Livraison d’anticorps dans le cerveau à l’aide d’ultrasons à balayage focalisé

Résumé

Présenté ici est un protocole pour ouvrir transitoirement la barrière hémato-encéphalique (BHE) soit de manière focale, soit dans tout le cerveau d’une souris pour délivrer des anticorps marqués par fluorescence et activer la microglie. Une méthode permettant de détecter l’administration d’anticorps et l’activation de la microglie par histologie est également présentée.

Résumé

Seule une petite fraction des anticorps thérapeutiques ciblant les maladies du cerveau sont absorbés par le cerveau. L’échographie focalisée offre la possibilité d’augmenter l’absorption des anticorps et l’engagement par l’ouverture transitoire de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Dans notre laboratoire, nous développons des approches thérapeutiques pour les maladies neurodégénératives dans lesquelles un anticorps de différents formats est délivré à travers le BBB à l’aide de microbulles, en même temps que l’application d’ultrasons focalisés à travers le crâne ciblant plusieurs points, une approche que nous appelons échographie de balayage (SUS). Les effets mécaniques des microbulles et des ultrasons sur les vaisseaux sanguins augmentent le transport paracellulaire à travers la BHE en séparant transitoirement les jonctions serrées et améliorent la transcytose médiée par les vésicules, permettant aux anticorps et aux agents thérapeutiques de se croiser efficacement. De plus, l’échographie facilite également l’absorption des anticorps du cerveau interstitiel dans les cellules du cerveau telles que les neurones où l’anticorps se distribue dans tout le corps cellulaire et même dans les processus neurigineux. Dans nos études, des anticorps marqués par fluorescence sont préparés, mélangés à des microbulles à base de lipides préparées en interne et injectés à des souris immédiatement avant l’application du SUS sur le cerveau. L’augmentation de la concentration d’anticorps dans le cerveau est ensuite quantifiée. Pour tenir compte des altérations de l’homéostasie cérébrale normale, la phagocytose microgliale peut être utilisée comme marqueur cellulaire. Les données générées suggèrent que l’administration d’anticorps par ultrasons est une approche attrayante pour traiter les maladies neurodégénératives.

Introduction

L’échographie thérapeutique est une technologie émergente visant à traiter les maladies du cerveau de manière non invasive, en partie en facilitant l’accès des agents thérapeutiques au ^cerveau1,2,3. Comme seule une petite fraction des anticorps thérapeutiques ciblant les maladies du cerveau sont absorbés et retenus dans le ^cerveau4, les ultrasons thérapeutiques offrent la possibilité d’augmenter leur absorption et leur engagement ^cible5,6.

Dans notre laboratoire, nou....

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité d’éthique animale de l’Université du Queensland.

1. Préparation interne des microbulles

1. Peser un rapport molaire de 9:1 de 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphocholine et de 1,2-distéaroyl-sn-glycero-3-phosphoéthanolamine-N-[amino(polyéthylèneglycol)-2000] (sel d’ammonium). 0,5 mg de mélange lipidique est nécessaire pour 1 mL de solution de microbulles. Alternativement, les lipides peuvent être achetés déjà dans le chloroforme, si vous utilisez des lipides pré-dissous, passez à l’étape 1.3.
2. Dissoudre le lipide dans un petit volume de chloroforme dans u....

Résultats

En utilisant ce protocole, des anticorps marqués par fluorescence sont délivrés au cerveau et peuvent être détectés, ainsi que l’activation de la microglie. La conclusion que l’on peut tirer est que l’utilisation d’ultrasons focalisés et de microbulles améliore considérablement l’absorption des anticorps par le cerveau et peut délivrer des anticorps à l’ensemble du cerveau ou de l’hémisphère d’une souris lorsqu’elle est utilisée en mode de balayage. La figure 1 montre le dispositif d’applica.......

Discussion

Les anticorps marqués par fluorescence peuvent être délivrés au cerveau à l’aide d’ultrasons focalisés et de microbulles appliquées en mode balayage. L’administration d’anticorps, la morphologie microgliale et l’élargissement lysosomal peuvent être détectés par microscopie à fluorescence après une échographie à balayage. Les microglies peuvent absorber dans leurs lysosomes des anticorps et des antigènes auxquels les anticorps se sont liés dans un processus médié par le récepteur ^Fc4.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphocholine	Avanti	850365C
1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N-[amino(polyéthylèneglycol)-2000]	Avanti	880128C
AlexaFluor 647 kit de marquage d’anticorps	Thermo Fisher	A20186
CD68 anticorps	AbD Serotec	MCA1957GA	utilisation dilution
1:1000Compteur	Soggma-Aldrich	372978
Socter Chloroforme (Multisizer 4e)
Glycérol	Sigma-Aldrich	G5516
IgG anti-lapin Chèvre, Alexa Fluor 488	Thermo FIsher	A-11008	Utiliser
IgG anti-lapin Chèvre dilution, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher	A-11077	Utiliser dilution
1:500support de tête (modèle SG-4N, Narishige Japon)
Anticorps Iba1	Wako	019-19741	Utilisation d’une dilution 1:1000
Logiciel d’analyse d’images	Beckman Coulter	#8547008
Solution d’écoulement Isoflow	Beckman Coulter	B43905
Système d’imagerie proche infrarouge Odyssey Fc Licor		2800-03
Octafluoropropane	Arcadophta	0229NC
Propylène Glycol	Sigma-Aldrich	P4347
TIPS (Système de sonde d’imagerie thérapeutique)	Philips Research	TIPS_007
	Bitplane