verre, vernis à ongles transparent, supports de montage, une paire de forceps et lingettes.
2. Pour monter le tissu moucheté, dépouillez les abdomens de la plaque de dissection à l’aide de forceps sous le stéréomicroscope. Transférer le tissu à ~30 μL de support de montage sur un couvercle de verre en saisissant doucement le tissu avec des forceps par ses flancs dorsaux, en prenant soin d’éviter de toucher la zone ventrale avec des forceps.
3. Sous le stéréomicroscope orienter le tissu abdominal de sorte que l’intérieur est orienté vers le bas vers le couvercle (c.-à-d. la cuticule externe / poils sont orientés vers le haut). Tirez les abdomens orientés vers le bord de la gouttelette de support à l’aide des forceps. La tension de surface aidera à maintenir le tissu plat (Figure 1F).
   REMARQUE : Il est utile pour l’imagerie d’organiser les abdomens dans une colonne ou une rangée à ce stade.
4. Étiquetez une lame de verre (c.-à-d. un contrôle ou une expérience) et prenez le couvercle en rapprochant lentement la diapositive du couvercle. Retourner glisser et éponger doucement à l’aide d’une lingette pour enlever l’excès de support de montage.
5. Sceller les bords du couvercle avec du vernis à ongles transparent et répéter pour tous les groupes expérimentaux restants. Stockez les diapositives dans une boîte à diapositives à 4 °C jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être image.

6. Imagerie et traitement

1. Imagez la zone de la plaie abdominale de mouche en localisant d’abord la cicatrice de mélanine avec un microscope confocal (figure 1B), soit un scanner de point ou un éclairage structuré (ApoTome) avec une huile 40x ou objectif sec.
2. Vérifiez l’exposition sur chaque canal, en vous assurant que le signal est en dessous de la saturation. Les paramètres d’imagerie doivent être basés sur le groupe d’échantillons le plus brillant. Ceci est particulièrement important pour l’analyse de stratagème car le canal DAPI doit rester dans la plage linéaire pour mesurer avec précision le contenu de l’ADN.
3. Prenez une image complète de z-stack dans les trois canaux avec une distance optimale d’au moins 0,50 μm entre les tranches. Enregistrez les images capturées et ouvrez le fichier dans le programme d’analyse d’images Fidji (également connu sous le nom d’ImageJ).
4. Pour chaque image, créez une projection de z-stack en utilisant la somme de l’option tranches pour tous les canaux.
5. Faites pivoter les images au besoin pour s’assurer que les noyaux sont alignés horizontalement sur les images (figure 3A et figure 4E).
6. Rogner toutes les images à une sélection rectangulaire de 300 μm x 300 μm centrée autour du site de la plaie ou du centre d’un contrôle non blessé. Identifier la zone en dessinant un rectangle et en sélectionnant Modifier | Sélection | Spécifier. Vérifiez que les unités à l’échelle sont en microns pour vous assurer que la même boîte de taille est utilisée pour toutes les images à analyser.

