Quantification de l’apport en macronutriments dans un écran neuronal thermogénétique à l’aide de larves de drosophiles

Résumé

Décrit ici est un protocole qui permet la quantification colorimétrique de la quantité de nourriture consommée dans un intervalle de temps défini par les larves de Drosophila melanogaster exposées à des régimes de qualité macronutriment différente. Ces tests sont menés dans le cadre d’un criblage thermogénétique neuronal.

Résumé

Les comportements de recherche de nourriture et d’alimentation permettent aux animaux d’accéder à des sources d’énergie et de nutriments essentiels à leur développement, à leur santé et à leur forme physique. L’étude de la régulation neuronale de ces comportements est essentielle pour la compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires sous-jacents à l’homéostasie nutritionnelle. L’utilisation de modèles animaux génétiquement tractables tels que les vers, les mouches et les poissons facilite grandement ces types d’études. Au cours de la dernière décennie, la mouche des fruits Drosophila melanogaster a été utilisée comme un modèle animal puissant par les neurobiologistes qui étudient le contrôle neuronal des comportements d’alimentation et de recherche de nourriture. Bien que sans aucun doute précieux, la plupart des études examinent les mouches adultes. Ici, nous décrivons un protocole qui tire parti du système nerveux larvaire plus simple pour étudier les substrats neuronaux contrôlant des comportements d’alimentation lorsque les larves sont exposées à des régimes différents dans leur teneur en protéines et en glucides. Nos méthodes sont basées sur un test quantitatif colorimétrique d’alimentation sans choix, réalisé dans le cadre d’un écran d’activation thermogénétique neuronale. Comme lecture, la quantité de nourriture consommée par les larves sur un intervalle de 1 h a été employée une fois exposée à l’un des trois régimes colorant-marqués qui diffèrent dans leurs rapports protéines aux hydrates de carbone (P:C). L’efficacité de ce protocole est démontrée dans le cadre d’un criblage neurogénétique chez la drosophilelarvaire, en identifiant des populations neuronales candidates régulant la quantité de nourriture consommée dans des régimes de différentes qualité macronutriments. Nous avons également pu classer et regrouper les génotypes testés en classes phénotypiques. Sans compter qu’un bref examen des méthodes actuellement disponibles dans la littérature, les avantages et les limites de ces méthodes sont discutés et, également, quelques suggestions sont fournies au sujet de la façon dont ce protocole pourrait être adapté à d’autres expériences spécifiques.

Introduction

Tous les animaux dépendent d’une alimentation équilibrée pour acquérir les quantités nécessaires à la survie, à la croissance et à la reproduction¹. Le choix de ce que et combien manger est influencé par une multitude de facteurs d’interaction liés à l’état interne de l’animal, comme le niveau de satiété, et les conditions environnementales, telles que la qualité de la nourriture^2,3,4,5. Les protéines et les glucides sont deux macronutriments majeurs et leur apport équilibré est essentiel pour soutenir les processus physiologiques des animaux. Par conséquent, la compréhension des mécanismes neuronaux contrôlant les comportements d’alimentation et soutenant un apport équilibré de ces macronutriments est extrêmement pertinente. C’est parce que les traits du cycle biologique comme la durée de vie, la fécondité et la santé métabolique sont directement affectés par les niveaux d’apport en protéines^6,7,8,9,10.

L’utilisation d’organismes plus simples et plus maniables qui présentent des habitudes alimentaires conservées au cours de l’évolution avec des animaux complexes, y compris des mammifères, est essentielle à ce type d’études. Il est important de faire en 1999, ces modèles animaux plus simples offrent une bonne occasion de disséquer des questions biologiques complexes dans un contexte coûteux, éthiquement et techniquement plus efficace. Au cours des dernières décennies, la drosophile,avec sa puissante boîte à outils génétique, son comportement complexe et stéréotypé et son architecture conservée de mécanismes périphériques et de détection des nutriments avec les mammifères, a été un modèle fructueux pour les neurobiologistes comportementaux¹¹. En fin de compte, l’espoir est qu’en comprenant comment l’apport alimentaire est régulé chez cet animal, avec un système nerveux plus simple, nous pouvons alors commencer à démêler les dysfonctionnements neuronaux sous-jacents aux troubles de l’alimentation humaine.

