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Article de méthode

Modélisation des métastases cérébrales par injection intracrânienne et imagerie par résonance magnétique

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DOI :

10.3791/61272

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7 juin 2020

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1The Comprehensive Cancer Center, The Ohio State University, 2Department of Radiation Oncology, The Ohio State University, 3Department of Veterinary Biosciences, The Ohio State University, 4Davis Heart & Lung Research Institute, The Ohio State University

Dans cet article

Résumé

La modélisation intracrânienne de métastase de cerveau est compliquée par une incapacité de surveiller la taille et la réponse de tumeur au traitement avec des méthodes précises et opportunes. La méthodologie présentée couple l’injection intracrânienne de tumeur avec l’analyse de formation image de résonance magnétique, qui une fois combinée, cultive des injections précises et cohérentes, la surveillance accrue d’animal, et les mesures précises de volume de tumeur.

Résumé

La propagation métastatique du cancer est une conséquence malheureuse de la progression de la maladie, des sous-types agressifs de cancer et/ou du diagnostic tardif. Les métastases cérébrales sont particulièrement dévastatrices, difficiles à traiter et confèrent un mauvais pronostic. Bien que l’incidence précise des métastases cérébrales aux États-Unis demeure difficile à estimer, elle est susceptible d’augmenter à mesure que les thérapies extracrâniens continuent de devenir plus efficaces dans le traitement du cancer. Ainsi, il est nécessaire d’identifier et de développer de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter la métastase à ce site. À cette fin, l’injection intracrânienne de cellules cancéreuses est devenue une méthode bien établie pour modéliser la métastase cérébrale. Précédemment, l’incapacité de mesurer directement la croissance de tumeur a été un obstacle technique à ce modèle ; cependant, l’augmentation de la disponibilité et de la qualité des modalités d’imagerie des petits animaux, telles que l’imagerie par résonance magnétique (IRM), améliorent considérablement la capacité de surveiller la croissance tumorale au fil du temps et inférer les changements dans le cerveau au cours de la période expérimentale. Ici, l’injection intracrânienne des cellules mammaires murines de tumeur dans les souris immunocompétentes suivies de MRI est démontrée. L’approche d’injection présentée utilise l’anesthésie isoflurane et une configuration stéréotaxique avec une perceuse et une injection d’aiguilles contrôlées numériquement pour améliorer la précision et réduire les erreurs techniques. L’IRM est mesurée au fil du temps à l’aide d’un instrument de 9,4 Tesla dans l’Ohio State University James Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource. Des mesures de volume de tumeur sont démontrées à chaque point de temps par l’utilisation d’ImageJ. Dans l’ensemble, cette approche d’injection intracrânienne permet une injection précise, une surveillance quotidienne et des mesures précises du volume tumoral, qui, combinées, améliorent considérablement l’utilité de ce système modèle pour tester de nouvelles hypothèses sur les conducteurs de métastases cérébrales.

Introduction

Les métastases cérébrales sont 10 fois plus fréquentes que les tumeurs primaires adultes du système nerveux central1, et ont été rapportées dans presque tous les types de tumeurs solides avec le cancer du poumon, le cancer du sein et le mélanome présentant l’incidence la plusélevée 2. Indépendamment du site primaire de tumeur, le développement de la métastase de cerveau mène à un pronostic pauvre souvent lié au déclin cognitif, aux maux de tête persistants, aux saisies, aux changements comportementaux et/ou depersonnalité 1,,3,,4,,5. En ce qui concerne le cancer du sein, il y a eu de nombreux progrès dans la prévention et le traitement de la maladie. Cependant, 30% de femmes diagnostiquées avec le cancer du sein continuera à développer des métastases, et de ceux avec la maladie de stade IV, approximativement 7% (SEER 2010-2013) ont la métastase de cerveau6,7. Les options actuelles de traitement pour la métastase cérébrale impliquent la résection chirurgicale, la radiochirurgie stéréotaxique et/ou la radiothérapie entière de cerveau. Pourtant, même avec cette thérapie agressive, la survie médiane pour ces patients est un court 8-11 mois7,8,9. Ces statistiques sinistres soutiennent fortement la nécessité d’identifier et de mettre en œuvre de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces. Ainsi, comme pour tous les cancers qui métastasent au cerveau, il est essentiel de modéliser correctement les métastases cérébrales associées au cancer du sein (BCBM) en laboratoire afin d’assurer des progrès significatifs dans le domaine.