7. Analyse de l’endoréplication (stratagème)

1. À l’aide de Fidji, sélectionnez la fenêtre du canal Grh et dupliquez l’image. Utilisez ensuite l’outil seuil pour créer un masque. Ajuster manuellement le seuil en glissant la barre supérieure pour minimiser l’arrière-plan sans provoquer de rétrécissement drastique des noyaux (figure 4D).
2. Si des noyaux du canal Grh touchent l’image de seuil, utilisez l’outil pinceau (largeur de 2 pixels) de la même couleur que l’arrière-plan, pour tracer une ligne entre les noyaux. Cliquez pour appliquer 1x une fois terminé pour générer le masque final.
3. Générer une carte de la région d’intérêt (ROI) à l’aide de la fonction Analyser les particules : la taille définie à 5 μm-60 μm afin de capturer la plupart des noyaux sans inclure l’arrière-plan.
4. Ajuster manuellement la carte roi au besoin dans le gestionnaire de retour sur investissement. Supprimez toutes les sélections qui ne sont pas des noyaux et ajoutez tous les noyaux à la liste qui n’ont pas été identifiés en décrivant le noyau avec l’outil de sélection à main levée et en l’ajoutant au gestionnaire de roi ( figure4D).
5. Sélectionnez le canal DAPI puis cliquez sur Afficher tout dans le gestionnaire de retour sur investissement pour appliquer la carte roi générée dans le canal Grh sur le canal DAPI.
6. Supprimer toutes les sélections où le contour épithélial se chevauche avec les noyaux nonpithéliaux (p. ex., les noyaux des muscles ou de la graisse) de la carte du retour sur investissement. Grainyhead ne tache que les noyaux épithéliaux, tandis que le DAPI tache tous les noyaux. Vérifiez que chaque sélection décrite ne contient qu’un seul noyau et supprimez ou modifiez toutes les sélections avec plus d’un noyau. Enregistrer la liste de retour sur investissement modifiée.
7. Mesurer la superficie et la densité intégrée de chaque noyaux épithéliaux sur la carte du roi à l’aide des outils d’analyse aux Fidji. Exporter les valeurs dans un programme de feuille de calcul.
8. Mesurez l’arrière-plan moyen de l’image à l’aide de l’outil de sélection circulaire. Dessinez trois cercles qui ne se chevauchent avec aucun noyaux dans différentes zones de l’image DAPI. Ajoutez la zone et la densité intégrée de chacun des cercles à un programme de feuille de calcul pour établir la luminosité de l’image en arrière-plan.
9. Commencez par calculer l’arrière-plan moyen par zone unitaire pour chaque image en divisant chaque valeur de densité intégrée en arrière-plan par sa zone correspondante. Ensuite, la moyenne des trois mesures intégrées de densité par zone pour l’image afin d’obtenir l’arrière-plan moyen par unité de surface.
10. Ensuite, calculez l’arrière-plan total de chaque noyau DAPI en multipliant la zone du noyau par l’arrière-plan moyen par zone unitaire. L’intensité normalisée du DAPI pour chaque noyau mesuré peut ensuite être calculée en soustrayant l’arrière-plan total de chaque noyau de sa densité intégrée mesurée.
11. Moyenne de toutes les valeurs normalisées d’intensité DAPI du contrôle épithélial non blessé. Les noyaux épithéliales non blessés ont été précédemment calculés pour avoir une valeur de ploidy de 2C et peuvent servir de référence pour calculer le stratagème dans les noyaux épithéliaux des conditions expérimentales⁸.
12. Calculer le ploidy de chaque noyau en divisant l’intensité normalisée de l’IPAP de chaque noyau par la valeur normalisée à partir du contrôle épithélial non blessé de référence (2C), puis multipliez la valeur par 2 pour égaler le stratagème normalisé (valeur C) :
    (Densité intégrée nucléaire - Densité intégrée nucléaire de fond)/Densité intégrée nucléaire moyenne (noyaux épithéliaux non blessés = 2C) x 2 = ployoire nucléaire épithélial (C)
13. Noyaux graphiques avec des valeurs de stratagème comme parcelle de point, histogramme, ou regroupés dans un graphique à barres en conséquence (c.-à-d. 2C [0.6-2.9C], 4C [3.0-5.9C], 8C [6.0-12.9C], 16C [13.0-24.9C], et >32C [>25.0C] (figure 3F).

Résultats

Un protocole détaillé est fourni pour utiliser D. melanogaster comme modèle pour étudier la polyploïdisation induite par les plaies (WIP). Ce modèle de cicatrisation des plaies offre de nombreux avantages par rapport aux modèles de mammifères et autres modèles de mouches de WIP. Le polyploïdage a été facilement induit par une perforation mécanique avec une goupille d’insecte et des cellules polyploïdes ont été générées dans un court laps de temps (2-3 dpi) (Figure 1A, 1B)⁴. Le défi majeur est la dissection du tissu abdominal intact sans aucune perturbation de l’épithélium. L’épithélium de D. melanogaster est facilement accidentellement heurté ou rayé avec les outils de dissection pointus. Par conséquent, les étapes de ce protocole doivent être pratiquées avant l’utilisation et l’analyse.

