Les systèmes cellulaires tridimensionnels (3D) sont des modèles pertinents pour étudier l’organogenèse. Une méthode hydrogel-basée pour la production biliaire de kystes et leur caractérisation est proposée. Ce protocole démêle les barrières de la caractérisation 3D, avec une méthode simple et fiable pour évaluer l’efficacité de formation de kyste, tailles, et pour tester leur fonctionnalité.
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Article de méthode
Génération et caractérisation quantitative des kystes épithéliales biliaires fonctionnels et polarisés
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les cholangiocytes, les cellules épithéliales qui alignent les canaux biliaires dans le foie, surveillent la formation et la modification de la bile. Au cours des vingt dernières années, dans le contexte des maladies du foie, des modèles tridimensionnels (3D) basés sur des cholangiocytes ont vu le jour comme des kystes, des sphéroïdes ou des structures tubulaires pour imiter la topologie tissulaire pour l’organogenèse, la modélisation des maladies et les études de dépistage des médicaments. Ces structures ont été principalement obtenues en intégrant des cholangiocytes dans un hydrogel. L’objectif principal était d’étudier l’auto-organisation en abordant la polarité épithéliale, les propriétés fonctionnelles et morphologiques. Cependant, très peu d’études se concentrent sur l’efficacité de formation de kyste. Lorsque c’est le cas, l’efficacité est souvent quantifiée à partir d’images d’un seul plan. Des analyses fonctionnelles et structurales sont exécutées sans représenter l’hétérogénéité potentielle de la distribution de kyste résultant des hétérogénéités et des effets secondaires de polymérisation d’hydrogel. Par conséquent, l’analyse quantitative, lorsqu’elle est effectuée, ne peut pas être utilisée à des fins de comparaison d’un article à l’autre. De plus, cette méthodologie ne permet pas de comparer le potentiel de croissance 3D de différents types de matrices et de cellules. En outre, il n’y a aucune mention du dépannage expérimental pour les kystes immunostaining. Dans cet article, nous fournissons une méthode fiable et universelle pour montrer que la distribution initiale de cellules est liée à la distribution verticale hétérogène de la formation de kyste. Les cellules cholangiocytes intégrées dans l’hydrogel sont suivies d’une analyse des piles Z le long de la profondeur de l’hydrogel pendant 10 jours. Avec cette méthode, une cinétique robuste de l’efficacité et de la croissance de formation de kyste est obtenue. Nous présentons également des méthodes pour évaluer la polarité de kyste et la fonction sécrétaire. Enfin, des conseils supplémentaires pour optimiser les protocoles d’immunostaining sont fournis afin de limiter l’effondrement du kyste pour l’imagerie. Cette approche peut être appliquée à d’autres études de culture cellulaire 3D, ouvrant ainsi la possibilité de comparer un système à un autre.
Introduction
Au cours des trois dernières décennies, le domaine de la recherche in vitro a progressé vers les systèmes de culture 3D. Un certain nombre de protocoles ont émergé pour la culture des cellules en 3D sous forme de sphéroïdes ou d’agrégats en présence ou en l’absence d’un échafaudage/matrice, dans une goutte, dans l’agitation, dans les dispositifs microfluidiques, ou flottant1. L’utilisation de méthodes de culture 3D a prouvé ses avantages par rapport aux cultures bidimensionnelles (2D), en particulier pour les cellules épithéliales, qui se sont auto-organiser dans des structures 3D, appelées kystes ou acini. Dans ce cas, les cellules forment un ....
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Protocole
1. Génération de kystes
REMARQUE : Ce protocole peut être effectué avec n’importe quel type d’hydrogel, si la gelation permet l’intégration des cellules.
- Revêtement Hydrogel
REMARQUE : Le revêtement hydrogel approprié de la glissière de chambre est une étape critique pour éviter la formation des couches de cellules 2D sur le fond du puits, qui pourraient interférer avec la formation image suivante de kyste et altérer le calcul de l’efficacité de formation de kyste.- Pour assurer l’homogénéité de la solution gel, décongeler l’hydrogel à 4 °C pendant la nuit (O/N).
- Pointes de pipette précool sur glace ou O/N à -....
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Résultats
Formation et caractérisation des kystes
Les systèmes de culture cellulaire 3D sont un outil important pour étudier l’organogenèse et la modélisation des maladies25. Malheureusement, la plupart de ces méthodes sont qualitatives ou utilisent la quantification interne effectuée sur un seul plan en comparant le nombre de kystes par rapport aux non-kystes, en volumes variables et souvent non spécifiés, empêchant toute comparaison en termes d’efficacité de formation de kyste entre le.......
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Discussion
Afin d’étudier l’organogenèse et l’entretien des structures cellulaires 3D, divers tissus ont été modélisés, en utilisant différentes origines cellulaires, mais aussi différents types de matrices extracellulaires, y compris les hydrogelssynthétiques 8,9,10,21. Toutefois, en raison de l’absence d’analyse quantitative 3D qui permet des comparaisons entre les méthodes en termes de formation ou de .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions Nicholas LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, États-Unis), qui a gentiment fourni la ligne cellulaire du CNRC.
Ces travaux ont reçu le soutien financier du programme iLite RHU (subvention ANR-16-RHUS-0005) et du DHU Hepatinov.
