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Article de méthode

Un test d’alimentation orale bactérienne avec des moustiques traités aux antibiotiques

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DOI :

10.3791/61341

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12 septembre 2020

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1Hunan Provincial Key Laboratory of Animal Intestinal Function and Regulation, College of Life Science, Hunan Normal University, 2State Key Laboratory of Developmental Biology of Freshwater Fish, Hunan Provincial Key Laboratory for Microbial Molecular Biology, College of Life Science, Hunan Normal University, 3Department of Infectious Diseases, the Second Xiangya Hospital, Central South University

Dans cet article

Résumé

Cet article présente un protocole pour étudier l’effet des bactéries intestinales des moustiques individuelles, y compris l’isolement et l’identification des microbes cultivables midgut moustique, l’épuisement antibiotique des bactéries intestinales des moustiques, et réintroduire une espèce spécifique de bactéries.

Résumé

Le moustique midgut abrite un microbiome très dynamique qui affecte le métabolisme de l’hôte, la reproduction, la forme physique et la compétence vectorielle. Des études ont été menées pour étudier l’effet des microbes intestinaux dans leur ensemble; cependant, différents microbes pourraient exercer des effets distincts vers l’hôte. Cet article fournit la méthodologie pour étudier l’effet de chaque microbe spécifique d’intestin de moustique et le mécanisme potentiel.

Ce protocole contient deux parties. La première partie introduit la façon de disséquer le moustique midgut, d’isoler les colonies de bactéries cultivables et d’identifier les espèces de bactéries. La deuxième partie fournit la procédure pour générer des moustiques traités aux antibiotiques et réintroduire une espèce bactérienne spécifique.

Introduction

Les moustiques sont considérés comme les vecteurs les plus importants des maladies pathogènes humaines, transmettant plus d’une centaine d’agents pathogènes, y compris le virus Zika, le virus de la dengue et les parasites Plasmodium 1. Lorsque les moustiques prennent un repas sanguin pour acquérir des nutriments pour l’oviposition, ils peuvent accidentellement ingérer des agents pathogènes d’un hôte infecté via le tube digestif2. Fait important, le midgut de moustique, qui joue un rôle central dans la digestion de farine de sang et l’entrée de pathogène, abrite un microbiome très dynamique3.

Plusieurs études ont caractérisé le microbiote des moustiques élevés en laboratoire et sur le terrain à l’aide d’une méthode dépendante de la culture ou d’un test de séquençage des bactéries4,,5,6. Espèces, y compris Pantoea, Serratia, Klebsiella, Elizabethkingia, et Enterococcus sont généralement isolés des moustiques dans diverses études5,7,8,9. Fait intéressant, le microbiote intestinal des moustiques fluctue dynamiquement dans la diversité de la communauté et la quantité d’espèces bactériennes, affectées par le stade de développement, les espèces, l’origine géographique et le comportement alimentaire4. Des études montrent que l’alimentation sanguine augmente considérablement la charge bactérienne totale avec l’expansion rapide des espèces d’Enterobacteriaceae et une réduction de la diversité globale10,11. En outre, le microbiote intestinal des moustiques du stade larvaire est généralement éradiqué lorsque l’insecte subit une métamorphose pendant la pupation et l’éclosion; ainsi, les moustiques adultes nouvellement émergés ont besoin de repeupler leur microbiote4.