Tout d’abord, la blessure a été limitée à l’abdomen femelle ventral, qui fournit une grande zone de tissu opaque plat idéal pour l’imagerie. Les blessures par perforation ont été infligées dans l’épithélium pleurite, qui se trouve de chaque côté des sternites ventrales de ligne médiane et ciblé entre les segments de tergite (T) T4-T5 (Figure 1A-C). Ce placement de blessure fournit une grande zone visible qui n’est pas perturbée par la dissection. Les étapes difficiles comprennent la coupe de ciseaux de ressort abdominal et les étapes d’épinglage (Figure 1D, 1E). L’étape de coupe de ressort a fonctionné mieux quand les abdomens ont été coupés dans un volume réduit de la solution de Grace (~30 μL) pour diminuer le mouvement des tissus. Une coupe bien centrée le long de la ligne médiane dorsale était nécessaire pour fournir une zone suffisante sur les volets dorsaux abdominaux pour s’ouvrir sur la plaque de dissection (Figure 1C). L’abdomen doit être légèrement épinglé sur les quatre coins sans force excessive (figure 1E). Une poussée d’épingle trop dure déformera le tissu abdominal et pourrait même pousser le tissu dans la plaque de dissection. Si cela se produit, le tissu doit être jeté. Une fois que le tissu abdominal a été fixé, il est resté sur la plaque de dissection jusqu’à ce que la coloration d’immunofluorescence soit complète et que les abdomens soient montés sur une couverture en verre pour l’imagerie (figure 1F).

La cicatrisation des plaies nécessite une feuille épithéliale continue pour se former, qui dépend de l’endoréplication et de la fusion cellulaire^4,16. La protéine de jonction de septate FasIII, qui étiquette les jonctions cellule-cellule, a fourni un indicateur pour savoir si des perturbations de traitement se sont produites pendant la préparation (Figure 1G, 1H). Les abdomens avec de grandes égratignures (zone non tachée) qui perturbent la zone de la plaie doivent être jetés et n’ont pas été utilisés pour une analyse plus approfondie (figure 1H).

L’étape suivante a été d’analyser les échantillons intacts pour les défauts dans wip. Ce protocole comprend des essais distincts pour détecter différents aspects de la réponse wip (figure 2). La réparation des plaies était terminée lorsqu’une cellule centrale, grande et multinucléée couvrait la croûte de la plaie (figure 3A). Ici, la fusion cellulaire a été détectée par coloration pour FasIII/Grh et en quantifiant le nombre de noyaux épithéliales Grh⁺ englobés dans la zone définie par FasIII⁴. Des défauts dans la fermeture ou la rééthélialisation des plaies ont été détectés lorsque des lacunes de >10 μm dans la feuille épithéliale ont été observées (figure 3B, flèche rouge). Ce fut le cas, par exemple, lorsque WIP a été inhibé par l’activation du cycle mitotique via l’expression de stg, fzr^RNAi, comme récemment rapporté¹⁶. Dans cette condition génétique, 52% des blessures n’étaient pas en mesure de former une feuille épithéliale continue sur la croûte de plaie (Figure 3B, 3C).

Une autre méthode pour mesurer la réparation des plaies dans ce modèle était de visualiser la membrane épithéliale avec l’expression épi-Gal4 de UAS-mCD8-ChRFP⁴ (Figure 2, Figure 3D). Dans le contrôle, 91% des blessures épithéliales fermées complètement par 3 dpi, mais inhibant WIP en bloquant l’endorepplication (E2f1^RNAi) et la fusion cellulaire (RacDN) simultanément, comme indiqué précédemment, causé 92% des blessures épithéliales à rester complètement ouvert (Figure 3D, 3E)^8,16. L’activation du cycle de cellules mitotiques par expression de stg, fzr^RNAi a également eu comme conséquence un défaut épithélial de fermeture de blessure. Cependant, en visualisant la membrane cellulaire épithéliale, l’étendue du défaut de rééthenialisation pourrait être déterminée. Les blessures de mouche du mutant WIP (E2f1^RNAi, RacDN)étaient plus ouvertes que les blessures de stg, fzr^RNAi (Figure 3D, contour rouge en pointillés)¹⁶. Ce test de cicatrisation des plaies membranaires a fourni plus d’informations sur l’étendue du défaut de réparation des plaies. Par conséquent, les défauts de rééthelalisation pourraient être regroupés comme étant complètement ouverts, partiellement fermés (c.-à-d. >10 μm) ou complètement fermés (figure 3D, 3E).