L’étude des substrats neuronaux pour les comportements alimentaires dépend profondément de la capacité de mesurer simultanément l’apport alimentaire des animaux tout en manipulant leur activité neuronale. En raison des quantités minimales d’aliments ingérés, il est extrêmement difficile de quantifier la quantité d’aliments consommés par les mouches, et toutes les méthodes actuellement disponibles présentent des limites importantes. Ainsi, l’étalon-or est d’utiliser une combinaison de méthodologies complémentaires¹². Les mouches adultes ont été historiquement favorisées comme modèle génétique et comportemental. Néanmoins, les larves de drosophiles offrent également des possibilités d’étudier les substrats neuronaux codant pour le comportement alimentaire. Le système nerveux central (SNC) larvaire, avec environ 12 000 neurones, est nettement moins complexe que celui de l’adulte, qui contient environ 150 000 neurones. Cette complexité inférieure n’est pas seulement numérique mais aussi fonctionnelle, car les comportements larvaires reposent sur des fonctions de locomotive et des systèmes sensoriels plus simples. Malgré l’apparente simplicité de leur système nerveux, les larves présentent encore des comportements alimentaires complets, et certaines méthodes pour quantifier l’ingestion de nourriture chez les larves de drosophiles ont été décrites^5,13,14,15. En s’associant à des manipulations de l’activité neuronale, les larves de drosophiles peuvent constituer un modèle hautement tractable pour comprendre la régulation neuronale de l’apport alimentaire.

Voici un protocole détaillé pour quantifier l’apport alimentaire chez les larves exposées à des régimes alimentaires de différentes qualité de macronutriments. Les régimes, appelés régimes d’équilibrage des macronutriments, différaient par les teneurs en protéines et en glucides, en particulier en ce qui concerne les rapports protéines/glucides (P:C) : 1:1 (régime riche en protéines), 1:4 (régime intermédiaire) et 1:16 (régime pauvre en protéines), comme le montre la figure 1A. Brièvement, une analyse quantitative d’alimentation sans choix a été établie utilisant ces trois régimes basés sur la saccharose-levure isocalorique (SY) teints avec un colorant alimentaire bleu. Étant donné que l’extrait de levure et le saccharose ont été utilisés comme sources de protéines et de glucides, et que les deux contiennent des glucides, la variation des rapports P:C a été obtenue en modifiant l’équilibre de ces deux composants, comme décrit précédemment¹⁶ et comme indiqué à la figure 1B. Un aperçu schématique du protocole, montrant les principales étapes expérimentales, est disponible à la figure 2.

Ce protocole a été établi dans le but d’étudier le rôle des populations neuronales spécifiques sur le règlement des niveaux d’alimentation larvaires dans les régimes de différents rapports de P: C et dans le cadre d’un écran neuronal thermogénétique. Un outil neurogénétique bien caractérisé a été utilisé à partir de la famille du potentiel de récepteur transitoire (TRP): canal de potentiel de récepteur transitoire de la drosophile (dTRPA1), qui est un canal cationique à température et tension fermée, permettant la mise à feu des potentiels d’action lorsque les températures ambiantes s’élèvent au-dessus de 25 ° C¹⁷. Pour exprimer le transgène dTRPA1, nous avons profité des lignéesGal4 basées sur les régions cis-régulatrices du génome de la drosophile, établies dans le laboratoire Rubin, dans le cadre du projet FlyLight au Janelia Research Campus^18,19.

Bien que le protocole, décrit ici, ait été établi dans le cadre d’un écran d’activation, il peut être facilement adapté par l’expérimentateur à d’autres besoins ou intérêts spécifiques, à savoir effectuer un écran de suppression à l’aide du silencieux neuronal sensible à la température ShibireTS^20,en alternative au dTRPA1. Cette adaptation et d’autres sont abordées dans les sections protocole et discussion.

