Le protocole actuel démontre une méthode simple pour tracer les projections de glutamate de l’aire tegmentale ventrale (VTA) vers l’hippocampe. La photostimulation des neurones du glutamate VTA a été combinée à l’enregistrement CA1 pour démontrer comment les terminaux VTA glutamate modulent la vitesse de tir pyramidale putative CA1 in vivo.
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Article de méthode
Traçage anatomique et fonctionnel in vivo combiné des terminaux de glutamate de la zone tegmentale ventrale dans l’hippocampe
Dans cet article
Résumé
Résumé
La modulation optogénétique des sous-populations de neurones dans le cerveau a permis aux chercheurs de disséquer des circuits neuronaux in vivo et ex vivo. Cela fournit une prémisse pour déterminer le rôle des types de neurones dans un circuit neuronal et leur importance dans le codage de l’information par rapport à l’apprentissage. De même, la méthode peut être utilisée pour tester la signification physiologique de deux ou plusieurs régions cérébrales connectées chez les animaux éveillés et anesthésiés. La présente étude démontre comment les neurones de glutamate VTA modulent la vitesse de déclenchement des neurones pyramidaux putatifs dans le CA1 (hippocampe) des souris anesthésisées. Ce protocole utilise le profilage dépendant du virus adéno-associé (AAV) des neurones du glutamate VTA pour le traçage des terminaux de glutamate présynaptique VTA dans les couches de l’hippocampe. L’expression de l’opsine contrôlée par la lumière (channelrhodopsine; hChR2) et de la protéine de fluorescence (eYFP) hébergée par le vecteur AAV a permis le traçage antérograde des terminaux de glutamate VTA et la photostimulation des corps cellulaires des neurones du glutamate VTA (dans le VTA). Des électrodes de silicium aigu à haute impédance ont été positionnées dans le CA1 pour détecter les réponses multi-unités et uni-unités à la photostimulation VTA in vivo. Les résultats de cette étude démontrent la distribution dépendante de la couche des terminaux de glutamate VTA présynaptiques dans l’hippocampe (CA1, CA3 et DG). En outre, la photostimulation des neurones de glutamate VTA a augmenté le taux de déclenchement et d’éclatement des unités pyramidales CA1 putatives in vivo.
Introduction
Au cours de la dernière décennie, un ensemble d’outils génétiques a été développé pour augmenter la spécificité de la modulation de type neurone et la cartographie des réseaux neuronaux complexes1. Notamment, des virus neurotropes ayant une capacité inhérente à infecter et à se répliquer dans les cellules neuronales ont été déployés pour exprimer ou ablater des protéines spécifiques dans des sous-types de neurones. Lorsqu’ils hébergent des protéines de fluorescence ou des indicateurs d’activité synaptique génétiquement codés, les vecteurs AAV transfectés marquent et délimitent les réseaux neuronaux dans les régions du cerveau2....
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Protocole
Toutes les procédures expérimentales et de manipulation des animaux ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de la Louisiana State University School of Veterinary Medicine.
1. Animal expérimental
- Utilisez des souris âgées de 5 à 6 semaines.
- Hébergez 3 à 5 animaux par cage dans des conditions standard de 12 h alternant cycle clair et sombre. De la nourriture et de l’eau doivent être fournies ad libitum.
2. Craniotomie et préparation animale
REMARQUE: Cette section décrit les procédures pré- et péri-opératoires pour la craniotom....
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Résultats
Traçage antérograde
L’expression de l’AAV a été vérifiée par imagerie par immunofluorescence de la protéine rapporteure (eYFP) dans le VTA de souris C57BL/6 21 jours après l’injection(Figure 2). Le succès du étiquetage antérograde des projections présynaptiques de glutamate VTA dans l’hippocampe a également été vérifié par détection d’eYFP dans les couches de DG, CA3 et CA1 (Figure 6a–d; Film 2 et 3)........
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Discussion
Au cours de la dernière décennie, la conception des constructions AAV a considérablement progressé. En tant que tels, plus de promoteurs spécifiques aux neurones ont été incorporés dans un ensemble de sérotypes AAV pour améliorer la spécificité de transfection14. En combinant des gènes pour les protéines de fluorescence, les transporteurs, les récepteurs et les canaux ioniques, des bibliothèques d’AAV existent maintenant pour l’imagerie, la neuromodulation et la détection de l’activité synaptique........
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail est financé par la subvention de transition de la SCS accordée à OOM. OOM, PAA et AS ont conçu l’étude et effectué les expériences. AS et PAA ont analysé les résultats. OOM et PAA ont préparé le manuscrit. Nous remercions le Dr Karl Disseroth (Université de Stanford) d’avoir mis l’AAV à notre disposition.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 3 % peroxyde d’hydrogène | Fisher chemical | H312 | |
| AAV-CaMKII&alpha ;-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
| BNC câble Amazon | |||
| BNC Splitter | Amazon | ||
| Ceramic Split Mating Sleeve for Ø ; Embouts de 1,25 mm. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
| Foret | Dremel | LR 39098 | |
| Lames revêtues de gélatine | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
| Seringue de Hamilton (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
| Adaptateur de tête | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
| Sonde silicium haute impédance | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
| INTAN 512ch Contrôleur d’enregistrement | INTAN | RHD2000 | |
| Solution d’iode | Dynarex | 1425 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
| Spectre de kétamine | K1068 | ||
| Pilote de LED | Thorlabs | LEDD1B | |
| Source lumineuse (470 nm)-lumière bleue | Thorlabs | M470F3 | |
| Micromanipulateur | Narishige | M0-203 | |
| Fibre optique | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
| Vis cruciforme à tête cylindrique (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
| Préamplificateur tête (32 canaux) | INTAN | C3314 | |
| Cadre stéréotaxique | Kopf | 1530 | |
| TTL émetteur | Prizmatix | 4031 | |
| Uréthane | Sigma | U2500 | |
| Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
| Software | Company | Version | |
| Graphpad Prism | GraphPad Software | version 8 | |
| Intan Recording Controller | Intantech | version 2.07 | |
| Neuroexplorer | Nex Technologies | version 5.215 | |
| Plexon Offline Spike Sorter | Plexon Inc | version 4.5 | |
| ACSF Composition : ACSF fortement > | |||
| oxygéné avec 95 % d’oxygène/5 % de CO2 constamment à bulles à travers l’ACSF (ACSF ; en mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1,25 NaH2PO<>4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 et 25 Glucose). |
Références
- Lo, L., Anderson, D. J. A Cre-dependent, anterograde transsynaptic viral tracer for mapping output pathways of genetically marked neurons. Neuron. 72 (6), 938-950 (2011).
- Li, J., Liu, T., Dong, Y., Kondoh, K., Lu, Z. Trans-synaptic Neura....
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Réimpressions et autorisations