Jusqu’ici, les chercheurs ont utilisé une série de méthodologies pour étudier des mécanismes de métastase au cerveau, chacun avec des avantages et des limitationsdistincts 10,11. Les méthodes expérimentales de métastase telles que la veine de queue et l’injection intracardiaque propagent des cellules tumorales dans tout le corps et peuvent avoir comme conséquence la charge immense de tumeur à d’autres emplacements métastatiques selon les cellules injectées. Ces résultats sont alors déroutants si spécifiquement l’étude des métastases au cerveau. La méthode d’injection de l’artère intracarotide est avantageuse car elle cible spécifiquement l’ensemencement du cerveau des cellules tumorales, mais elle est limitée car elle peut être techniquement difficile à effectuer. La résection primaire orthotopique de tumeur est souvent considérée le modèle le plus médicalement pertinent de métastase car elle récapitule la cascade métastatique entière. Pourtant, cette approche implique des périodes d’attente prolongées pour la métastase spontanée à se produire avec des taux considérablement inférieurs de métastase cérébrale par rapport aux autres sites métastatiques tels que le ganglion lymphatique, le poumon et le foie. Souvent, les animaux doivent être retirés des études en raison de la charge tumorale à ces autres sites métastatiques avant le développement de métastases cérébrales. D’autres méthodes impliquant des lignées cellulaires tropicales cérébrales sont efficaces pour métastaser le cerveau; cependant, ces modèles sont limités en ce qu’ils prennent le temps de se développer et perdent souvent leur tropisme avec la propagation. Compte tenu de ces limitations, les chercheurs ont couramment utilisé la méthode d’injection intracrânienne pour modéliser la métastase du cancerau cerveau 11,12,13,14 avec différentesméthodologies 15,16,17,18,19. Il est reconnu que cette approche a également des limites, plus important encore en ce qu’elle ne permet pas l’étude des étapes métastatiques tôt comprenant l’intravasation hors de la tumeur primaire, la pénétration par la barrière de cerveau de sang, et l’établissement dans le cerveau. Cependant, il permet aux chercheurs de tester (1) quels facteurs dérivés de tumeurs médient la croissance dans le cerveau (p. ex., manipulation génétique d’un facteur oncogène dans les cellules tumorales), (2) comment les changements dans le microenvironnement métastatique modifient la croissance du cancer à ce site (p. ex., comparaison entre les souris transgéniques avec des composants stromaux modifiés) et (3) l’efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques sur la croissance des lésions établies.

Compte tenu de l’utilité potentielle du modèle d’injection intracrânienne, il est absolument nécessaire de réduire les erreurs techniques pendant l’injection et de surveiller avec précision la croissance tumorale au fil du temps. La méthode décrite ci-après implique le dosage continu de l’anesthésie inhalée de gaz, et l’implantation directe des cellules de tumeur dans le parenchyme de cerveau utilisant une perceuse stéréotaxique et un support d’injection. L’administration d’anesthésique au gaz permet de peaufiner la profondeur et la durée de l’anesthésie ainsi que d’assurer une récupération rapide et douce. Un système automatisé de forage et d’injection d’aiguilles contrôlé numériquement améliore la précision du site d’injection et réduit les erreurs techniques souvent contractées par les méthodes de forage et d’injection à main libre. L’utilisation de l’imagerie par résonance magnétique (IRM) augmente encore la précision dans la surveillance de la croissance tumorale, du volume tumoral, de la réponse tissulaire, de la nécrose tumorale et de la réponse au traitement. L’IRM est la modalité d’imagerie de choix pour les tissusmous 20,21. Cette technique d’imagerie n’utilise pas de rayonnement ionisant et est préférée à la tomographie calculée (Tomodensitométrie), en particulier pour plusieurs séances d’imagerie au cours d’une étude. Mri a une gamme beaucoup plus grande de contraste disponible de tissu mou puis ct ou imagerie par ultrasons (USG) et présente l’anatomie plus en détail. Il est plus sensible et spécifique pour les anomalies dans le cerveau lui-même. L’IRM peut être effectuée dans n’importe quel plan d’imagerie sans avoir à déplacer physiquement le sujet comme c’est le cas dans l’imagerie optique 2D USG ou 2D. Il est important de mentionner que le crâne n’atténue pas le signal IRM comme dans d’autres modalités d’imagerie. L’IRM permet l’évaluation de structures qui peuvent être masquées par des artefacts provenant d’os dans la Tomodensive ou l’USG. Un avantage supplémentaire est qu’il y a beaucoup d’agents de contraste disponibles pour MRI, qui augmente la limite de détection de lésion, avec la toxicité ou les effets secondaires relativement bas. Fait important, l’IRM permet de surveiller en temps réel contrairement à l’évaluation histologique au moment de l’autopsie, qui est limitée dans le déchiffrage du volume tumoral. D’autres modalités d’imagerie, telles que l’imagerie bioluminescente, sont en effet efficaces pour la détection et la surveillance précoces des tumeurs au fil du temps; toutefois, cette méthode exige une manipulation génétique (p. ex., le marquage luciferase/GFP) des lignées cellulaires et ne permet pas de mesures volumétriques. Mri est plus avantageux car il reflète la surveillance patiente et l’analyse volumétrique en aval des images de MR est connue pour être fortement corrélée à la taille histologique de tumeur àl’autopsie 22. La surveillance en série avec le criblage de MRI augmente également la surveillance clinique des affaiblissements neurologiques, si elles se présentent.