Le microbiote intestinal module la physiologie des insectes sous divers aspects, y compris l’absorption des nutriments, l’immunité, le développement, la reproduction et la compétence vectorielle12. Les larves de moustiques axeniques ne se développent pas au-delà de la première étoile tandis qu’un approvisionnement oral de bactéries sauve le développement, indiquant que le microbe d’intestin de moustique est essentiel pour le développement de larval13,14. En outre, l’épuisement des bactéries intestinales retarde la digestion des farines sanguines et l’absorption des nutriments, affecte la maturation des ovocytes, et diminue l’oviposition15. En outre, les moustiques atteints de microflore intestinale provoquent des réponses immunitaires plus élevées que les moustiques traités aux antibiotiques, avec une expression peptide antimicrobiene constamment élevée contre d’autres agents pathogènes pour infecter16. Les antibiotiques sont généralement administrés par voie orale pour éliminer les bactéries intestinales dans ces études, puis des expériences sont menées pour comparer la différence entre les moustiques axeniques et les moustiques avec les microbes commensaux. Cependant, le moustique midgut abrite une communauté diversifiée de microbes, et chaque espèce de bactéries pourrait exercer un effet distinct vers la physiologie de l’hôte.

Le microbiote des moustiques régule la compétence vectorielle avec des effets divergents. La colonisation par Proteus isolé des moustiques dérivés du champ des zones dengue-endémiques confère l’expression et la résistance des peptides antimicrobiens upregulés contre l’infection par le virus de la dengue16. Le champignon entomopathogène Beauveria bassiana active la voie immunitaire Toll et JAK-STAT contre l’infection par l’arbovirus17. En revanche, le champignon Talaromyces isolé d’Aedes aegypti midgut facilite l’infection par le virus de la dengue en modulant l’activité de trypsineintestinale 18. En outre, Serratia marcescens favorise la transmission d’arbovirus par une protéine sécrétoire appelée SmEnhancin, qui digère la couche de mucine sur l’épithélium intestinal des moustiques19.

Cette procédure fournit une méthode systématique et intuitive pour la dissection du midgut de moustique, l’isolement des colonies de bactéries cultivables, l’identification des espèces de bactéries, et la réintroduction par l’alimentation orale. Il fournit des résultats représentatifs de l’alimentation du sang avec une bactérie commensal, Chryseobacterium meningosepticum, sur le développement des ovaires de moustiques et l’oviposition.

