Article de méthode

Un modèle de culture cellulaire pour étudier le rôle des interactions neurone-glia dans l’ischémie

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DOI :

10.3791/61388

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14 novembre 2020

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1Centro de Investigação em Ciências da Saúde (CICS-UBI), Universidade da Beira Interior, 2Faculdade de Ciências da Saúde, Universidade da Beira Interior

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons une approche simple utilisant des milieux de culture spécifiques qui permettent l’établissement de cultures enrichies de neurones et d’astrocytes, ou de cultures neuron-glia du cortex embryonnaire, avec un rendement élevé et une reproductibilité.

Résumé

L’AVC ischémique est une condition clinique caractérisée par l’hypoperfusion du tissu cérébral, conduisant à la privation d’oxygène et de glucose, et la perte neuronale conséquente. De nombreuses preuves suggèrent que l’interaction entre les cellules gliales et neuronales exercent des effets bénéfiques après un événement ischémique. Par conséquent, pour explorer les mécanismes de protection potentiels, il est important de développer des modèles qui permettent d’étudier les interactions neurone-glia dans un environnement ischémique. Ici, nous présentons une approche simple pour isoler les astrocytes et les neurones du cortex embryonnaire du rat, et qu’en utilisant des milieux de culture spécifiques, permet l’établissement de cultures enrichies de neurones ou d’astrocytes ou de cultures neuronaux-glia à haut rendement et reproductibilité.

Pour étudier le croisement entre les astrocytes et les neurones, nous proposons une approche basée sur un système de co-culture dans lequel les neurones cultivés en couvercles sont maintenus en contact avec un monocouche d’astrocytes plaqués dans des plaques multi-puits. Les deux cultures sont maintenues à part par de petites sphères de paraffine. Cette approche permet la manipulation indépendante et l’application de traitements spécifiques à chaque type de cellule, ce qui représente un avantage dans de nombreuses études.

Pour simuler ce qui se produit lors d’un AVC ischémique, les cultures sont soumises à un protocole de privation d’oxygène et de glucose. Ce protocole représente un outil utile pour étudier le rôle des interactions neurone-glia dans les accidents vasculaires cérébraux ischémiques.

Introduction

Selon les données de l’Organisation mondiale de la santé, environ 5,5 millions de personnes meurent chaque année d’un AVC ischémique1. Cette condition est caractérisée par l’interruption du flux sanguin vers une certaine région du cerveau, résultant en une perte réversible ou irréversible dans l’approvisionnement en oxygène et en nutriments du tissu, qui modifie la fonction tissulaire et conduit à un dysfonctionnement mitochondrial, dysrégulation du calcium, excitotoxicité glutamate, inflammation et perte cellulaire2,3.

En dehors des cellules vasculaires, les cellules neuronales et gliales sont impliquées dans la pathophysiologie de l’AVC ischémique4. En particulier, les astrocytes sont essentiels à l’entretien des neurones et ont récemment été montrés pour jouer un rôle critique dans la réponse à la lésion ischémique5. Ce type de cellule gliale remplit les fonctions de soutien structurel, de défense contre le stress oxydatif, de synthèse des neurotransmetteurs, de stabilisation de la communication cellule-cellule, entre autres6. Avec les neurones, les astrocytes jouent un rôle direct dans la transmission synaptique, régulant la libération de molécules telles que l’adénosine triphosphate, l’acide gamma-aminobutyrique et le glutamate7. Une partie de la blessure induite par l’ischémie est causée par la libération excessive de glutamate et son accumulation à la fissure synaptique, conduisant à la suractivation des récepteurs N-méthyl-D-aspartate, l’activation en aval des cascades de signalisation, résultant finalement en excitotoxicité8. Puisque les astrocytes sont capables d’enlever le glutamate de la fente synaptique et de le convertir en glutamine, ils sont cruciaux dans la défense contre l’excitotoxicité, exerçant ainsi un effet neuroprotecteur sur l’ischémie. Ces cellules jouent également un rôle dans la neuroinflammation induite par l’ischémie. Après l’insulte ischémique, les astrocytes activés subissent des changements morphologiques (hypertrophie), prolifèrent, et montrent une augmentation de l’expression de protéine acide fibrillaire gliale (GFAP). Ils peuvent devenir réactifs (astrogliose), libérant des cytokines pro-inflammatoires telles que le facteur de nécrose tumorale α, l’interleukine-1α et l’interleukine-1β, et produisant des radicaux libres, y compris l’oxyde nitrique et le superoxyde, qui à son tour peuvent induire la mort neuronale9,10. En revanche, les astrocytes réactifs peuvent également jouer un effet neuroprotecteur, puisqu’ils libèrent des cytokines anti-inflammatoires, telles que la transformation du facteur de croissance β, qui est upregulated après l’AVC11. En outre, ils peuvent générer une cicatrice gliale, qui peut limiter la régénération des tissus en inhibant la germination axonale; cependant, cette cicatrice gliale peut isoler le site de blessure du tissu viable, empêchant ainsi une vague en cascade de dommages incontrôlés de tissu12,13.