Dans l’ensemble, la méthode présentée de l’injection intracrânienne stéréotaxique de tumeur suivie de MRI périodique nous permet de produire des résultats fiables, prévisibles, et mesurables pour étudier des mécanismes de métastase de cerveau dans le cancer.

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Protocole

Toutes les méthodes décrites dans le ci-dessous ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Ohio State University (P.I. Gina Sizemore; Protocole #2007A0120). Toutes les politiques d’IACUC de chirurgie de survie de rongeur sont suivies, y compris l’utilisation des techniques stériles, des approvisionnements, des instruments, aussi bien que l’enlèvement de fourrure et la préparation stérile du site d’incision.

1. Injection intracrânienne de cellules cancéreuses du sein

NOTE : La méthode décrite ci-dessus a utilisé la ligne mammaire de cellules mammaires de murine de DB7 dérivée d’une tumeur primaire de MMTV-PyMT 23. Des études antérieures ont établi l’injection intracrânienne des cellules DB7 comme modèle de BCBM avec l’histologie qui imite celle de la maladie humaine12. Fait important, les souris FVB/N immuno-compétentes sont utilisées pour ce modèle car les cellules DB7 ont été dérivées de cette souche de souris. Comme il s’agit d’un modèle de cancer du sein, les souris femelles adultes sont utilisées pour ces études.