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Protocole

1. Dissection de midgut et isolement des bactéries cultivables

  1. Préparer le moustique à la dissection.
    1. Recueillir les moustiques 7 à 9 jours après l’émergence avec un aspirateur. Anesthésiez les moustiques recueillis en les soumettant à une température de 4 °C pendant 3 à 5 min et gardez les moustiques anesthésiés dans une boîte de Pétri glacée jusqu’à la dissection.
  2. Stériliser les instruments de laboratoire et la surface du moustique.
    1. Stériliser le banc d’expérimentation, disséquer le microscope, les forceps et la lame de verre en pulvérisant 75% d’éthanol pour éviter la contamination par les bactéries de l’environnement.
    2. Préparer une boîte de Pétri stérile contenant 75 % d’éthanol et deux plats Petri contenant de la solution saline tamponnée stérile de 1x phosphate (1x PBS).
    3. Stériliser le moustique en trempant et en le secouant dans 75 % d’éthanol pendant 3 min, et rincez deux fois avec un tampon PBS de 1x au cas où l’éthanol affecterait la flore intestinale disséquée.
  3. Disséquer le moustique midgut.
    1. Transférer le moustique stérilisé de surface sur la glissière en verre à l’aide d’une goutte de tampon stérile 1x PBS. Disséquer sous le microscope de dissection.
    2. Sous le grossissement inférieur du microscope de dissection, retirez soigneusement les jambes, les ailes et la tête du moustique pour éviter l’évasion. Retirez le dernier somite du moustique en le coupant directement, plutôt que de le tirer, pour empêcher le tube digestif de se briser.
    3. Pincez le thorax du moustique et l’extrémité de l’abdomen avec des forceps. Retirez doucement le tube digestif du moustique. Le tube digestif acquis contient habituellement la culture, le foregut, le midgut, le hindgut et les trompes de Malpighian.
    4. Ajuster le microscope de dissection à un grossissement plus élevé. Retirez la culture, le foregut, le hindgut et les trompes de Malpighian du tube digestif disséqué pour obtenir le midgut du moustique.
    5. Prenez soin tout en enlevant la culture, comme la culture se gonfle et ressemble à la midgut après que le moustique prend un repas de sucre. Les trompes de Malpighian, un groupe de tubes excrétoires longs et minces, sont situés à la limite entre le midgut et le hindgut.
  4. Isoler les bactéries intestinales.
    1. Transférer le midgut disséqué dans un tube stérile de 1,5 mL avec 200 μL de tampon stérile 1x PBS.
    2. Broyer le midgut sur un banc stérile à fond avec un pilon stérile pour permettre la libération complète des bactéries intestinales dans le tampon.
    3. Diluer en série l’homogénéité en trois dilutions 10 fois. Ajouter 50 μL de chaque dilution dans la plaque d’agar LB (bouillon de Luria), puis étendre sur l’assiette. Si le midgut contient une forte concentration de flore intestinale, il est essentiel de faire plus de dilutions en série pour choisir des colonies uniques.
    4. Incuber la plaque à 37 °C pendant 1 à 2 jours jusqu’à ce que des colonies individuelles soient visibles.
  5. Identification des espèces
    1. Choisissez des colonies individuelles et inoculez-les respectivement dans une fiole conique de 150 ml contenant 50 ml de bouillon LB moyen.
    2. Agiter les bactéries à 37 °C pendant la nuit.
    3. Extraire l’ADN total par kit d’extraction d’ADN génomique bactérien. Amplifier l’ADN 16S par réaction en chaîne de polymérase (PCR).
      REMARQUE : Il existe plusieurs segments dans l’ADN 16S qui sont conservés. Sur la base de ces régions conservées, les amorces universelles pour les bactéries peuvent être conçues pour amplifier les fragments d’ADdrène 16S de toutes les bactéries. Ces amorces sont spécifiques aux bactéries, et la différence dans la région variable de 16S rDNA peut être utilisée pour distinguer différentes bactéries. Par conséquent, 16S rDNA est largement utilisé pour l’identification bactérienne.
    4. Récupérez et purifiez les fragments d’ADN des produits PCR par l’électrophorèse de gel d’agarose et un kit commercial de récupération de gel.
    5. Effectuer le séquençage de l’ADN sur les fragments d’ADN purifiés pour obtenir des séquences de gènes bactériens.
    6. Comparez la séquence du gène rRNA 16S avec la séquence bactérienne disponible dans GenBank. Sélectionnez la base de données Bactéries et Archaea.
      REMARQUE : L’identification au niveau de l’espèce a été définie comme étant la similitude de la séquence de l’ADNr de 16 s de ≥99 % à l’entrée genbank la plus proche. L’isolat a été attribué au genre correspondant lorsque sa similitude de séquence 16S rDNA était de <99% et ≥95%.