Protocole

1. Préparation des régimes de levure de saccharose (SY)

1. Peser tous les ingrédients secs (gélose, levure, saccharose) pour l’équilibrage des macronutriments et les régimes d’élevage L3. Les quantités en grammes pour chacun des ingrédients nécessaires à la préparation de 1 L d’aliment sont indiquées à la figure 1B.
   REMARQUE : Tiendront compte du fait qu’environ 13 mL de nourriture sont nécessaires pour remplir une boîte de Pétri de 60 mm.
2. Dissoudre tous les ingrédients dans de l’eau distillée stérile (utiliser environ 50% du volume total d’eau nécessaire pour préparer l’aliment) et remuer le milieu pendant 5-10 min.
3. Autoclave pendant 50 min.
4. Après avoir permis aux milieux de refroidir, ajoutez des solutions de nipagine et d’acide propionique à l’alimentation, à une concentration finale (v/v) de 3 % et 0,3 %, respectivement. Aux régimes d’équilibrage des macronutriments, ajouter le colorant alimentaire bleu à une concentration finale (v/v) de 1 %. Complétez les volumes totaux avec de l’eau distillée.
5. Versez soigneusement les régimes alimentaires dans des boîtes de Pétri de 60 mm, de sorte que la quantité de nourriture versée soit approximativement la même dans chacune des assiettes. Étiquetez les plaques avec les rapports P: C des régimes.
   REMARQUE : Préparez les régimes d’équilibrage des macronutriments le jour de l’analyse d’alimentation. Si ce n’est pas possible, conservez les régimes préparés à 4 °C, dans un récipient scellé, pendant une durée maximale de 3 jours. Des périodes de stockage plus longues rendent le régime trop sec et trop dur, et les larves ne peuvent pas s’enfouir dans le milieu.

2. Croisement génétique des lignées parentales

REMARQUE : Utilisez le système Gal4/UAS²¹ pour configurer les croisements génétiques. Dans ce protocole, afin d’activer la fonction neuronale dans des populations neuronales spécifiques, des vierges femelles de la lignée UAS dTRPA1¹⁷ ont été utilisées et croisées aux mâles à partir des lignées Janelia Gal4(figure 2A). Le contrôle génétique utilisé était la descendance d’un croisement entre la lignée dTRPA1 et une lignée « GAL4 vide », qui porte Gal4 dans le vecteur utilisé pour générer la collection Rubin Gal4 mais sans fragment régulateur présent (attP2)^22. Pour favoriser la suppression neuronale, une ligne UAS codant pour ShibireTS²⁰ peut être utilisée, au lieu de dTRPA1.

1. Installer des cages de collecte d’embryons de 60 mm avec des plaques de régime d’élevage L3, complétées par de la pâte de levure active.
2. Transférer les femelles vierges uas dTRPA1 adultes et les mâles Janelia Gal4, âgés de 5 à 8 jours, dans les cages de collecte d’embryons et permettre à l’accouplement de se produire pendant 24 à 48 h, à 25 °C, avec une humidité de 60 % et un cycle lumière-obscurité de 12 h 12(figure 2A). Pour les cages de collecte d’embryons de 60 mm, utilisez environ 100 femelles vierges et 30 mâles par croisement.
3. À la fin de la période d’accouplement, retirez et jetez les plaques de régime d’élevage L3 utilisées dans les croisements génétiques. Remplacez-les par des assiettes fraîches d’élevage L3, afin d’effectuer les pontes et la stadification des larves.

