Un modèle de culture cellulaire pour étudier le rôle des interactions neurone-glia dans l’ischémie

Résumé

Ici, nous présentons une approche simple utilisant des milieux de culture spécifiques qui permettent l’établissement de cultures enrichies de neurones et d’astrocytes, ou de cultures neuron-glia du cortex embryonnaire, avec un rendement élevé et une reproductibilité.

Résumé

L’AVC ischémique est une condition clinique caractérisée par l’hypoperfusion du tissu cérébral, conduisant à la privation d’oxygène et de glucose, et la perte neuronale conséquente. De nombreuses preuves suggèrent que l’interaction entre les cellules gliales et neuronales exercent des effets bénéfiques après un événement ischémique. Par conséquent, pour explorer les mécanismes de protection potentiels, il est important de développer des modèles qui permettent d’étudier les interactions neurone-glia dans un environnement ischémique. Ici, nous présentons une approche simple pour isoler les astrocytes et les neurones du cortex embryonnaire du rat, et qu’en utilisant des milieux de culture spécifiques, permet l’établissement de cultures enrichies de neurones ou d’astrocytes ou de cultures neuronaux-glia à haut rendement et reproductibilité.

Pour étudier le croisement entre les astrocytes et les neurones, nous proposons une approche basée sur un système de co-culture dans lequel les neurones cultivés en couvercles sont maintenus en contact avec un monocouche d’astrocytes plaqués dans des plaques multi-puits. Les deux cultures sont maintenues à part par de petites sphères de paraffine. Cette approche permet la manipulation indépendante et l’application de traitements spécifiques à chaque type de cellule, ce qui représente un avantage dans de nombreuses études.

Pour simuler ce qui se produit lors d’un AVC ischémique, les cultures sont soumises à un protocole de privation d’oxygène et de glucose. Ce protocole représente un outil utile pour étudier le rôle des interactions neurone-glia dans les accidents vasculaires cérébraux ischémiques.

Introduction

Selon les données de l’Organisation mondiale de la santé, environ 5,5 millions de personnes meurent chaque année d’un AVC ischémique¹. Cette condition est caractérisée par l’interruption du flux sanguin vers une certaine région du cerveau, résultant en une perte réversible ou irréversible dans l’approvisionnement en oxygène et en nutriments du tissu, qui modifie la fonction tissulaire et conduit à un dysfonctionnement mitochondrial, dysrégulation du calcium, excitotoxicité glutamate, inflammation et perte cellulaire^2,3.

En dehors des cellules vasculaires, les....

Protocole

Tous les animaux utilisés ont été élevés au Centre de recherche en sciences de la santé du CICS-UBI conformément aux exigences éthiques nationales de la recherche sur les animaux et à la Convention européenne pour la protection des animaux vertébrés utilisés à des fins expérimentales et autres à des fins scientifiques (directive 2010/63/UE).

1. Culture cellulaire primaire du cortex embryonnaire de rat

1. Préparation des moyens culturels
   1. Préparer le milieu neurobasal (NBM) en ajoutant les suppléments suivants : 2 % B27, 0,5 mM de glutamine, 25 μM de glutamate et 120 μg/mL gentamicine. Homogénéiser, ajuster le pH à 7,2 et stéri....

Résultats

Pour caractériser les cultures, l’immunocytochimie pour évaluer le nombre de cellules qui ont exprimé GFAP ou MAP2, marqueurs largement utilisés des astrocytes et des neurones (figure 2), a été effectuée dans chaque type de culture corticale. Cette analyse a révélé que les cultures enrichies d’astrocytes présentaient 97 % des cellules exprimant le GFAP (figure 2A). En ce qui concerne la culture enrichie en neurones, 78 % des cellules ont exprimé le MAP2, 4 % des.......

Discussion

La méthode décrite ici consiste en l’isolation des astrocytes et des neurones du tissu cortical embryonnaire du rat, permettant l’établissement de cultures ou de cultures neuronal-glia enrichies par les neurones ou les astrocytes. Il a été adapté d’une étude précédente de notre groupe⁵, où le neurone cortical-glia et l’isolement des cultures embryonnaires neuron-enrichies ont été décrits et les deux cultures caractérisées. En utilisant ces cultures, Roque et coll. ont constaté que les astrocytes j.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plaques de culture à 24 puits	Thermo Fischer Scientific	142475
95 % N2/5 % CO2 bouteille de gaz	ArLí ; quido
Anti-souris conjuguée à Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001	dilution 1/1000 ; période d’incubation - 1 h à température ambiante
Anti-lapin conjugué à Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11010	dilution 1/1000 ; période d’incubation - 1 h à température ambiante
supplément B27 (50x)	Gibco	17504-044
Dako Fluorescence Milieu de montage	Dako	S3023
D-glucose anhydre	Fisher Scientific	G/0450/60	3,4 g/L
Microscope à épifluorescence	Zeiss	AxioObserver Z1x	63x objectif
Sérum fœtal bovin (FBS)	Biochrom	S0615	10 %
Gentamicine	Sigma-Aldrich	G1272	120 µ ; g/mL
de glutamate	Sigma-Aldrich	G8415	25µ ; M
Glutamine	Sigma-Aldrich	G3126	0,5 mM
Hoechst 33342	Invitrogen	H1399	2 & micro ; M; période d’incubation - 10 min à température ambiante
Chambre d’incubation d’hypoxie	Stemcell Technologies	27310	Chambre utilisée pour l’induction d’autres dettes
Insuline du pancréas bovin	Sigma-Aldrich	I5500	5 mg/L
de kétamine	Sigma-Aldrich	K-002	87,5 mg/kg
Essential medium Eagle medium	Sigma-Aldrich	M0268	se réchauffer jusqu’à 37 ° ; C avant utilisation
Souris Anti-MAP2	Santa Cruz Biotechnology	Sc-74421	dilution 1/500 ; période d’incubation pendant la nuit à 4 ° ; C
Neurobasal moyen	Gibco	21103-049	échauffer jusqu’à 37 ° ; C avant l’utilisation
Pastilles de paraffine pour l’histologie	Sigma-Aldrich	1.07164	Point de solidification 56-58° ; C
Paraformaldéhyde	Sigma -Aldrich	P6148	4 % dans la
péniciline/streptomycine	Biochrom	A 2213	pénicilline (12U/mL) /streptomycine (12µ ; g/mL)
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P1024
Lapin Anti-GFAP	DAKO	Z0334	dilution 1/2000 ; période d’incubation pendant la nuit à 4 ° ; C
Hydrogénocarbonate de sodium	Fisher Scientific	S/4240/60	2,2 g/L
Xylazine	Sigma-Aldrich	X1126	12 mg/Kg

Minimum PBS