  1. Préparez les cellules.
    1. Dans une hotte stérile, aspirer les médias à partir de plaques de culture cellulaire en utilisant des techniques standard.
    2. Laver les cellules avec 1x DPBS et trypsiniser en utilisant le protocole du fabricant.
    3. Ajoutez un volume approprié de supports contenant du FBS pour arrêter la réaction de trypsine et déterminer la concentration de cellules à l’aide d’un hémocytomètre ou d’une méthode préférée.
    4. Cellules de granulés à 300 x g pendant 4 min à 4 °C.
    5. Aspirer les supports, laver avec 1x DPBS, re-spin à 300 x g pendant 4 min à 4 °C.
    6. Resuspendez les cellules dans 1x DPBS à une concentration appropriée, environ 50.000 cellules par volume injectable de 2 μL.
      REMARQUE : Le numéro de cellule dépend de l’agressivité de la ligne et doit être déterminé par l’enquêteur. Nous utilisons régulièrement 2 μL, mais l’utilisation de volumes <6 μL estrapportée 15,16,17,18,19. De faibles volumes sont essentiels pour maintenir la précision.
    7. Placer les cellules résuspendées sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient injectées pour maintenir la viabilité.
  2. Préparez les souris à la chirurgie.
    1. Pour les souris à fourrure : retirer la fourrure du crâne, soit par crème depilatory/lotion, soit en la rasant. Faites ceci dans les 24-48 h avant la chirurgie car l’exécution de cette étape trop près de la chirurgie peut interférer avec la qualité de peau et la force de suture.
      REMARQUE : Des souris FVB/N femelles pesant approximativement 25 g ont été employées en raison de l’étude du cancer du sein métastatique, une maladie principalement femelle.
    2. Administrer des analgésiques tels que déterminés par l’IACUC et le vétérinaire traitant : injection sous-cutanée de Buprénorphine SR-LAB (dose de 0,05 à 0,1 mg/kg, Stock de buprénorphine: 0,5 mg/mL pour une dose de 0,0025-0,088 mL) au moins 24 h avant la chirurgie pour fournir jusqu’à 72 h d’analgésie, qui peut être répétée 48-72 h après la première dose, si nécessaire. Administrer également des AINS (20 % d’ibuprofène dans l’eau potable, p. ex., 1 mg/5 mL) au moins 24 à 48 h avant la chirurgie et poursuivre pendant 2 à 7 jours après la chirurgie afin de fournir une analgésie postopératoire d’au moins 72 h.
      REMARQUE : À l’Université d’État de l’Ohio, buprénorphine SR-LAB est administrée par le personnel vétérinaire de l’University Lab Animal Resources car il s’agit d’une substance contrôlée.
  3. Préparer des unités stéréotaxtiques pour la chirurgie.
    1. Allumez toutes les machines d’anesthésie, les balances vernier numériques et les injecteurs numériques.
      REMARQUE : Tous les outils chirurgicaux doivent être nettoyés et stérilisés adéquatement avant la chirurgie.
    2. Utilisez des appareils anesthésiques avec une pièce jointe de chambre d’induction dans un coffret de sécuritébiologique ( figure 1A).
    3. Assurez-vous que tous les tubes des appareils d’anesthésie sont connectés aux cadres stéréotaxiques (figure 1B, inset 1C) et que les pinces sur les tubes sont ouvertes pour toutes les unités utilisées. Fermez les pinces sur les tubes allant à des cadres stéréotaxiques qui ne seront pas utilisés pour la chirurgie.
    4. Réglez les appareils d’anesthésie au taux recommandé de débit du cône avant par le fabricant en fonction du poids de la souris (p. ex., poids des animaux de 25 g : débit du cône avant de 34 mL/min).
      REMARQUE : Le porte-tête inclus dans cette mise en place stéréotaxique n’est recommandé que pour les souris adultes. Assurez-vous que les recommandations du fabricant incluses dans la mise en place stéréotaxique sont suivies.
    5. Assurez-vous que l’anesthésie appropriée (p. ex., isoflurane) précalillée dans la seringue est fixée à la machine d’anesthésie (figure 1B).
      REMARQUE : L’amorçage de la seringue peut causer trop d’anesthésie pour être administrée aux souris pendant la chirurgie et entraîner une surdose anesthésique.
    6. Préparez les perceuses en tordant la serrure de scène, en insérant un adaptateur de bits de perceuse et un foret de 1 mm dans chaque perceuse et verrouillez la perceuse en serrant manuellement le verrou de bits.
    7. Attachez des perceuses sur les cadres stéréotaxiques( figure 1C).
    8. Nettoyez les seringues Hamilton avec 5 lavages alternatifs de 1x DPBS, puis 70% d’éthanol, puis une fois de plus en 1x DPBS. Mettre de côté jusqu’à ce que l’animal soit préparé pour l’injection.