2. Traitement antibiotique et réintroduction de bactéries

  1. Préparez la solution antibiotique.
    1. Peser la quantité requise de saccharose, de pénicilline et de streptomycine pour préparer une solution de saccharose de 10 %, y compris 20 unités de pénicilline et 20 μg de streptomycine par mL.
  2. Nourrissez les moustiques avec la solution antibiotique.
    1. Anesthésier les moustiques en 4 °C pendant 3 à 5 min. Transférer les moustiques dans une tasse en papier. Couvrir le dessus de gaze et enserrir la gaze avec du ruban adhésif pour empêcher les moustiques de s’échapper.
    2. Tremper les boules de coton stériles dans la solution antibiotique et les placer soigneusement sur la tasse de moustique. Presser les boules de coton avant d’être utilisées pour empêcher les moustiques de se noyer dans les boules de coton qui coulent.
    3. Couvrir les boules de coton d’une boîte de Pétri de 10 cm pour éviter l’évaporation de l’humidité. Remplacer les boules de coton deux fois par jour pendant trois jours consécutifs.
  3. Confirmer l’efficacité du traitement antibiotique.
    1. Selon la méthode ci-dessus, disséquer le midgut des moustiques traités aux antibiotiques.
    2. Transférer les midguts disséqués dans un tube stérile de 1,5 mL avec 200 μL de tampon stérile 1x PBS.
    3. Broyer les midguts dans un banc stérile à fond avec un pilon stérile pour permettre la libération complète des bactéries intestinales dans le tampon.
    4. Extraire l’ADN microbien intestinal par kit d’extraction d’ADN génomique bactérien.
    5. Effectuer la quantitation bactérienne par PCR quantitatif en temps réel (qPCR) sur l’ADN génomique à l’aide d’amorces d’eubactéries universelles (16S rRNA F: TCCTACGGGAGGGAGCAGT et R: GGACTACCAGGGTATCTCTCTCTCTTT).
  4. Préparation de la suspension bactérienne
    1. Mesurer la solution bactérienne à l’aide d’un spectrophotomètre. Ajouter 1 suspension bactérienne OD (OD600) dans un tube de 1 mL. Centrifuge la suspension à 5 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
    2. Jetez le supernatant et ajoutez 1 ml de tampon stérile 1x PBS à 1,5 mL pour les précipitations de suspension.
    3. Centrifugeuse à 5 000 x g pendant 5 min à 4 °C; jeter le supernatant.
    4. Répétez les étapes 2.4.2 et 2.4.3.
    5. Ajouter 200 μL de tampon stérile de 1x PBS aux précipitations bactériennes.
    6. Ajouter 600 μL de solution de saccharose à 10 %, 200 μL d’ATP de 10 mm (qui agit comme phagostimulant) et 200 μL de suspension bactérienne dans un tube stérile de 1,5 mL. Mélanger en vortexant. Sinon, suspendez les granulés bactériens dans le sang inactivé par la chaleur.
    7. Préparation du sang inactivé par la chaleur
      1. Recueillir le sang frais avec un tube anticoagulant.
      2. Prenez 2 à 3 mL de sang frais. Centrifugeuse à 1 000 x g pendant 10 min à 4 °C pour séparer le plasma et les cellules sanguines. Notez que le sang sera perdu pendant la centrifuge et le processus de lavage; il est nécessaire de calculer l’utilisation à l’avance.
      3. Recueillir le plasma dans un nouveau tube de 1,5 mL et inactiver la chaleur à 56 °C pendant 1 h.
      4. Ajouter 500 μL de tampon stérile 1x PBS à 1,5 mL pour la suspension des cellules sanguines. Centrifugeuse à 1 000 x g pendant 10 min à 4 °C, puis jeter le supernatant.
      5. Répétez deux fois l’étape 2.4.7.4.
      6. Resuspender les cellules sanguines avec du plasma inactivé thermiquement pour obtenir du sang inactivé thermiquement.
      7. Suivez les étapes 2.4.1 à 2.4.4 pour obtenir 1 OD bactérienne granulé.
      8. Resuspendez les bactéries granulées avec 1 mL de sang inactivé par la chaleur.
  5. Nourrissez le moustique avec la suspension de bactéries.
    1. Affamer les moustiques pendant 24 h, permettant aux antibiotiques de métaboliser avant de nourrir les bactéries.
    2. Assembler le système d’alimentation des membranes.
    3. Sceller l’unité d’alimentation stérilisée à l’aide d’un parafilm, alternativement une membrane de collagène.
    4. Mettez un anneau en plastique et fixez-le avec le parafilm pour éviter de se casser en raison de la friction pendant l’alimentation.
    5. Ajoutez lentement la solution bactérienne préparée à l’unité d’alimentation. Notez qu’un seul puits de l’unité d’alimentation à deux puits peut être rempli avec la solution et couvrir l’unité d’alimentation uniquement du côté de la chute du réactif.
    6. Connectez l’unité d’alimentation à un système d’alimentation préchauffé à 37 °C, qui simule la température humaine pour attirer les moustiques. Placez le dispositif d’alimentation sur une tasse de papier remplie de moustiques et nourrissez pendant 90 min.
    7. Après l’alimentation, anesthésiez les moustiques en les soumettant à une température de 4 °C pendant 3 à 5 min et gardez les moustiques anesthésiés dans une boîte de Pétri glacée.
    8. Choisissez les moustiques entièrement engorgés pour d’autres études.