3. Préparation des larves du troisième stade (L3)

1. Transférer les mouches adultes accouplées dans des assiettes fraîches d’élevage L3 et laisser la ponte se produire pendant 3 à 4 h, à 25 °C(figure 2B). Assurez-vous que toutes les plaques sont étiquetées avec le génotype, le rapport P: C du régime alimentaire et la date de ponte de l’œuf.
   REMARQUE: Pour gagner du temps, effectuez la ponte directement dans le régime d’élevage L3, ce qui évite une manipulation supplémentaire des œufs. Dans le cas de criblages génétiques à petite échelle, l’optimisation de la ponte peut être obtenue en utilisant des assiettes de gélose au jus de pomme.
2. À la fin de la période de ponte, retirez les plaques des cages et couvrez-les de couvercles en plastique. Dans le cas où l’extrait de levure est utilisé pour compléter les plaques d’élevage L3, assurez-vous d’éliminer toute la levure résiduelle à la fin de la ponte. Ceci est important pour éviter une alimentation non uniforme pendant la croissance larvaire.
   REMARQUE: Les adultes accouplés peuvent être transférés dans des assiettes fraîches de régime d’élevage L3, de sorte que plus de pontes d’œufs sont effectuées et que des larves plus expérimentales peuvent être obtenues. Des pontes consécutives peuvent être effectuées avec les mêmes adultes pendant toute une semaine de travail.
3. Estimer le nombre d’œufs par plaque et maintenir la densité larvaire à un maximum de 200 embryons par plaque. Cette estimation peut être faite en comptant le nombre d’embryons dans un quart de la plaque.
   REMARQUE : Une plaque surpeuplée retardera le développement larvaire et affectera les comportements alimentaires larvaires.
4. Incuber les plaques d’élevage L3 à 18 °C (température permissive), 60 % d’humidité et un cycle lumière-obscurité de 12:12, et permettre aux larves de croître pendant 9 jours(figure 2B).
5. Le neuvième jour après la ponte (AEL), prélever trois groupes de 10 L3 dans chacun des génotypes (et pour les répétitions) à tester. De plus, prélever des groupes de 10 L3 pour le contrôle des « aliments sans colorant ». S’assurer que la collecte des larves est effectuée pendant les périodes équivalentes de la journée utilisée pour faire la ponte (p. ex., si la ponte a eu lieu entre 10 h et 14 h, recueillir les larves pendant la même période de temps de 9 jours AEL) et qu’elle est effectuée, aussi doucement que possible, à l’aide d’une pince #5 ou d’une pince de poids plume. Transférer directement les larves comme indiqué à l’étape suivante (3.6).
   NOTA : Les animaux témoins « aliments sans colorant » sont des larves qui, dans le test d’alimentation, reçoivent de la nourriture sans colorant bleu. Ce contrôle est impératif pour éliminer l’absorbance de fond des extraits larvaires.
6. Transférer les larves expérimentales recueillies dans des bateaux de poids de plat en plastique contenant 1 mL d’eau. Assurez-vous que les L3 sont collectés, et non L2, en suivant les instructions données à la figure 3.
   REMARQUE: La collecte de L3 sur des bateaux en plastique contenant de l’eau ou 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) est importante pour garder les larves bien hydratées avant le début de l’analyse d’alimentation. Ceci est particulièrement important si plusieurs groupes L3 expérimentaux de différents génotypes sont collectés en même temps. Gardez une trace de l’ordre de collecte pour chaque groupe, afin de minimiser les différences dans la durée de la privation de nourriture pour chaque groupe. L’utilisation de bateaux en plastique dans cette étape facilite l’étape facultative 4.3 car elle permet aux larves de flotter directement dans le bain-marie.

4. Activation thermogénétique et test d’alimentation sans choix

REMARQUE: Il est recommandé d’effectuer les tests d’alimentation à peu près à la même heure de la journée afin de minimiser les variations possibles liées aux rythmes circadiens. Aussi, toujours exécuter les expériences de contrôle (la progéniture de la ligne « Gal4 vide » croisée à UAS dTRPA1 et les larves « aliments sans colorant »), en parallèle avec les génotypes d’intérêt.

1. Mettre en place un incubateur à 30 °C (température non permissive) et maintenir des niveaux élevés d’humidité (au moins 65%) pour éviter la déshydratation larvaire pendant l’essai.
2. Avant de commencer l’essai d’alimentation, équilibrer la température des plaques d’essai en les réchauffant à 30 °C pendant 30 min.
3. (Facultatif) Choc thermique des larves expérimentales pendant 2 min dans un bain-marie à 37°C. Effectuez cette étape avec les animaux dans les bateaux de poids en plastique contenant de l’eau.
   REMARQUE: Le but de cette étape est d’intensifier l’activation neuronale en favorisant la mise à feu des neurones depuis le début du test d’alimentation.
4. Gardez plusieurs minuteries réglées pour 1 h prêtes. Le nombre de minuteries à utiliser dépend du nombre de groupes expérimentaux testés et du niveau de compétence de l’expérimentateur dans la manipulation des larves.
   REMARQUE : L’utilisation de plusieurs minuteries est essentielle pour maintenir la durée de l’essai cohérente pour tous les génotypes.
5. Égouttez soigneusement l’eau des bateaux en plastique et, à l’aide d’une brosse douce humidifiée, transférez doucement les groupes L3 des bateaux au centre des plaques d’analyse. Remettez les couvercles des plaques et démarrez une minuterie pour chaque plaque (ou groupe de plaques) afin de maintenir des séances d’alimentation précises de 1 h.
6. Laisser les larves se nourrir pendant 1 h, à 30 °C, dans l’obscurité(figure 2C).
   REMARQUE: La performance de l’essai dans l’obscurité est importante pour contrôler les différences dans les indices visuels entre les régimes, car les régimes diffèrent dans les tons, même s’ils contiennent la même concentration de colorant.
7. Arrêtez le test d’alimentation en transférant les plaques dans un bain de glace. Appuyez sur la glace autant que possible pour fournir une surface stable pour les plaques.
   REMARQUE: Les températures froides favoriseront la fin de l’alimentation en inhibant les comportements d’enfouissement et de creusement. La plupart des larves feront surface dans les assiettes après quelques minutes, facilitant leur récupération dans les étapes suivantes.