En plus de la fusion cellulaire, les cellules épithéliales se développent en taille par endoreplication, un cycle cellulaire incomplet qui double la teneur en ADN nucléaire. L’endoréplication a été évaluée à la fois par l’activité du cycle cellulaire et par les mesures directes de stratagème de l’ADN nucléaire (figure 2 et figure 4). Ici, l’activité du cycle cellulaire a été détectée par incorporation de l’analogue de la thymidine, EDU (Figure 4A, 4B). D. melanogaster cellules épithéliales ont été trouvés pour entrer dans l’endocycle, un cycle cellulaire incomplet qui oscille entre les phases S et G sans une phase M intermédiaire^4,12. Le régime adulte D. melanogaster a été complété par edu⁺ nourriture avant les blessures et les mouches ont été maintenues sur un régime EdU⁺ jusqu’à la dissection à 2 dpi (Figure 4A). L’EdU a ensuite été détecté à l’aide du protocole Click-iT du fabricant. Ce test EdU a été utilisé pour déterminer où, quand et combien de noyaux ont été déclenchés pour entrer dans la phase S en réponse à une blessure. En utilisant le système Gal4/ UAS, il a été récemment constaté que l’expression épithéliale spécifique de myc peut soit bloquer (myc^RNAi) ou exacerber (Myc surexpression) la compétence des cellules épithéliales pour entrer en phase S. En conséquence, il a été démontré que Myc est suffisant pour induire l’endoreplication dans les cellules postmitotiques, même sans blessure^16,22.

Ensuite, le stratagème épithélial a été déterminé en mesurant directement la teneur en ADN nucléaire. Les noyaux épithéliales ont été identifiés par coloration d’immunofluorescence pour le marqueur spécifique épithélial, Grh (Figure 4D). Dans le logiciel d’imagerie fidji, les noyaux épithéliaux ont été systématiquement identifiés puis seuils à l’aide de la tache nucléaire Grh. Les noyaux ont ensuite été séparés et les ROI superposés à la SOMME des piles DAPI image (Figure 4D, flèche verte). Tous les noyaux qui se chevauchent ont été supprimés manuellement avant que la densité intégrée des noyaux sélectionnés ne soit mesurée (figure 4D, flèches rouges). Cette méthode semi-automatique permet de quantifier la distribution et le stratagème de la plupart des noyaux tout au long de l’épithélium abdominal mouche non blessé et réparé⁸. Comme récemment rapporté, les noyaux épithéliaux entourant la plaie étaient composés de 44% de noyaux polyploïdes avec une teneur en ADN supérieure à 3C à 3 dpi (Figure 4E, 4F)¹⁶. Comme on pouvait s’y attendre des résultats de l’EdU, le renversement du myc a conduit à un bloc significatif dans l’endoreplication, car seulement 9% des noyaux épithéliaux étaient polyploïdes, tandis que la surexpression de Myc a entraîné des noyaux épithéliaux polyploïdes à 100% autour du site de la plaie (Figure 4F)¹⁶. La taille nucléaire épithéliale a également été visiblement affectée par l’expression de myc avec des noyaux réduits ou agrandis présents. Cependant, la zone nucléaire n’est pas une mesure précise des effets ploidy et physiologiques, parce que des facteurs tels que l’étirement cellulaire peuvent également influencer la taille nucléaire sans affecter la teneur en ADN nucléaire²⁰.

