Modélisation des tumeurs osseuses primaires et des métastases osseuses avec implantation d’une greffe de tumeur solide dans l’os

Résumé

Les modèles de métastases osseuses ne développent pas de métastases uniformément ou avec une incidence de 100%. L’injection directe de cellules tumorales intra-osseuses peut entraîner une embolisation du poumon. Nous présentons notre technique de modélisation des tumeurs osseuses primaires et des métastases osseuses en utilisant l’implantation d’une greffe de tumeur solide dans l’os, conduisant à une greffe et une croissance reproductibles.

Résumé

Les tumeurs osseuses primaires ou les métastases osseuses des tumeurs solides entraînent des lésions ostéolytiques, ostéoblastiques ou mixtes ostéolytiques / ostéoblastiques douloureuses. Ces lésions compromettent la structure osseuse, augmentent le risque de fracture pathologique et laissent aux patients des options de traitement limitées. Les tumeurs osseuses primaires métastasent à des organes distants, certains types pouvant se propager à d’autres sites squelettiques. Cependant, des preuves récentes suggèrent qu’avec de nombreuses tumeurs solides, les cellules cancéreuses qui se sont propagées aux os peuvent être la principale source de cellules qui finissent par métastaser à d’autres systèmes organiques. La plupart des modèles murins syngéniques ou xénogreffés de tumeurs osseuses primaires impliquent une injection intra-osseuse (orthotopique) de suspensions de cellules tumorales. Certains modèles animaux de métastases squelettiques à partir de tumeurs solides dépendent également de l’injection osseuse directe, tandis que d’autres tentent de récapituler des étapes supplémentaires de la cascade métastatique osseuse en injectant des cellules par voie intravasculaire ou dans l’organe de la tumeur primaire. Cependant, aucun de ces modèles ne développe de métastases osseuses de manière fiable ou avec une incidence de 100%. En outre, il a été démontré que l’injection intra-osseuse directe de cellules tumorales est associée à une embolisation tumorale potentielle du poumon. Ces cellules tumorales emboliques se greffent mais ne récapitulent pas la cascade métastatique. Nous avons rapporté un modèle murin d’ostéosarcome dans lequel des fragments tumoraux frais ou cryoconservés (constitués de cellules tumorales et de stroma) sont implantés directement dans le tibia proximal à l’aide d’une technique chirurgicale mini-invasive. Ces animaux ont développé une greffe reproductible, une croissance et, au fil du temps, une ostéolyse et des métastases pulmonaires. Cette technique a la polyvalence d’être utilisée pour modéliser les métastases osseuses tumorales solides et peut facilement utiliser des greffes constituées d’un ou de plusieurs types de cellules, de cellules génétiquement modifiées, de xénogreffes dérivées de patients et / ou de cellules marquées qui peuvent être suivies par imagerie optique ou avancée. Ici, nous démontrons cette technique, en modélisant les tumeurs osseuses primaires et les métastases osseuses en utilisant l’implantation de greffe de tumeur solide dans l’os.

Introduction

Les modèles murins de maladies humaines et animales sont de plus en plus populaires dans la recherche biomédicale. L’utilité de l’utilisation de souris dans ce contexte est que leur anatomie et leur physiologie sont très similaires à celles des humains. Ils ont une période de gestation relativement courte et une période de vie postnatale pour atteindre la maturité, et sont largement associés à un coût relativement faible et à une facilité de logement, bien que l’augmentation des coûts de développement ou d’achat soit associée à des degrés plus élevés de modification génétique, d’immunodéficience et / ou d’humanisation¹. L’utilisation de souches....

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Cambridge, Cambridge, Royaume-Uni.

1. Préparation des lignées cellulaires

1. Cultiver des lignées cellulaires conformément aux protocoles de culture cellulaire standard du laboratoire pour la culture cellulaire traditionnelle ou l’injection chez la souris. Les protocoles standard utilisés ici sont la croissance dans le milieu Eagle’s modifié de Dulbecco contenant 10% de sérum bovin fœtal (FBS), de L-glutamine et de pénicilline / streptomycine (ci-après connu sous le nom de milieu de c....

Résultats

Un résultat positif serait associé à la greffe de tumeur et à la croissance tumorale progressive au fil du temps. Selon le type de tumeur, la croissance tumorale intraosseuse peut être associée à une boiterie progressive des membres postérieurs, mais de nombreuses tumeurs ne provoquent pas de boiterie malgré les signes de maladie osseuse associée. La réussite de la greffe a été documentée par imagerie avancée, où il y aurait des changements progressifs de la radiographie, de la μCT ou de l’IRM dans le tibia proximal asso.......