Ainsi, il est impératif d’établir des modèles qui permettent d’étudier les interactions neurone-glia sous une lésion ischémique afin de trouver des stratégies thérapeutiques qui limitent ou inversent les effets des lésions ischémiques. Par rapport à d’autres modèles utilisés pour étudier les lésions ischémiques, à savoir les modèles in vivo 14,15,16, les cultures organotypices17,18,19 et les tranches cérébrales aiguës20,21,22, les cultures cellulaires primaires sont moins complexes, ce qui permet l’étude des contributions individuelles de chaque type de cellule dans la pathophysiologie de l’AVC ischémique et comment chaque type de cellule répond à des cibles thérapeutiques possibles. Typiquement, afin d’étudier les interactions entre les cultures enrichies de neurones et les cultures enrichies d’astrocytes, les neurones et les cellules gliales d’origine postnatale sont utilisés23,24, ou cellules gliales gliales postnatales et neurones embryonnaires25,26. Ici, on propose une approche simple pour établir des cultures et des cultures de neurones enrichies de neurones ou d’astrocytes et des cultures de neurones-glia à partir du même tissu. Ces cellules primaires sont obtenues à partir du cortex embryonnaire du rat, une région fréquemment affectée par l’AVC27,28. En outre, la dissociation du tissu n’est effectuée que par une procédure mécanique. Par conséquent, ce protocole permet d’isoler les cellules dans le même stade de développement, d’une manière rapide et peu coûteuse, et avec des performances élevées et la reproductibilité.

Le croisement entre les astrocytes et les neurones peut être exploré à l’aide d’un système de co-culture dans lequel les neurones cultivés dans des couvercles sont maintenus en contact avec un monocouche d’astrocytes ensemencés dans des plaques multi-puits. De petites sphères de paraffine peuvent être utilisées pour assurer la séparation des deux cultures cellulaires. Cette approche permet une manipulation indépendante de chaque type de cellule avant qu’ils ne soient mis en contact. Par exemple, il est possible de réduire au silence un gène spécifique dans les astrocytes et de voir comment il peut influencer la vulnérabilité neuronale ou la protection contre les dommages induits par l’ischémique. Une méthode établie pour induire des conditions ischémiques in vitro est la privation d’oxygène et de glucose (OGD)3, qui consiste à remplacer l’atmosphère régulière (95% d’air et 5% de CO2)par une atmosphère anoxique (95% N2 et 5% CO2),associée à l’omission du glucose.

La méthode décrite convient à l’étude des interactions entre les neurones et les astrocytes dans le contexte d’un AVC ischémique, d’une manière simple, rapide, reproductible et peu coûteuse.

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Protocole

Tous les animaux utilisés ont été élevés au Centre de recherche en sciences de la santé du CICS-UBI conformément aux exigences éthiques nationales de la recherche sur les animaux et à la Convention européenne pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales et autres à des fins scientifiques (directive 2010/63/UE).