Figure 1 : Les fruits adultes volent des blessures abdominales, des dissections et du montage de tissus. (A) Diagramme de l’essai abdominal adulte de blessure. Les mouches doivent être blessées de chaque côté de l’abdomen à la tergite 4 (T4). (B) Mouche femelle adulte de fruit 3 dpi avec la croûte de mélanine formée de la cicatrisation de blessure (boîte blanche). Barre d’échelle = 50 μm. (C) Abdomen adulte disséqué, vue dorsale, avec des tergites étiquetés. Les abdomens ont été filetés sur la ligne médiane du côté dorsal (ligne en pointillés blanc). Barre d’échelle = 50 μm. (D) Abdomens adultes disséqués et filetés avant l’épinglage. Barre d’échelle = 50 μm. (E) Abdomen adulte épinglé sur une plaque de dissection. Une goupille a été placée dans chacun des quatre coins de l’abdomen sur le côté dorsal. Le tissu a été doucement ouvert, mais pas étiré, pour éviter la déchirure. (F) Les abdomens adultes ont été montés et placés sur un couvercle en verre avec l’intérieur de l’abdomen orienté vers le bas vers le couvercle et la cuticule orientée vers la glissière de verre. (G) Coloration de la plaie intacte sans perturbation de traitement et d’un syncytium central (ligne jaune pointillée). Barre d’échelle = 50 μm. (H) Image d’une zone de plaie rayée (*) avec une région FasIII non tachée qui perturbe le syncytium. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : flux de travail d’analyse WIP. Le diagramme de flux représente les trois essais décrits dans cette étude et les étapes qui se chevauchent et distinctes pour détecter et mesurer la réponse wip. L’essai EdU mesure l’activité du cycle cellulaire (boîtes bleues), le stratagème et la rééthélialisation sont détectés par l’immunostaining Grh/FasIII (boîtes vertes), et l’expression de la DP membranaire permet de mesurer l’étendue de la fermeture épithéliale des plaies (boîtes roses). Les étapes communes sont dans les boîtes grises et les génotypes de souche de D. melanogaster sont énumérés ci-dessus. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Méthodes de détection de la rééthelisation pendant le WIP. La réépilélialisation a été perturbée quand WIP a été génétiquement inhibé. Images immunofluorescentes de contrôle (A) et stg, fzr^RNAi (B) à 3 dpi. Les noyaux épithéliaux et les jonctions septate ont été tachés de Grh (vert) et De FassiII (magenta), respectivement. (A' et B') La coloration de FasIII seule a montré que la ré-épithélialisation était altérée (flèche rouge) dans l’épithélium de stg, fzr^RNAi. Barre d’échelle = 50 μm. (C) Quantification des défauts de réé epithélialisation (%) à 3 dpi (gris): contrôle (n = 8), stg, fzr^RNAi (n = 6). Les barres d’erreur indiquent l’erreur standard ; la signification statistique a été mesurée par l’intermédiaire du t-test de l’élève, **P < 0,01. La réépilélialisation pendant la réparation de la plaie pourrait également être détectée par l’expression d’une DP liée à la membrane à l’aide d’epi-Gal4, UAS-mCD8-RFP. (D) Images immunofluorèses de contrôle, E2F1^RNAi, RacDN, et stg, fzr^RNAi à 3 dpi. Barre d’échelle = 20 μm. La croûte de plaie (contour jaune) et la zone ouverte de blessure épithéliale (contour rouge). (E) Quantification de la fermeture des plaies en ctrl (n = 11), E2F1^RNAi, RacDN (n = 13) et stg, fzr^RNAi (n = 13). Adapté de Grendler et coll.¹⁶. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Méthodes de détection de l’endorepplication pendant le WIP. (A) Chronologie de l’essai EdU: Drosophila adulte ont été nourris 75 μL de 5 mM levure-EdU tous les jours 2 jours avant la blessure et a continué jusqu’à 2 dpi. (B) Images immunofluorescentes de l’étiquette EdU dans les souches de mouche exprimées avec le système epi-Gal4/UAS à 2 dpi. Croûte de plaie (W). Barre d’échelle = 50 μm. (C) Nombre moyen de noyaux épithéliaux EdU+ par mouche à 2 dpi : ctrl (n = 37), myc^RNAi#1 (n = 10) et Myc (n = 8). Les barres d’erreur indiquent l’erreur standard ; la signification statistique a été mesurée par l’intermédiaire du t-test de l’étudiant, *P < 0,05, **P < 0,01. (D) Schéma de détection et de mesure du stratagème nucléaire épithélial. Les noyaux épithéliaux ont été identifiés et seuilnés par la tache anti-Grh aux Fidji. Les noyaux épithéliales qui se chevauchaient ont été séparés (pointes de flèche vertes) ou enlevés (pointes de flèche rouges) s’ils étaient recouverts de nucles nonpithéliaux. La densité intégrée et la zone nucléaire de l’image de noyaux tachés de DAPI correspondantes ont été mesurées. (E) La taille nucléaire épithéliale (Grh) a été modifiée par l’expression myc à 3 dpi. (F) Stratagème nucléaire épithélial (%) à 3 dpi : ctrl (n = 4), myc^RNAi#1 (n = 6), et Myc (n = 3). Adapté de Grendler et coll.¹⁶. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Présenté est un protocole détaillé sur la façon de disséquer et d’utiliser l’épithélium abdominal adulte D. melanogaster pour étudier comment les gènes régulent wip en modifiant la rééuplelitialité et l’endoréplication pendant la réparation des plaies¹⁶. En utilisant cette méthode, le myc proto-oncogène a récemment été identifié comme un régulateur clé de WIP. Myc est nécessaire pour les cellules épithéliales à endoreplicate post blessure et est suffisant pour les cellules épithéliales quiescentes à endocycle à la fois dans l’épithélium mouche adulte et les glandes accessoires^16,22. Il a également été constaté que le passage des cellules épithéliales à un cycle cellulaire mitotique par l’expression de stg, fzr^RNAi est préjudiciable à la réparation des plaies. La poursuite des études utilisant cette méthode permettra d’identifier d’autres gènes nécessaires pour réguler la rééuplelitialité et l’endoréplication pendant le WIP, révélant à la fois des similitudes et des différences à la façon dont le polyploïdage est réglementé et fonctionne dans une variété de tissus.