    9. Réglez l’injecteur numérique pour livrer à un taux de 0,4 μL/min et un objectif de 2 μL. Ce taux et ce volume permettent l’introduction lente de cellules tumorales dans le cerveau, ce qui réduit la pression et les dommages associés.
  4. Placez les souris sur des cadres stéréotaxiques.
    1. Anesthésier les souris (p. ex., l’isoflurane) à l’aide de la chambre d’induction susmentionnée.
    2. Maintenez les souris tout au long de la procédure à un plan anesthésique profond. L’anesthésie en % administrée par la machine dépend d’un certain nombre de facteurs, y compris : le débit, le degré de stimulation et la température corporelle. Surveiller fréquemment les souris tout au long de la procédure pour la profondeur de l’anesthésie en évaluant les respirations rythmiques (l’animal n’est pas haletant); manque de réflexe palpebral (flottement des paupières lorsqu’il est stimulé avec un applicateur à pointe de coton); et l’absence de pincement des pieds (retrait du membre sur le stimulus nocif de pincer les pieds).
      REMARQUE : Différentes souches de souris auront une réponse différente à l’anesthésie.
    3. Une fois que les souris sont à un plan anesthésique approprié et profond, transférez les souris à l’unité stéréotaxique. Utilisez un coussin chauffant pendant que la souris est sur la machine stéréotaxique pour maintenir la température corporelle et un plan anesthésique approprié.
      REMARQUE : Pour obtenir un profil bas, nous utilisons des chauffe-mains activés à l’air placés dans une boîte à pointes de pipette inversée (boîte d’élévation de souris dans la figure 1D).
    4. Ouvrez la bouche de la souris et placez les dents dans l’auge de la barre buccale située sur le morceau de nez sur le cadre stéréotaxique (Figure 2A). Faites glisser le cône avant sur le nez/la bouche de la souris (figure 2B).
      1. Placez les souris avec leurs têtes au niveau de la barre buccae. Ouvrez doucement la bouche avec l’extrémité émoussée d’un applicateur à pointe de coton et glissez-la en place. Assurez-vous que le cône avant est entièrement au-dessus du nez de la souris ou que l’anesthésie ne sera pas livrée correctement. Le cône avant ne s’engagera pas avec le nez si les dents ne sont pas assises dans cette rainure (Inset Figure 2A).
    5. À l’aide d’un coton-tige stérile, placez le lubrifiant oculaire sur chacun des yeux de la souris. L’application du lubrifiant pour les yeux atténue le séchage de la cornée et réduit le risque de lésions cornéenelles et de complications postopératoires liées à un traumatisme cornéen.
    6. Stabilisez le crâne de la souris en déprimant la barre d’oreille gauche contre le canthus médial de l’oreille gauche, en la verroutant en place à l’aide de la vis sur le cadre stéréotaxique. Faites ensuite glisser la barre d’oreille droite contre le canthus médial de l’oreille droite et vissez bien sur le cadre stéréotaxique (Figure 2B).
      REMARQUE : Assurez-vous que la tête de la souris est de niveau et droite lorsque vous placez des barres d’oreille. Si la tête est tordue ou inclinée, l’injection sera à l’endroit incorrect dans le cerveau. Les barres d’oreille doivent être serrées seulement jusqu’à ce que le crâne soit immobilisé sur la stimulation avec l’enquête manuelle modérée.
  5. Faites une fenêtre calvariale.
    1. Préparer et nettoyer le cuir chevelu avec 3x en alternance passe chacun d’une solution de bétadine et 70% d’éthanol. En raison de la proximité du site chirurgical aux yeux, utilisez la solution de bêtadine au-dessus du gommage chirurgical.
    2. À l’aide d’un scalpel stérile, faire une incision de 3 mm à travers la peau le long de l’aspect médian central du crâne (suivant la ligne de suture sagittale). Les saignements à l’incision doivent être minimes. Si elle se produit, appliquer une pression constante et ferme sur le site du saignement avec un applicateur stérile pointe de coton pendant >30 secondes.
    3. Identifiez et orientez la perpendiculaire à la bregma(figure 2C),en vous assurant de réinitialiser l’échelle vernier numérique à zéro.
    4. Déplacez la perceuse latérale de 2 mm vers la suture sagittale et de 1 mm antérieure à la suture coronale (figure 2C). Pour la reproductibilité, assurez-vous que l’emplacement à gauche ou à droite de la ligne de suture sagittale demeure cohérent pour tous les animaux.