1. Culture cellulaire primaire du cortex embryonnaire de rat

  1. Préparation des moyens culturels
    1. Préparer le milieu neurobasal (NBM) en ajoutant les suppléments suivants : 2 % B27, 0,5 mM de glutamine, 25 μM de glutamate et 120 μg/mL gentamicine. Homogénéiser, ajuster le pH à 7,2 et stériliser le milieu à l’aide d’une étape de filtration sous vide, à l’aide d’un filtre de 0,22 μm. Pour la culture cellulaire neurone-glia, compléter le milieu de culture cellulaire NBM avec 10% du sérum fœtal bovin (HI-FBS).
    2. Préparer le milieu minimum essentiel de l’aigle moyen (MEM) avec les suppléments suivants : carbonate d’hydrogène de sodium 2,2 g/L, insuline du pancréas bovin 5 mg/L, anhydrous D-glucose 3,4 g/L, pénicilline (12 U/mL) /streptomycine (12 μg/mL) et 10 % DE-FBS. Homogénéiser, ajuster le pH à 7,2 et stériliser le milieu à l’aide d’une étape de filtration.
  2. Préparation des matériaux et de l’équipement
    1. Percer la partie terminale d’une pointe de micropipette en plastique de 1 mL d’un côté à l’autre, à l’aide d’une aiguille d’un diamètre spécifique (0,5 mm pour S; 0,6 mm pour M; 0,8 mm pour L) et sceller l’ouverture de la pointe à l’aide d’une flamme.
    2. Stériliser toute la verrerie. Tout au long de la dissection garder les outils utilisés (par exemple, ciseaux, pinces à épiler, scalpel) immergé dans 70% d’éthanol. Vaporiser les matériaux avec 70 % d’éthanol avant de les pénétrer dans la chambre à débit laminaire.
    3. Réglez la température du bain d’eau à 37 °C et placez le milieu de culture cellulaire dans le bain d’eau avant de commencer la procédure.
      REMARQUE : Pour les essais d’immunocytochimie, le revêtement poly-D-lysine doit être effectué dans des plaques multiwell contenant des couvercles.
  3. Culture du cortex embryonnaire des rats
    1. Retirer les embryons de rat d’un rat Wistar femelle avec 15-16 jours de gestation (la fin de l’accouplement, qui devrait durer 24 h, est considérée comme le1er jour du développement embryonnaire). À cette fin, anesthésier la femelle avec de la kétamine (87,5 mg/kg) et de la xylazine (12 mg/kg) et enlever les embryons. Puis euthanasier le rat femelle par dislocation cervicale, suivant le protocole standard.
    2. Placez les embryons dans un tube stérile de 50 ml, ajoutez la solution saline tampon de phosphate (PBS) jusqu’à ce qu’ils couvrent les embryons et les emmène rapidement dans la salle de culture.
    3. Toujours à l’intérieur du sac jaune, placer les embryons dans une boîte de Pétri contenant 25 mL de PBS froid. À l’aide de ciseaux et de pinces à épiler, casser le sac jaune, enlever l’embryon et le transférer dans une autre boîte de Pétri contenant également pbs froid. Le PBS dans la boîte de Pétri devrait être suffisant pour couvrir l’embryon entier.
      REMARQUE : Soyez prudent lorsque vous ouvrez le sac jaune pour éviter d’endommager l’embryon. En 1.3.3 et 1.3.4, nous avons utilisé des boîtes de Pétri de 90 mm de diamètre placées sur des blocs de glace recouverts de papier absorbant pour maintenir le PBS à basse température.
    4. Pour la dissection de l’embryon, transférez-le dans une autre boîte de Pétri contenant 30 mL de PBS froid. Placez l’embryon sous un microscope à dissection et immobilisez-le à l’aide d’une pince à épiler. Faites l’incision initiale parallèle au cortex, allant de la cavité oculaire à l’extrémité du museau et faites attention à ne pas décapiter l’animal.
    5. Retirez soigneusement le cuir chevelu et les méninges à l’aide de pinces à épiler, afin de ne pas endommager le tissu cortical du cerveau. Faites la prochaine incision pour séparer le cortex. Transférer le tissu cortical dans un tube de 15 ml contenant 5 ml de PBS à l’aide d’une pipette Pasteur.
    6. Effectuer la digestion mécanique du tissu cortical du cerveau à l’aide des pointes en plastique 1 mL préparées en 1.2.1. Triturate 10 fois avec une pipette régulière et répéter le processus à l’aide de pipettes avec des trous progressivement plus petits (L, M et S), jusqu’à ce que les morceaux se soient effondrés.
    7. Après la digestion mécanique, centrifugez la suspension à 400 x g pendant 3 min. Jeter le supernatant et réesserrasser les sédiments avec le milieu de culture cellulaire approprié préalablement réchauffé à 37 °C.
    8. Déterminer le nombre total de cellules présentes dans la suspension cellulaire (densité cellulaire) à l’aide d’une chambre Neubauer, faire les dilutions appropriées et plaquer les cellules. La densité cellulaire initiale a été définie sur la base d’une étude précédente5.
      1. Pour une culture enrichie en neurones, utilisez 0,21 x 106 cellules/cm2 comme densité cellulaire initiale et maintenez les cellules dans le milieu de culture NBM sans HI-FBS.
      2. Pour les cultures neuroneur-glia utiliser 0,14 x 106 cellules/cm2 comme densité cellulaire initiale et de maintenir les cellules dans le milieu de culture NBM complété par 10% HI-FBS.
      3. Pour une culture enrichie d’astrocytes, utilisez 0,26 x 106 cellules/cm2 comme densité cellulaire initiale et maintenez les cellules dans MEM complétées comme indiqué précédemment.
      4. Placer les cellules dans un incubateur fixé à 37 °C, 95% O2 et 5% CO2.
        REMARQUE : Pour des périodes de culture plus longues, une uridine anti-mitotique telle que 27 μM 5-fluoro-2′-désoxyuridine avec 68 μM d’uridine doit être ajoutée pour supprimer la croissance cellulaire.