Ce modèle et cette méthode offrent des avantages uniques, y compris l’induction facile de polyploïdage avec une perforation mécanique et le fait que les cellules polyploïdes sont générées en quelques jours⁴. Les protocoles de dissection et de préparation des tissus sont basés sur les techniques de dissection larvaire^23,mais l’abdomen de mouche adulte est plus rigide et donc facilement perturbé. En conséquence, ce protocole exige la pratique et la précision pour isoler un tissu intact pour étudier WIP. Une fois disséqué, cependant, l’épithélium est clairement visible et facilement photographié, donnant un instantané du processus de cicatrisation des plaies. Cette méthode fournit une mine d’informations sur l’organisation épithéliale de la mouche adulte, la taille des cellules et du syncytium, et le stratagème des cellules et des noyaux individuels. Bien que l’imagerie en direct ne soit pas encore possible dans la mouche des fruits intacte en raison de sa cuticule opaque, ce protocole pourrait être adapté pour inclure les conditions de culture ex vivo actuellement disponibles utilisées à D. melanogaster pour effectuer des études d’imagerie en direct à court terme²⁴.

À l’avenir, ce modèle sera idéal pour étudier le crosstalk de cellule à cellule et la contribution d’autres types de cellules au WIP en régulant l’expression des gènes avec le système Gal4/UAS dans d’autres types d’intérêts cellulaires. Des questions similaires peuvent également être répondues en utilisant une variété de milieux génétiques et mutants. L’abdomen de mouche adulte disséqué contient une variété de types de cellules qui peuvent être facilement visualisés à l’aide de cette méthode, y compris le corps gras et les oénocytes, fibres musculaires latérales, neurones sensoriels, trachée, et les hémocytes macrophage-like. En outre, ce modèle permettra aux chercheurs d’étudier comment les variables physiologiques influencent le WIP, y compris le sexe, l’alimentation, l’infection, l’âge et les facteurs de stress environnementaux. Bien que le protocole utilise la mouche femelle adulte en raison de sa plus grande taille, WIP se produit également dans la mouche des fruits mâles (Gjelsvik et Losick, inédit). Les cellules polyploïdes se sont avérées survenir pendant le vieillissement et la maladie associée à l’âge dans le foie, le cerveau, l’oeil et le coeur de mammifères^12. Le modèle de la mouche des fruits permettra aux chercheurs d’étudier la polyploïdisation dans des contextes physiologiques et de maladies parce que les gènes liés aux maladies humaines sont fortement conservés.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîtes de Pétri 35 mm	Fisher Scientific	FB0875713	Pour la création de plaques à disséquer dans des
tubes à centrifuger coniques de 50 mL	Fisher Scientific	14-432-22	Pour la préparation de réactifs de coloration dans
AxioImager M2 avec Apotome	Zeiss	NA	Pour l’imagerie d’échantillons
Sarbacane mini	Genesee Scientific	54-104M	Pour l’anesthésification de D. melanogaster souches
Sérum bovin Albumine, 30 %	Sigma	A7284-500ML	Pour l’immuocoloration Réservoir de
dioxyde de carbone	divers distributeurs	N/A	Pour l’anesthésisation des souches de D. melanogaster
Click-iT EdU 594 Kit	Thermofisher	C10339	Pour le dosage EdU
Lamelles	Thermofisher	3406	Pour le montage
DAPI	Sigma	D9542-10MG	Pour l’immuocoloration