    5. Tournez la perceuse à sa vitesse la plus élevée. Assurez-vous que la peau est éloignée de la perceuse afin d’éviter les dommages tissulaires causés par le bit rotatif et d’initier soigneusement la perceuse sur le crâne. Percer un trou d’environ 0,5 mm de profondeur à travers la calvaria, ce qui entraîne la fenêtre calvariale. Veillez à ne pas abaisser la perceuse trop loin ou il va percer dans le cerveau. La chute de solution saline stérile sur le site de forage pendant que la perceuse est en mouvement peut compenser toute chaleur générée par la machine qui peut causer des dommages thermiques aux tissus environnants.
    6. Une fois que la fenêtre calvariale est faite, soulevez soigneusement la perceuse et retirez-la du cadre stéréotaxique.
    7. Nettoyez les morceaux de forage à l’aide de 70 % d’éthanol et mettez-les de côté s’ils sont utilisés à nouveau. Si ce n’est pas le cas, retirez les foreuses et submergez-les dans 70 % d’éthanol.
  6. Injection de cellules cancéreuses dans le cerveau
    1. Attachez l’unité d’injecteur automatique à l’appareil stéréotaxique(figure 1D).
    2. Tirez vers le haut >2 μL des cellules complètement résuspendées dans 1x DPBS dans une seringue propre de Hamilton. Assurez-vous de résuspendre les cellules immédiatement avant de remplir la seringue afin de réduire la formation des touffes et d’assurer une boue cellulaire homogène. Il est idéal pour extraire 6-8μL de volume cellulaire pour s’assurer qu’il n’y a pas de poches d’air / bulles.
    3. Placez la seringue Hamilton sur l’appareil injecteur et amorcez l’aiguille pour injection en distribuant une petite quantité de volume sur un drapé stérile jetable pour vous assurer que l’injecteur fonctionne correctement. Essuyez la seringue avec 70 % d’éthanol à l’aide d’un applicateur à pointe decoton (figure 1D, inset). Ceci enlève des cellules de tumeur du baril externe de l’axe d’aiguille réduisant le risque d’ensemencement de cellules de tumeur le long du tractus d’injection.
    4. Alignez la pointe de l’aiguille au centre de la fenêtre calvariale, en touchant presque le cerveau exposé.
    5. Réinitialisez l’échelle vernier numérique à zéro.
    6. Insérez lentement l’aiguille à une profondeur de 3 mm dans le cerveau et laissez l’aiguille rester dans le cerveau pendant au moins 60 secondes avant de procéder. Ce délai permet au parenchyme cérébral de se conformer autour de l’aiguille, ce qui réduit la pression du dos et l’expulsion potentielle des cellules tumorales le long du tractus d’aiguille.
    7. Sélectionnez Exécuter sur l’écran de l’injecteur pour commencer la livraison des cellules au site d’injection. Il faudra environ 5 minutes pour injecter ce volume. Le temps prolongé pour cette étape est de réduire les dommages secondaires causés par la force d’injection sur le parenchyme cérébral.
    8. Une fois le protocole d’injection terminé, laissez l’aiguille reposer dans le cerveau pendant au moins 3 minutes, permettant à nouveau au parenchyme cérébral de s’acclimater à l’injection.
    9. Après au moins 3 min, soulever l’aiguille du cerveau à une vitesse de 0,75 mm/min. Faites ceci d’une manière extrêmement lente et cohérente pour réduire la pression arrière et le suivi de tumeur vers le haut du tractus d’aiguille.
    10. Une fois que l’aiguille est sortie du cerveau, retirez soigneusement la seringue Hamilton de l’injecteur et nettoyez comme décrit à l’étape 1.2.8.
    11. Appliquer de la cire d’os chaude sur la fenêtre calvariale à l’aide d’un coton-tige stérile. La cire osseuse agit comme une barrière physique pour garder la tumeur dans le crâne.
    12. Fermer l’incision (p. ex., sutures dissolubles 5-0 PDS dans un simple motif interrompu ou pinces de suture, selon le plus confortable pour le chirurgien).
    13. Arrêtez l’administration de l’anesthésie et retirez la souris de l’appareil en déverrouillant et en glissant les barreaux d’oreille, en glissant le cône avant de la souris et en désengageant les dents de la barre buccale.
    14. Placez la souris dans une cage propre qui est sur un ensemble plus chaud à 37 °C pour la récupération. Surveiller les souris pendant la récupération, qui se produit généralement 10-15 minutes après l’anesthésie a été abandonnée.
    15. Une fois la souris récupérée, surveillez les critères de retrait précoce tels que déterminés par l’IACUC de l’établissement hôte.

