Mesure continue du bruit biologique chez Escherichia Coli à l’aide d’une microscopie en accéléré

Résumé

Ce travail présente une méthode de microscopie qui permet l’imagerie en direct d’une seule cellule d’Escherichia coli pour l’analyse et la quantification du comportement stochastique des circuits génétiques synthétiques.

Résumé

Le protocole développé ici offre un outil pour permettre le suivi informatique de la division Escherichia coli et des niveaux fluorescents sur plusieurs heures. Le processus commence par le dépistage des colonies qui survivent sur un minimum de médias, en supposant que seul Escherichia coli hébergeant le plasmide correct sera en mesure de prospérer dans les conditions spécifiques. Étant donné que le processus de construction de grands circuits génétiques, nécessitant l’assemblage de nombreuses parties d’ADN, est difficile, les composants du circuit sont souvent répartis entre plusieurs plasmides à différents numéros de copie nécessitant l’utilisation de plusieurs antibiotiques. Les mutations dans le plasmide peuvent détruire la transcription des gènes de résistance aux antibiotiques et interjecter avec la gestion des ressources dans la cellule menant à la nécrose. La colonie sélectionnée est fixée sur une boîte de Pétri à fond de verre et quelques plans de mise au point sont sélectionnés pour le suivi de la microscopie dans les domaines lumineux et fluorescents. Le protocole maintient la mise au point de l’image pendant plus de 12 heures dans des conditions initiales qui ne peuvent pas être réglementées, créant quelques difficultés. Par exemple, les cellules mortes commencent à s’accumuler dans le champ de concentration des lentilles après quelques heures d’imagerie, ce qui provoque l’accumulation de toxines et le signal de flou et de décomposition. L’épuisement des nutriments introduit de nouveaux processus métaboliques et entrave la réponse souhaitée du circuit. La température de l’expérience abaisse l’effectivité des inducteurs et des antibiotiques, ce qui peut endommager davantage la fiabilité du signal. Le gel média minimal rétrécit et sèche, et par conséquent la mise au point optique change au fil du temps. Nous avons développé cette méthode pour surmonter ces défis dans Escherichia coli, similaire aux travaux précédents développant des méthodes analogues pour d’autres micro-organismes. En outre, cette méthode offre un algorithme pour quantifier le bruit stochastique total dans les cellules inchangées et altérées, constatant que les résultats sont compatibles avec les prédictions de l’analyseur de flux comme le montre un coefficient de variation similaire (CV).

Introduction

La biologie synthétique est un domaine multidisciplinaire qui a émergé au cours de la dernière décennie et vise à traduire les principes de conception d’ingénierie en conception biologique rationnelle^1,2,3, dans un effort pour atteindre l’intégration multi-signaux et le traitement dans les cellules vivantes pour comprendre la science fondamentale^4,5, diagnostic, thérapeutique et biotechnologique applications^6,7,8,<....

Protocole

1. Préparation des médias et de la culture

1. Préparer une solution de stock de 1 000 x carbenicilline (50 mg/mL) ou antibiotique pertinent.
   1. . Peser 0,5 g de carbenicilline. Ajouter 10 mL de H₂O stérile. Dissoudre complètement.
   2. Stériliser le stock de carbenicilline à l’intermédiaire d’un filtre à seringues de 0,22 μm. Aliquot la solution antibiotique et stocker à -20 °C.
2. Pour préparer des assiettes de bouillon de lysogène (LB), mélanger 5 g de tryptone, 5 g de NaCl, 2,5 g d’extrait de levure et 7,5 g d’agar Bacto avec 0,5 L de H₂O. Autoclave stérile la solution à 121 °C pendant 20 ....

Résultats

Le logiciel analyse les images de domaine de champ lumineux qui sont hors-blanc et noir. L’Escherichia coli ressemblera à des formes oblongues noires sur un fond blanc éteint et une plage dynamique de luminance devrait montrer une pointe en son centre (Figure 1). Dans les images fluorescentes, les cellules peuvent avoir un petit halo, mais les cellules individuelles aux formes oblongues peuvent encore être résolues. Un événement de mitose doit d’abord être détecté après 30 minutes. .......

Discussion

Dans le cadre de ces travaux, nous avons mis au point un protocole qui permet de retracer par ordinateur les cellules vivantes d’Escherichia coli, en suivant les niveaux de division et de fluo sur une période de plusieurs heures. Ce protocole nous permet de quantifier la dynamique stochastique des circuits génétiques d’Escherichia coli en mesurant le CV et le SNR en temps réel. Dans ce protocole, nous avons comparé les comportements stochastiques de deux circuits différents comme le montre la fi.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plat en verre de 35 mm	mat	P35G-0.170-14-C	d’épaisseur correspondant à la lentille du microscope.
Agarose  ;	Lonza	5004	LB préparation
AHL  ;	Inducteur Sigma-Aldrich	K3007
Bacto tryptone  ;	BD - Becton, Dickinson et Cie  ;	211705	préparation LB
Carb	Invitrogen	10177-012	antibiotique
Carb	Formedium	CAR0025	antibiotique
Acides aminés  ;	BD - Becton, Dickinson et Cie  ;	223050	solution média minimale
éclipse Ti	nikon		microscope inversé
Glucose	Sigma-Aldrich	G5767	solution média minimale
Glyserol	Bio-Lab	000712050100	substrat média minimal
Immersol 518F	zeiss	4449600000000	huile d’immersion
M9 solution saline  ;	Sigma-Aldrich	M6030	minimal media solution
NaCl	Bio-Lab	214010	LB préparation Agar
noble	Sigma-Aldrich	A5431	support minimal substrate
parafilm	tape Bemis	PM-996	référencé en tant que ruban dans le texte
Seaplaque gtg Agarose	Lonza	50111	support minimal
substrate thaymine B1	Sigma-Aldrich	T0376  ;	solution multimédia minimale
Extrait de levure	BD - Becton, Dickinson and Company  ;	212750	Préparation LB