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Résultats

Les midguts des moustiques traités avec des antibiotiques et sans antibiotiques ont été sortis pour l’extraction d’ADN, et qPCR a été exécuté avec des amorces bactériennes universelles. La figure 1 montre l’expression de l’ARN 16S bactérien dans le groupe témoin et le groupe de traitement antibiotique. Les résultats montrent qu’environ 98% des bactéries intestinales ont été enlevées, et la stérilisation intestinale de la pénicilline et de la streptomycine a été réussie.

Avec l...

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Discussion

La recherche sur les interactions hôte-microbe ont constaté que différents microbes intestinaux affectent leur physiologie hôte par des mécanismes divergents. Cet article présente la méthode pour étudier le rôle respectif du microbe intestinal de moustique, y compris la dissection de midgut de moustique, la culture des bactéries intestinales cultivables, le traitement antibiotique, et la réintroduction des bactéries d’intérêt.

Pour réussir un traitement antibiotique, les détails suivants doive...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus par la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81902094, 81600497) et le Projet de plan scientifique et technologique de la province du Hunan (2019RS1036).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Adénosine 5&prime ;-triphosphate disodium sel hydratéSigmaA2383Adénosine 5&prime ;-triphosphate disodium hydrate a été utilisé pour préparer des solutions étalons d’adénosine triphosphate (ATP)
Aedes aegyptiMoustiques femelles
Tube anticoagulantBD Vacutainer363095Recueillir du sang frais
Tube à centrifuger Sangon BiotechF601620-00101,5 ml, Naturel, Gradué, Stérile
Boules
Pilon de broyage de tissus jetablesSangon BiotechF619072-000170 mm de long, conique, bleu, stérile
Éthanol absoluPainiDiluez-le à 75 % d’éthanol
PinceRWDF11029Dissection
Hemotek Alimentation par membrane SystèmeHemotekComposants du système d’alimentation, y compris  ; Régulateur de température Hemotek, ensemble alimentation-boîtier, alimentation métallique assemblée.
Agitateur d’incubateurZQZY-78AN
Boucles d’inoculationSangon BiotechF619312-000110 &mu ; l, Poudre
d’agar LBSangon BiotechA507003Tryptone 10,0 g, Extrait de levure 5,0 g, NaCl 10,0 g, Agar 15,0 g.
LB Bouillon en poudreSangon BiotechA507002Tryptone 10.0 g, Extrait de levure 5.0 g, NaCl 10.0 g.
MicroscopeZeissStemi508
GobeletPlace moustique
ParafilmSangon BiotechF1040024 inx 125 ft
Boîte de PétriSangon BiotechF611203
Pénicilline G procaïne sel hydraterSangon BiotechA606248Poudre blanche. Soluble dans l’eau, soluble dans le méthanol, légèrement soluble dans l’eau, l’éthanol
Pipette unique ChannalGilson
Sulfate de streptomycineSangon BiotechA610494Le sulfate de streptomycine est un antibiotique glucosamine qui interfère avec la synthèse des protéines procaryotes.
SaccharoseSangon BiotechA502792soluble dans l’eau, l’éthanol et le méthanol, légèrement soluble dans le glycérol et la pyridine.
Kit d’ADN des bactéries TIANampTIANGENDP302Extrait d’ADN  ;
Tissu utilitaire-moustiquaire Moustiquaire Mélangeur Vortex blanc
Scintic IndustriesS1-0246
1.5ml EP tubeSangon BiotechF600620
10X tampon PBSSangon BiotechE607016Ce produit est une solution 10X. Veuillez le diluer 10 fois avant utilisation. La valeur du pH est de 7,4.
de coton jaune en papier

Références

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