2. Imagerie par résonance magnétique

  1. Administrer l’agent de contraste à base de Gadolinium (souris de poids corporel de 100 μL/20 g de 0,1 M multihance) aux souris par injection intraperitoneal standard24 10-20 minutes avant la formation image. Anesthésiez ensuite à l’aide d’une chambre d’induction avec un anesthésique inhalé (p. ex., isoflurane) mélangé à 95 % d’O2 et 5 % de CO2 (c.-à-d. du gaz d’air de pièce fourni).
  2. Placez la souris sur un support chauffant pour maintenir la température corporelle. Fixez la tête avec des dents d’oreille et une barre de morsure, et placez le support dans l’aimant de 9,4 T équipé d’une bobine de surface de cerveau de souris. Maintenir l’anesthésie pendant le temps d’imagerie, une étude prend généralement environ 20 min par souris. Surveillez la fréquence respiratoire et la fréquence cardiaque (~70 bpm) tout au long de l’intervention à l’aide d’un oreiller pneumatique et d’un système de surveillance des petits animaux.
  3. Obtenez une image localisante, puis imagez le cerveau de la souris à l’aide d’une séquence RARE pondérée en T2 (TR = 3500-4228 ms, TE=12 ms, RARE Factor = 8, FOV=2,0 x 2,0 cm, taille matricielle = 256 x 256, 1 mm ou 0,5 mm d’épaisseur de tranche, NA=2-4, 15-30 tranches contiguës) et après gadolinium-basé contraste T1 pondéré séquence RARE (TR = 1200 ms, TE =7,5 ms, RARE Factor = 4 , FOV=2,0 x 2,0 cm, taille matricielle = 256 x 256, 1 mm ou 0,5 mm d’épaisseur de tranche, NA=2-4, 15-30 tranches contiguës).
  4. Après l’imagerie, placer la souris dans une cage sur un ensemble plus chaud à 37 °C pour la récupération.

3. Mesures volumétriques de tumeur

  1. Obtention du volume total de tumeur
    1. Ouvrez le fichier de données MRI DICOM dans ImageJ, un logiciel de traitement d’image disponible en téléchargement gratuit par l’intermédiaire des National Institutes of Health (https://imagej.nih.gov/ij/)25.
      REMARQUE : ImageJ permet de visualiser les fichiers DICOM, qui sont tenus d’utiliser les dimensions des pixels intégrés pour les calculs du volume tumoral (voir Image, Propriétés où « unité de longueur » peut être définie comme souhaité (p. ex., mm)).
    2. Utilisez l’outil Sélections à main levée pour dessiner un contour autour de la tumeur. Effectuez ces sélections dans une pièce sombre pour améliorer la visibilité. N’ajustez pas la luminosité/contraste pour maintenir la cohérence entre les sessions.
    3. Sous l’onglet Analyser, sélectionnez Mesure pour obtenir la zone de la région sélectionnée. Si l’unité de millimètres a été choisie à l’étape 3.1.1., la surface sera donnée en millimètres cubes. Si vous le souhaitez, intégriez la Sélection à main levée en sélectionnant ctrl+D. Changer la couleur de sortie en allant à Modifier | Options | Couleur. Convertir l’image en une image RVB (Image | Type | Couleur RGB) avant d’enregistrer en tant que .tif fichier.
    4. Procédez à la mesure de toutes les tranches contenant des tumeurs pour une souris individuelle et copiez les valeurs dans un logiciel d’analyse de données approprié (p. ex., Microsoft Excel ou GraphPad Prism).
    5. Résumer les zones de chaque tranche pour obtenir le volume total de la tumeur. Assurez-vous de corriger la zone en fonction de l’épaisseur de la tranche (zone/épaisseur).
    6. Étapes complètes 3.1.1.-3.1.5. jusqu’à ce que toutes les souris aient un volume total de tumeur. Compte tenu de la nature quelque peu subjective de la caractéristique des tumeurs, il est idéal si la même méthodologie est répétée plusieurs fois et moyenne pour réduire l’erreur technique.
    7. Pour définir des barres d’échelle, ouvrez le fichier de données DICOM et allez analyser | Outils | Barre d’échelle. Étant donné que les dimensions sont déjà intégrées dans le fichier DICOM, il suffit de choisir la longueur/largeur désirée. Secrète à une image RVB (Image | Type | Couleur RGB) avant d’enregistrer en tant que .tif fichier.