Nous remercions Isabelle Garcin et le Réseau d’Imagerie Cellulaire Paris Saclay pour leur soutien à l’imagerie.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 10 et micro ; l- Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000020 | |
| 100 µ ; l - Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000046 | |
| 1000 & micro ; l - Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000062 | |
| 1X PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190-094 | |
| 200 & micro ; l - Pipette Eppendorf Research Plus | Thermo Fisher Scientific | 3120000054 | |
| 3,3&prime ;,5-Triiodo-L-thyronine sel sodique | Sigma-Aldrich | T5516 | NRC full medium concentration finale = 3,4 µ ; g/mL |
| Acide acétique | VWR | 20104-298 | 0.02N final |
| Barrière aux aérosols pipettes pointes 10 µ ; l (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707439 | |
| Pointes de pipettes barrière d’aérosol 1000 µ ; l (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707404 | |
| Pointes de pipettes barrière aux aérosols 200 µ ; l (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 2707430 | |
| Solution antibiotique antimicotique (100X) | Sigma-Aldrich | A5955 | NRC milieu complet concentration finale = dilution 1:100 |
| Extrait hypophysaire bovin | Thermo Fisher Scientific | 13028-014 | NRC milieu complet concentration finale = 30 µ ; g/mL |
| Albumine sérique bovine | Sigma-Aldrich | A2153 | Dilution 1:1000 |
| Concentré lipidique chimiquement défini (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11905-031 | NRC full medium concentration finale = dilution 1:100 |
| Collagen haute concentration, queue de rat | Thermo Fisher Scientific | 354249 | 50 µ ; g/mL concentration finale |
| Dexaméthasone | Sigma-Aldrich | D4902 | NRC concentration finale moyenne complète = 0,393 & micro ; g/mL |
| DMEM F12 | Thermo Fisher Scientific | 21331-020 | NRC full medium concentration finale = 1X |
| E-cadhérine Rabbit anti-Human, Rat, Polyclonal | Thermo Fisher Scientific | PA5-32178 | Dilution 1:400 |
| TE300 microscope inversé | Nikon imaging | ||
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | NRC complete medium final concentration = 0,32 mM |
| Sérum de veau fœtal | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | Milieu complet NRC Concentration finale = dilution 5:100 |
| Fluoroshield avec DAPI (milieu de montage) | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Formaldéhyde 16 % (P/V) | Thermo Fisher Scientific | 28906 | 4 % (P/V) |
| Sérum de chèvre | Thermo Fisher Scientific | 16210-064 | 1:10 dilution |
| Caméra Hamamatsu (Appareil photo numérique C11440 ORCA - flash 4.OLT) | Imagerie Hamamatsu | ||
| Hoechst 33258 | Sigma-Aldrich | B1155 | 5 µ ; g/mL concentration finale |
| IgG (H+L) Chèvre hautement adsorbée croisée anti-lapin, Alexa Fluor Plus 647 | Thermo Fisher Scientific | A32733 | dilution 1:500 |
| ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52n | Logiciel de traitement d’images open source | ||
| Insulin-Transferrin-Selenium (100X) | Thermo Fisher Scientific | 51300-044 | NRC full medium concentration finale = dilution |
| 1:100L-Glutamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | Concentration finale du milieu complet NRC = dilution 1:100 |
| Matrigel GFR (concentration de base 9,7 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | 356231 | dilution 4:10 |
| Logiciel NIS Elements version 4.50.00 | Acquisition et affichage d’images | Nikon | |
| Solution d’acides aminés non essentiels (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | NRC full medium concentration finale = dilution 1:100 |
| Plan objectif Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (&infin ;/1.2 WD 15.2) | Réactif | ||
| Prolong Gold | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Iodure de propidium (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | 20 µ ; g/mL concentration finale |
| Rhodamine Phalloïdine | Thermo Fisher Scientific | R415 | 16,2 nM concentration finale |
| Sir-Actin / Verapamil kit | Spirochrome | SC001 | 10 µ ; M concentration finale |
| Inhibiteur de la trypsine de soja | Thermo Fisher Scientific | 17075-029 | NRC complet moyenne concentration finale = 50 & micro ; g/mL |
| Passoire à cellules stériles 40 & micro ; m (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| Pipettes stériles 10 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811E | |
| Pipettes stériles 5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 1367811D | |
| Tubes stériles 1,5 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 11926955 | |
| Tubes stériles 15 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 7200886 | |
| Tubes stériles 50 mL (Fisherbrand) | Thermo Fisher Scientific | 553913 | |
| Saccharose | Sigma-Aldrich | S0389 | Dilution 5:100 |
| Fiole traitée pour culture tissulaire 25cm2 (Falcon) | Thermo Fisher Scientific | 353108 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 5:1000 dilution |
| Trypsine-EDTA (0,05 %) rouge de phénol | Thermo Fisher Scientific | 25300-054 | 1X |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | dilution 5:10000 |
| Vitamine (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11120-037 | NRC full medium concentration finale = dilution 1:100 |
| &mu ;-Slide 8 Well ibiTreat, Ibidi | Clinisciences | 80826 |
Références
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, F., Yang, L. Three-Dimensional Cell Culture Systems and Their Applications in Drug Discovery and Cell-Based Biosensors. ASSAY and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Martín-Belmonte, F., et al.
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Réimpressions et autorisations