5. Extraction de colorants alimentaires

1. Préparer des microtubes de 2 mL pour chaque groupe de 10 L3 testés, contenant approximativement les mêmes quantités de billes de verre de 0,5 mm (assez pour remplir la partie inférieure du microtube) et 300 μL de méthanol glacé. Gardez les microtubes dans le froid, à l’aide d’un refroidisseur de banc.
   ATTENTION : Le méthanol est très inflammable et toxique. Suivez toutes les procédures de sécurité recommandées pour la manipulation de ce réactif, y compris le travail dans un endroit bien ventilé et le port de gants en nitrile.
   REMARQUE: L’utilisation de méthanol est importante pour fixer les échantillons larvaires et éviter les réactions de mélanisation dans la cuticule.
2. À l’aide de pinces #5 ou de poids plume, récupérez soigneusement les groupes de 10 L3 des plaques d’essai d’alimentation et transférez-les sur les couvercles des plaques d’essai contenant de l’eau. Rincez les larves pour enlever les débris alimentaires sur leur corps tout en manipulant doucement les larves pour éviter toute blessure. Tenir un registre du nombre de larves récupérées pour chaque génotype par répétition, afin que la quantité moyenne d’apport alimentaire par larve puisse être quantifiée.
   REMARQUE: Les larves blessées doivent être jetées car elles auront une cuticule mélanisée, ce qui ne convient pas à la quantification colorimétrique.
3. Transférer les groupes L3 sur les microtubes de 2 mL préparés au 5.1.
4. Lyser les tissus larvaires pour extraire le colorant alimentaire des intestins par une méthode de lyse mécanique à l’aide d’un lyseur tissulaire et de billes de verre ajoutées à l’étape 5.1. (si un lyzer tissulaire n’est pas disponible, utilisez un pilon homogénéisant). De préférence, effectuez cette étape à 4 °C(Figure 2D).
   REMARQUE: La durée de cette étape dépendra de l’équipement utilisé. À l’aide d’un lyseur tissulaire conventionnel, une extraction de 1 min suffit. En cas de constrictions temporelles, le protocole peut être suspendu à la fin de cette étape et poursuivi ultérieurement. Conserver les échantillons à -20 °C.
5. Transférer les extraits pour nettoyer les microtubes de 1,5 mL, en inversant directement les microtubes de 2 mL sur les nouveaux microtubes de 1,5 mL. Si elles sont effectuées doucement, la plupart des billes de verre resteront au fond du microtube de 2 mL.
6. Dégager les débris cellulaires en centrifugant les extraits, à une vitesse maximale de 10 min, à 4 °C.
7. Recueillir les surnageants pour nettoyer les microtubes de 1,5 mL. Si des débris cellulaires sont encore visibles dans les surnageants, répétez les étapes 5.6 et 5.7.

6. Quantification colorimétrique de la consommation alimentaire

1. Préparer des solutions étalons, pour générer une courbe d’étalonnage, en effectuant des dilutions en série 1:2 dans le méthanol d’une solution de colorant bleu de départ. Comme blanc, utilisez uniquement du méthanol. La concentration des normes dépend des niveaux d’apport alimentaire des animaux.
   NOTA : Dans le cas de l’écran pilote présenté ici, comme les concentrations de colorant obtenues pour les extraits larvaires variaient de 0,02 à 1,93 μL/mL, on a utilisé une courbe standard obtenue en mesurant les absorbances de 8 dilutions en série d’une solution de colorant bleu de 2 μL/mL dans du méthanol. Si nécessaire, augmenter ou diminuer la concentration de ces solutions, selon la concentration de colorant des échantillons expérimentaux.
2. Transférer 100 μL des échantillons expérimentaux (obtenus à l’étape 5.7), étalons et blancs (étape 6.1) dans les puits d’une microplaque de 96 puits et mesurer l’absorbance à 600 nm, à l’aide d’un lecteur de plaque(figure 2E). Pour éliminer l’absorbance de fond, mesurer l’absorbance des extraits obtenus à partir de larves nourries avec des aliments sans colorant bleu comme un « zéro » pour les extraits larvaires (« contrôle alimentaire zéro colorant »).
3. Générer une courbe standard et corréler les valeurs d’absorbance obtenues pour les échantillons de chaque groupe larvaire expérimental avec la quantité d’apport alimentaire (volume en mL). Trouver la consommation alimentaire moyenne par larve en tenant compte du nombre de larves recueillies pour chaque groupe à l’étape 5.2

Résultats

Les larves de drosophile régulent leur apport en protéines au prix de l’ingestion de glucides en excès²³ (diagramme schématique de la figure 2E). En fait, cette priorisation de l’apport en protéines a été observée chez de nombreux autres animaux et s’appelle la protéine tirant parti^{de 24,25}.