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Résultats

La figure 3 donne une vue d’ensemble de la quantification du volume tumoral d’une seule souris à deux moments (jour 7 et jour 10) après l’injection de cellules tumorales mammaires murines. Pour cette expérience, 50.000 cellules DB7 ont été injectées, et le cerveau de l’animal a été évalué par IRM. Pour chaque scan, 30 tranches (épaisseur de 0,5 mm) ont été capturées. L’évaluation des 30 tranches par balayage a révélé qu’au jour 7 après l’injection, 5 tranches présentaient une charge tumorale...

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Discussion

L’utilisation de l’injection intracrânienne suivie de la surveillance en série avec MRI fournit la capacité unique de visualiser la croissance de tumeur avec la précision de volume de tumeur au fil du temps. L’application de l’analyse numérique d’imagerie permet l’interprétation des lésions cérébrales pour le volume de tumeur, l’hémorragie, la nécrose, et la réponse au traitement.

Comme pour toute procédure, il y a des étapes clés qui doivent être suivies pour réussir. Tout d’abord, une instal...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas de divulgations.

Remerciements

Les données représentatives ont été financées par le National Cancer Institute (K22CA218472 à G.M.S.). Les injections intracrâniens sont effectuées dans l’Ohio State University Comprehensive Cancer Center Target Cancer Center Target Validation Shared Resource (Directeur - Dr Reena Shakya) et l’IRM est terminée à l’Université d’État de l’Ohio Comprehensive Cancer Center Small Animal Imaging Shared Resource (Directeur - Dr Kimerly Powell). Les deux ressources partagées sont financées par l’OSUCCC, la subvention de soutien du Centre de cancérogène de l’OSUCCC du National Cancer Institute (P30 CA016058), des partenariats avec les collèges et départements de l’Université d’État de l’Ohio et des systèmes de recharge établis.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
forts
BétadinePurdueProducts 19-027132Povidone iodée, 7,5 %
de cire osseuseSpécialités chirurgicales903Cire d’abeille stérile et malléable et palmitate d’isopropyle
Buponorphine SR-LabZooPharmN/AAnalgésique injectable à longue durée d’action 5 mL (0,5 mg/mL) formulation polymétrique
Applicateurs à embout en cotonPuritan25-806 10WCApplicateurs stériles à embout en coton à longue tige
Pommade pour les yeuxPuralube17033-211-38Pommade ophtalmique lubrifiante à base de vaseline et d’huile minérale
Chauffe-mainsHothandsHH2Compresses chauffantes activées par l’air
IbuprofèneUp & Jusqu’au094-01-0245100mg par 5mL en suspension liquide
IsofluraneHenry Schein INC1182097Anesthésique liquide pour utilisation dans un vaporisateur d’anesthésique
Scalpels IntegraMiltex4-410#10 lame de scalpel jetable
GlueVetbond1469SBAdhésif pour plaies sans danger pour
la peau Pansementstérile TIDI Products25-517Champs stériles emballés individuellement
SutureCovidienSP5686G45cm swedged 5-0 monofilament polypropylène Suture
Stereotaxic Unit
High Speed Drill (Foredom)KopfModel 1474Max of 38,000 RPM
Mouse Gas Anesthesia Head HolderKopf Model 923-BBarre buccale avec trou de dents et cône de nez
Barres d’oreille non rompuesKopfModèle 922Barres d’oreille adaptées aux applications de souris
Instrument stéréotaxiqueKopfModèle 940Ensemble plaque de base, cadre et échelle linéaire avec affichage numérique moniteur
Injecteur
Aiguille d’injecteur et seringueHamilton80366Aiguille de calibre 26, longueur d’aiguille de 51 mm et 10 &mu ; Seringue de volume
Legato 130A pousse-seringue automatiséKD ScientificP/N : 788130Base à écran tactile programmable avec injecteur
Anesthesia Machine
SomnoSuite Vaporisateur numérique à faible débitKent ScientificSS-01Appareil d’anesthésie numérique
SomnoSuite Kit de démarrage pour sourisKent ScientificSOMNO-MSEKITComprend une chambre d’induction, 2 seringues d’anesthésie, un tube de 18 po, un cône de nez en plastique, 2 cartouches de gaz d’anesthésie usagées
Skin automatisé

Références

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