2. Système de coculture

  1. Préparation des matériaux
    1. Chauffer la paraffine à 150 °C dans un bloc de chauffage pendant environ 7 min. Conserver à 150 °C jusqu’à la fin de la procédure. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur en verre stérile de 1 mm de diamètre, ajoutez une petite goutte sur des couvercles stérilisés et recouverts de PDL. Les sphères de paraffine sont irrégulières, mais elles ont environ 2 mm de diamètre. Les sphères permettront de séparer les deux cultures d’environ 1,25 mm.
    2. Comme la paraffine n’est pas stérile, placez le multiwell avec les sphères de paraffine sous rayonnement ultraviolet pendant 15 min.
    3. Pour établir la co-culture, transférer le couvercle avec les sphères de paraffine à l’aide d’une pince à épiler précédemment immergée dans 70% d’éthanol pendant 15 min.
  2. Co-culture
    1. Lorsque les deux cultures sont prêtes à l’emploi (c.-à-d. après 7 jours de culture dans les conditions mentionnées à l’étape 1.3.8), transférez les neurones ensemencés dans les couvercles avec des sphères de paraffine vers les puits contenant les astrocytes.
    2. 24 h avant que les deux cultures soient mises en contact, changer le milieu de culture des neurones et des astrocytes à NBM complété, ou non, avec HI-FBS, selon le but de l’expérience.
    3. Après avoir mis les deux types de cellules en contact, attendez 8-12 h avant de commencer les différents stimuli et procédures.
      REMARQUE : La représentation schématique du système de coculture est indiquée à la figure 1.

3. Privation d’oxygène et de glucose

  1. Préparation de la culture moyenne
    1. Pour les expériences OGD, utilisez hank’s Balanced Salt Solution (HBSS). Préparer le support HBSS avec les réactifs suivants : 1,26 mM CaCl2, 5,36 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 0,49 mM MgCl2, 139,9 mM NaCl, 4,17 mM NaHCO3, 3,38 mMNa2HPO4 .4 Homogénéiser et ajuster le pH à 7,2. Stériliser le milieu par filtration.
      REMARQUE : Le cas échéant, compléter la solution HBSS par du glucose (HBSSglu+), en ajoutant 5,56 mM de glucose. Pour les cultures soumises à ogd ne complètent pas le milieu HBSS avec du glucose (HBSSglu-).
  2. Procédure OGD
    1. 7 jours après l’ensemencement des cellules, retirez le milieu de culture et lavez-le deux fois avec HBSSglu-. Après le lavage ajouter le milieu de culture HBSglu- cellule et placer le multiwell dans la chambre d’hypoxie.
    2. Sceller la chambre d’hypoxie et ajouter un mélange de gaz contenant 95% N2/5% CO2 pendant 4 min avec un débit de 20 L/min pour enlever l’oxygène présent à l’intérieur de la chambre. Après cela, arrêter le débit et placer la chambre d’hypoxie dans un incubateur à 37 °C pendant 4 h ou 6 h, selon l’étendue de l’ischémie prévue.
    3. Après la période d’OGD, remplacer le milieu HBSSglu par le support de culture approprié pour les procédures restantes.
      REMARQUE : L’expérience OGD vise à simuler les conditions in vitro que souffrent les cellules lors d’un événement ischémique, il est donc important de certifier que tous les médias utilisés précédemment sont supprimés.

4. Essai d’immunocytochimie

REMARQUE : Effectuer l’essai d’immunocytochimie tel qu’il a été décrit précédemment5.

  1. En bref, pour caractériser les différentes cultures corticales, incuber les cellules pendant la nuit à 4 °C avec le lapin anti-GFAP (1:2000) et la protéine associée à l’anti-microtubule de souris 2 (MAP2; 1:500); puis 1 h à température ambiante avec les anticorps secondaires suivants : anti-lapin conjugué à Alexa Fluor 546 et anti-souris conjugué à Alexa Fluor 488, tous deux à 1:1000 dilution.
  2. Étiqueter les noyaux cellulaires par incubation avec 2 μM Hoechst 33342 pendant 10 min à température ambiante.
  3. Montez les couvercles dans le milieu de montage de fluorescence et obtenez des images sur un microscope d’épifluorescence avec un grossissement 63x.