Tirant parti de cette réponse comportementale d’alimentation robuste, un écran basé...

Discussion

Avec ce protocole, on pourrait tester la capacité des larves sous activation thermogénétique de populations neuronales spécifiques à réguler les niveaux d’apport en protéines et en glucides, deux macronutriments majeurs, lorsqu’elles sont exposées à des régimes de composition P:C différente. Cette méthode a été testée dans le cadre d’un dépistage préliminaire des larves visant à identifier les populations neuronales associées au contrôle de l’apport alimentaire dans des régimes de qualité macronutriment différente. Ces t...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microtubes de 1,5 mL	Sarstedt AG & Co.	72.690.001
10xPBS	Nytech	MB18201
2,0 mL microtubes	Sarstedt AG & Co.	72.695.500
Boîtes de Pétri de 60 mm	Greiner Bio-one, Autriche	628161
Microplaques à 96 puits	Santa Cruz Biotechnology	SC-204453
Agar	Pró ;-vida, Portugal
Glacière de paillasse	Nalgene, USA	Refroidisseur Labtop 5115-0032
Colorant alimentaire bleu	Rayner, Billingshurst, Royaume-Uni
Milieux de rupture cellulaire	Scientific Industries, Inc.	888-850-6208	(perles de verre de 0,5 mm)
Bateaux de poids de parabole	Santa Cruz Biotechnology	SC-201606
Cage de collecte d’embryons pour boîtes de Pétri de 60 mm	Flystuff, Scientific Laboratory Supplies, UK	FLY1212 (59-100)
Pince plume	BioQuip Products, USA	4750
Nourriture pour mouches pour la maintenance des			stocks1 L d’aliment contient : 10 g d’agar, 100 g d’extrait de levure, 50 g de saccharose, 30 mL de nipaguin, 3 mL d’acide propionique
Pince #5	Dumont	0108-5-PS	Pointes standard, INOX, 11cm
Incubateur	LMS Ltd, UK	Series 2, Modèle 230	Pour le test d’alimentation thermogénétique (30 ? C)
Incubateur	Percival Scientific, États-Unis	DR36NL	Pour stadifier les larves (19 ? C)
Lignées	Janelia Janelia Research Campus		Informations détaillées dans le tableau 2
Régimes d’équilibrage des macronutriments	Composition et informations nutritionnelles
Méthanol	VWR	Numéro CAS : 67-56-1
Nipagin (4-hydroxybenzoate de méthyle)	Sigma-Aldrich	H5501
Gants en nitrile	VWR, États-Unis
Centrifugeuse réfrigérée	Eppendorf, Allemagne	5804 R / N° de série : 5805CI364293
Rubin Gal4 ines	Janelia Research Campus		Stoks disponible à Bloomington Drosophila Stock Center
ShibireTS Ligne UAS	Bloomington Drosophila Stock Center	Numéro BDSC : 66600	Fourni par Carlos Ribeiro Group
Brosses			doucesPour le tri des mouches des fruits anesthésiées
Spectrophotomètre lecteur de plaques	Thermo Fisher Scientific	Multiskan Go 51119300
Stéréomicroscope	Nikon	1016625
Saccharose	Sidul, Portugal
		d’élevage des larves du troisième stade (L3)	Composition et informations nutritionnelles dans la figure 1
Minuterie
Lyseur de tissus / batteur de billes	MP Biomedicals, USA	FastPrep-24 6004500
TRPA1 Ligne UAS	Bloomington Drosophila Stock Center	Numéro BDSC : 26264	Exprime TrpA1 sous contrôle UAS ; peut être utilisé pour activer expérimentalement les neurones à 25 ? C
Bain-marie	Sheldon Manufacturing Inc., USA	W20M-2 / 03068308 / 9021195
Extrait de levure	Pró ;-vida, Portugal		51 % Protéines, 15 % Glucides