Discussion

Ce rapport documente notre modèle pour créer des tumeurs osseuses primaires ou des métastases osseuses suite à l’implantation intratibiale d’une allogreffe tumorale. Nous pensons qu’il y a plusieurs étapes critiques dans ce processus. Un plan anesthésique sûr doit être établi à la fois pour l’injection sous-cutanée de la suspension de cellules tumorales et le placement intratibial des fragments tumoraux résultants. Il doit y avoir une préparation stérile du site chirurgical pour le retrait de l’allogreffe sous-cutanée et.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lame de scalpel #15	Henry Schein Ltd.	75614	Aucun Plaques
de culture tissulaire à 6 puits	Thermo Fisher Scientific	10578911	Utilisées pour hacher des morceaux de tumeur. Peut également être utilisé pour la culture cellulaire
Lignée cellulaire d’ostéosarcome d’Abrams	Sans objet	Sans objet	Aucun
Appareil d’anesthésie avec vaporisateur d’isoflurane et bouteille(s) d’oxygèneVetEquip		901805	Aucun
Balance pour animaux	Kent Scientific	SCL- 1015	Aucun
BALB/c souris nue (nu/nu)	Charles River Ltd.	NA	6-8 semaines. Souris mâles ou femelles
Ciment osseux	Depuy Synthes	160504	Utilisation facultative à la place de la cire osseuse
Cire osseuse	Ethicon	W31G
Buprénorphine	Animalcare Ltd.	N/A	Buprecare 0,3 mg/ml Solution injectable pour chiens et chats
Station d’euthanasie au dioxyde de carbone	N/A	/A	Doit être fournie dans l’animalerie
Incubateur de culture cellulaire réglé à 37 ° ; C et 5 % de dioxyde de carbone	Heraeus	Divers	Aucun
Gommage chirurgical à la chlorhexidine	Vetoquinol	411412	Aucun
Cryoflacons (2 ml)	Thermo Scientific Nalgene	5000-0020	Facultatif si cryoconservation des fragments tumoraux
D-luciferin (Firefly), sel de potassium	Perkin Elmer	122799	Facultatif si la lignée cellulaire d’intérêt possède un gène rapporteur bioluminescent
Pied à coulisse numérique	Mitutoyo	500-181-30	Peut être manuel
Armoire de microradiographie numérique	Faxitron Bioptics, LLC	MX-20	Facultatif pour évaluer la réponse osseuse à la croissance tumorale
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	Sigma Aldrich	1371171000	Facultatif si cryoconservation des fragments tumoraux
Dulbecco' Eagle modifié' s medium	Thermo Fisher Scientific	11965092	Aucun
Éthanol (70 %)	Sigma Aldrich	2483	Aucun
Sérum fœtal bovin	Thermo Fisher Scientific	26140079	Aucun
Forceps, Dumont	Fine Science Tools, Inc.	11200-33	Aucun
Congélateur (&ndash ; 80 ° ; C)	Sanyo	MDF-794C	Facultatif si cryoconservation ou congélation instantanée des fragments de tumeur
Hémocytomètre	Thermo Fisher Scientific	11704939	Peut également utiliser un compteur de cellules automatisé, si disponible
Aiguilles hypodermiques (calibre 27)	Henry Schein Ltd.	DIS55510	Peut également utiliser des aiguilles 25G (DIS55509) et 30G (catalogue DIS599)
Glace	N/A	N/A	Idéalement de petits morceaux dans un récipient pour le stockage de seringues et de suspensions de cellules
Ciseaux Iris	Fine Science Tools, Inc.	14084-08	Aucun
Isoflurane	Henry Schein Ltd.	1182098	Aucun
Système d’imagerie de bioluminescence/fluorescence IVIS Lumina III	Perkin Elmer	CLS136334	Facultatif si la lignée cellulaire d’intérêt possède des gènes rapporteurs bioluminescents ou fluorescents
L-glutamine	Thermofisher scientifc	25030081	Aucun
Azote liquide	British Oxygen Corporation	NA	Facultatif si cryoconservation ou congélation instantanée de fragments de tumeur
Dewar à l’azote liquide, 5 litres	Thermo Fisher Scientific	TY509X1	Facultatif si cryoconservation des fragments tumoraux
Matrigel® ; Matrix GFR, sans LDEV, 5 ml	Corning Life Sciences	356230	en option. Également disponible en format 10 ml (354230)
Microcentrifugeuse	Thermo Fisher Scientific	75002549	Cellules à granulés à 1200 tr/min pendant 5-6 minutes
Conteneur de congélation Mr. Frosty	Fisher Scientific	10110051	Facultatif si la cryoconservation des fragments de tumeur
NAIR Lotion/huile décapante	Thermo Fisher Scientific	NC0132811	Peut également utiliser une tondeuse électrique à lame fine
Pénicilline/streptomycine	Sigma-Aldrich	P4333	Aucun
Manche de scalpel, #7 Short	Fine Science Tools, Inc.	10007-12	Préférence de l’utilisateur tant qu’il accepte la lame de scalpel #15
Coussin chauffant pour petits animaux	VetTech	HE006	Aucun
Stéréomicroscope	GT Vision Ltd.	H600BV1	Aucun
Solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010023	Utilisation pour les injections et également dans le cadre du gommage chirurgical, en alternance avec la chlorhexidine
Adhésif tissulaire (stérile)	3M Corporation	84-1469SB	Peut également utiliser une suture cutanée non résorbable (taille 6-0)
Bleu trypan	Thermo Fisher Scientific	5250061	Aucun
Trypsine-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25300054	Utilisation 0,05 %-0,25 %
Seringue à tuberculine (1 ml avec des gradations de 0,1 ml)	Becton Dickinson	309659	Pointe coulissante préférée aux
flacons de culture tissulaire Luer Vented, T-75	Corning Life Sciences	CLS3290	Peut également utiliser des flacons plus petits ou plus grands, selon les besoins

facultative N