5. Analyse statistique

  1. Exprimer des données en pourcentage du nombre total de cellules ou en pourcentage de contrôle et présentées comme l’erreur standard moyenne ± de la moyenne (SEM) d’au moins 3 expériences indépendantes effectuées en triple.
  2. Effectuer une analyse statistique avec un logiciel (GraphPad Software Inc., San Diego, CA), à l’aide du test t de l’étudiant non apparié. Les résultats ont été considérés comme significatifs lorsque les valeurs de p < 0,05.

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Résultats

Pour caractériser les cultures, l’immunocytochimie pour évaluer le nombre de cellules qui ont exprimé GFAP ou MAP2, marqueurs largement utilisés des astrocytes et des neurones (figure 2), a été effectuée dans chaque type de culture corticale. Cette analyse a révélé que les cultures enrichies d’astrocytes présentaient 97 % des cellules exprimant le GFAP (figure 2A). En ce qui concerne la culture enrichie en neurones, 78 % des cellules ont exprimé le MAP2, 4 % des...

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Discussion

La méthode décrite ici consiste en l’isolation des astrocytes et des neurones du tissu cortical embryonnaire du rat, permettant l’établissement de cultures ou de cultures neuronal-glia enrichies par les neurones ou les astrocytes. Il a été adapté d’une étude précédente de notre groupe5, où le neurone cortical-glia et l’isolement des cultures embryonnaires neuron-enrichies ont été décrits et les deux cultures caractérisées. En utilisant ces cultures, Roque et coll. ont constaté que les astrocytes j...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas de conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent le soutien financier de Fundação para a Ciência e a Tecnologia par le biais de Projects UIDB/00709/2020, POCI-01-0145-FEDER-029311 et la bourse SFRH/BD/135936/2018 à JP, par ''Programa Operacional do Centro, Centro 2020' par le biais du projet CENTRO-01-0145-FEDER-000013 et le financement de la plate-forme PPBI-Portugalo-portugaise de bioimaging par le biais du projet POCI-01-0145-FEDER-022122.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaques de culture à 24 puitsThermo Fischer Scientific142475
95 % N2/5 % CO2 bouteille de gazArLí ; quido
Anti-souris conjuguée à Alexa Fluor 488InvitrogenA11001dilution 1/1000 ; période d’incubation - 1 h à température ambiante
Anti-lapin conjugué à Alexa Fluor 546InvitrogenA11010dilution 1/1000 ; période d’incubation - 1 h à température ambiante
supplément B27 (50x)Gibco17504-044
Dako Fluorescence Milieu de montageDakoS3023
D-glucose anhydreFisher ScientificG/0450/603,4 g/L
Microscope à épifluorescenceZeissAxioObserver Z1x63x objectif
Sérum fœtal bovin (FBS)BiochromS061510 %
GentamicineSigma-AldrichG1272120 µ ; g/mL
de glutamateSigma-AldrichG841525µ ; M
GlutamineSigma-AldrichG31260,5 mM
Hoechst 33342InvitrogenH13992 & micro ; M; période d’incubation - 10 min à température ambiante
Chambre d’incubation d’hypoxieStemcell Technologies27310Chambre utilisée pour l’induction d’autres dettes
Insuline du pancréas bovinSigma-AldrichI55005 mg/L
de kétamineSigma-AldrichK-00287,5 mg/kg
Essential medium Eagle mediumSigma-AldrichM0268se réchauffer jusqu’à 37 ° ; C avant utilisation
Souris Anti-MAP2Santa Cruz BiotechnologySc-74421dilution 1/500 ; période d’incubation pendant la nuit à 4 ° ; C
Neurobasal moyenGibco21103-049échauffer jusqu’à 37 ° ; C avant l’utilisation
Pastilles de paraffine pour l’histologieSigma-Aldrich1.07164Point de solidification 56-58° ; C
ParaformaldéhydeSigma -AldrichP61484 % dans la
péniciline/streptomycineBiochromA 2213pénicilline (12U/mL) /streptomycine (12µ ; g/mL)
Poly-D-lysineSigma-AldrichP1024
Lapin Anti-GFAPDAKOZ0334dilution 1/2000 ; période d’incubation pendant la nuit à 4 ° ; C
Hydrogénocarbonate de sodiumFisher ScientificS/4240/602,2 g/L
XylazineSigma-AldrichX112612 mg/Kg
Minimum PBS

Références

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