Plaques de dissection (utilisez le kit élastique Sylgard 184 SIL)	Adhésifs Ellsworth	184SIL	Pour la création de plaques à disséquer. Mélanger l’époxy comme indiqué, laisser sécher pendant la nuit
Anticorps secondaire Donkey anti-Rabbit IgG (H+L), conjugué Alexa Fluor 488	Thermofisher	A21206	Pour l’immuocoloration secondaire
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire, conjugué Alexa Fluor 568	Thermofisher	A10042	Pour l’immuocoloration secondaire
Tubes et raccords pour drosophile	Genesee Scientific	59-124C, 59-123, 59-140	Pour l’anesthésification des souches de D. melanogaster
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Pour la dissection de l’épi-Gal4
	Bloomington Drosophila Stock Center (b)	b38793	Losick et al. Current Biology, 2013
epi-Gal4, UAS-mCD8.RFP	Bloomington Drosophila Stock Center (b)	b38793, b27392	Losick et al. Current Biology, 2013
Excel	Microsoft		Pour effectuer des calculs de ploïdie
Fiji/ImageJ (logiciel d’analyse d’images)	NIH	a href="https://imagej.nih.gov/ij » target="_blank">https://imagej.nih.gov/ij	Pour l’analyse d’images
Nourriture pour mouches	Archon Scientific N	/A	Sirop de maïs/Nourriture pour soja
Flystuff Flypad	Genesee Scientific	59-114	Pour l’anesthésie D. souches de melanogaster
Boîte de dissection en verre	Fisher Scientific	13-748B	Pour effectuer des dissections dans des
lames de verre	Fisher Scientific	12-518-104C	Pour le montage
d’un anticorps secondaire anti-IgG de souris (H+L) de chèvre, conjugué Alexa Fluor 488	Thermofisher	A11001	Pour une coloration secondaire d’un
secondaire anti-IgG de souris (H+L) de chèvre, Alexa Fluor 568 conjugué	Thermofisher	A11031	Pour l’immuocoloration secondaire
Insecte de Grace Milieu, non supplémenté	Thermofisher	11595030	Pour la dissection dans
des épingles à insectes	Outils scientifiques fins	26002-10	Pour blesser et épingler les abdomens des mouches plates
Souris anti-fasciclin III (Drosophile) Anticorps primaires	Études de développement Banque d’hybridomes	7G10	Pour l’immunocoloration des jonctions cellulaires épithéliales
Milieux de montage	Vector Laboratories	H-1000	Supports de montage anti-décoloration pour éviter le photoblanchiment pendant l’imagerie
Vernis à ongles	Microscopie électronique Sciences	72180	Pour le scellement des lames Agitateur
orthographique	Fisher Scientific	02-217-988	Pour l’immuocoloration
Phosphate Saline tamponné, PH 7.4	Sigma	P3813-10PAK	Pour la coloration
Porte-goupilles	Outils de science fine	91606-07	Pour blesser
lapin Anti-tête granuleuse Anticorps primaire	N/A	N/A	Pour l’immunocoloration des noyaux épithéliaux. Un protocole pour fabriquer des anticorps peut être trouvé (Réf. #4 et 8)
Anticorps primaire anti-RFP	de lapin MBL	PM005	Pour l’immunomarquage de l’épithélium de la mouche mCD8-RFP
Stéréomicroscope	Olympus	SZ51	Pour la dissection et le montage de tissus de mouches
Triton X-100	Sigma	10789704001	Pour l’immuocoloration de l’ARNi
UAS-E2F, de l’UAS-RacDN	VDRC (v) et du Bloomington Drosophila Stock Center (b)	v108837, b6292	Losick et al. Current Biology, 2013
UAS-fzr RNAi, UAS-Stg	VDRC (v) et Bloomington Drosophila Stock Center (b)	v25550, b56562	Grendler et al. Development, 2019
UAS-Myc	Bloomington Drosophila Stock Center (b)	b9674	Grendler et al. Development, 2019
UAS-myc RNAi	Bloomington Drosophila Stock Center (b)	b36123	Grendler et al. Développement, 2019
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-00	Pour la dissection