Préparation du pli vocal du rat pour les analyses neuromusculaires

Résumé

Ce protocole décrit les méthodes utilisées pour préparer les plis vocaux des rats pour l’étude neuromusculaire histochimique.

Résumé

Le but de ce tutoriel est de décrire la préparation du pli vocal du rat pour l’étude neuromusculaire histochimique. Ce protocole décrit les procédures de dissection laryngée chez le rat, de congélation éclair et de cryosection des plis vocaux. Cette étude décrit comment cryosectionner les plis vocaux dans les plans longitudinal et transversal. Une nouveauté de ce protocole est le suivi laryngé pendant la cryosection qui assure une identification précise des muscles laryngés intrinsèques et réduit le risque de perte de tissu. Les figures démontrent la cryosection progressive dans les deux plans. Vingt-neuf hémi-larynges de rats ont été cryosectionnés et suivis depuis l’émergence du cartilage thyroïdien jusqu’à l’apparition de la première section qui comprenait le pli vocal complet. Le pli vocal complet a été visualisé pour tous les animaux des deux plans. Il y avait une grande variabilité dans la distance entre l’apparition du cartilage thyroïdien et l’apparition du pli vocal complet dans les deux plans. Le poids n’était pas corrélé à la profondeur des repères laryngés, ce qui suggère que la variabilité individuelle et d’autres facteurs liés à la préparation des tissus peuvent être responsables de la grande variabilité de l’apparence des points de repère pendant la section. Cette étude détaille une méthodologie et présente des données morphologiques pour préparer le pli vocal du rat à l’investigation neuromusculaire histochimique. En raison de la grande variabilité individuelle, les repères laryngés doivent être suivis de près pendant la cryosection pour éviter la sursection des tissus et la perte de tissus. L’utilisation d’une méthodologie cohérente, y compris une préparation adéquate des tissus et la connaissance des points de repère dans le larynx du rat, aidera à obtenir des résultats cohérents dans toutes les études et aidera les nouveaux chercheurs intéressés à utiliser le pli vocal du rat comme modèle pour étudier les mécanismes neuromusculaires laryngés.

Introduction

Le larynx du rat est un modèle bien établi pour étudier les adaptations laryngées neuromusculaires structurelles et fonctionnelles au développement, au vieillissement, à la maladie et aux agents pharmacologiques1,2,3,4,5. La cohérence des méthodes histologiques est essentielle à cette ligne de travail, car il existe de multiples subtilités impliquées dans la préparation et l’analyse musculaires ainsi que des défis associés à la taille, à la forme et à la topographie des muscles laryngés

Protocole

Cette étude a été réalisée en conformité avec le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Faculté de médecine de l’Université de New York.

1. Disséquer le larynx du rat

1. Euthanasier le rat selon le protocole approuvé par l’institution. Raser le cou ventral de la mandibule au manubrium et écouvillonner avec de l’alcool pour éviter la contamination de la fourrure dans les échantillons de tissus.
2. Sous une lunette de dissection avec un grossissement de 10x, excisez tout le larynx en créant une incision du cou médiane avec un scalpel jusqu’à ce que la trachée soit exposée.
3. Séparez les muscles....

Résultats

Les résultats représentatifs faisaient partie d’une étude en cours sur les effets de l’exercice vocal sur le système neuromusculaire laryngé. Vingt-neuf rats mâles Fischer 344/bruns de Norvège (12 âgés de 9 mois, 17 âgés de 24 mois) ont été pesés et euthanasiés par inhalation de _CO2 suivie d’une thoracotomie bilatérale.

Les procédures ont suivi le protocole décrit pour étiqueter les NMJ et la taille des fibres des muscles ta latéraux et médiaux. La distance entre les repères laryngé.......

Discussion

La préparation des plis vocaux des rats pour l’analyse neuromusculaire peut présenter divers défis. Non seulement les muscles laryngés sont petits et entourés de cartilage, ce qui rend difficile l’extraction directe du muscle cible, mais une grande variabilité a également été observée entre les animaux en profondeur des repères anatomiques laryngés. Pour le muscle, le protocole du plan de coupe transversale, des sections complètes du pli vocal sont apparues entre 21 et 85 sections (10 μm par section) après l’apparition i.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
2-Méthylbutane Certifié	Fisher Chemical	35514
Feuille d’aluminium	Fisherbrand	1213101
Pinces cryogéniques SS	Thermo Scientific	11679123
Cryostat	Leica Biosystems	CM3050
Lames de cryostat	C.L. Sturkey D554X50	22-210-045
Moules de base jetables 15mm x 15mm	Thermo Scientific	41-741
Coussinets jetables	Medline	23-666-062
Kit de dissection	Thermo Scientific	9996969
DPBS - Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14190136
Section Congelée Medium	Fisher Healthcare	23-730-571
Seau à glace	Bel-Art
Chambre d’humidité	Immunostain Ted Pella Inc	NC9425474
Porte-aiguilles	Assi	ASSI. B148
Éponges non tissées, 4 plis	Quick Medical	9023
Agitateur orbital	Troemner	02-217-987
Stylo Pap
, 16 % p/v aq. soln., sans méthanol	Alfa Aesar	50-00-0
Tubes de microcentrifugation haut de gamme	Fisherbrand	5408129
Stockage d’échantillons Sacs	Fisherbrand	19240093
Acier inoxydable gradué mesure 32 oz/100 mL	Polar Ware	114231B
Superfrost Plus Lames de microscope	Fisherbrand	12-550-15
Essuie-glace de travail	Kimberly-Clark Professional&trade ; 34155	06666A
Minuterie	Fisherbrand	2261840
Vannas Pattern Ciseaux	Assi	ASSI.
REMARQUE : Pour toutes les fournitures, voici des exemples d’équipements à acheter. Le modèle exact n’est pas nécessaire pour compléter nos méthodes.

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