Method Article

Génération et caractérisation quantitative des kystes épithéliales biliaires fonctionnels et polarisés

DOI:

10.3791/61404

⸱

May 16th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Physiopathogénèse et traitement des maladies du foie, Université Paris-Saclay, Inserm U1193, 2ESPCI Paris, Université PSL

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les systèmes cellulaires tridimensionnels (3D) sont des modèles pertinents pour étudier l’organogenèse. Une méthode hydrogel-basée pour la production biliaire de kystes et leur caractérisation est proposée. Ce protocole démêle les barrières de la caractérisation 3D, avec une méthode simple et fiable pour évaluer l’efficacité de formation de kyste, tailles, et pour tester leur fonctionnalité.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cholangiocytes, les cellules épithéliales qui alignent les canaux biliaires dans le foie, surveillent la formation et la modification de la bile. Au cours des vingt dernières années, dans le contexte des maladies du foie, des modèles tridimensionnels (3D) basés sur des cholangiocytes ont vu le jour comme des kystes, des sphéroïdes ou des structures tubulaires pour imiter la topologie tissulaire pour l’organogenèse, la modélisation des maladies et les études de dépistage des médicaments. Ces structures ont été principalement obtenues en intégrant des cholangiocytes dans un hydrogel. L’objectif principal était d’étudier l’auto-organisation en abordant la polarité épithéliale, les propriétés fonctionnelles et morphologiques. Cependant, très peu d’études se concentrent sur l’efficacité de formation de kyste. Lorsque c’est le cas, l’efficacité est souvent quantifiée à partir d’images d’un seul plan. Des analyses fonctionnelles et structurales sont exécutées sans représenter l’hétérogénéité potentielle de la distribution de kyste résultant des hétérogénéités et des effets secondaires de polymérisation d’hydrogel. Par conséquent, l’analyse quantitative, lorsqu’elle est effectuée, ne peut pas être utilisée à des fins de comparaison d’un article à l’autre. De plus, cette méthodologie ne permet pas de comparer le potentiel de croissance 3D de différents types de matrices et de cellules. En outre, il n’y a aucune mention du dépannage expérimental pour les kystes immunostaining. Dans cet article, nous fournissons une méthode fiable et universelle pour montrer que la distribution initiale de cellules est liée à la distribution verticale hétérogène de la formation de kyste. Les cellules cholangiocytes intégrées dans l’hydrogel sont suivies d’une analyse des piles Z le long de la profondeur de l’hydrogel pendant 10 jours. Avec cette méthode, une cinétique robuste de l’efficacité et de la croissance de formation de kyste est obtenue. Nous présentons également des méthodes pour évaluer la polarité de kyste et la fonction sécrétaire. Enfin, des conseils supplémentaires pour optimiser les protocoles d’immunostaining sont fournis afin de limiter l’effondrement du kyste pour l’imagerie. Cette approche peut être appliquée à d’autres études de culture cellulaire 3D, ouvrant ainsi la possibilité de comparer un système à un autre.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Au cours des trois dernières décennies, le domaine de la recherche in vitro a progressé vers les systèmes de culture 3D. Un certain nombre de protocoles ont émergé pour la culture des cellules en 3D sous forme de sphéroïdes ou d’agrégats en présence ou en l’absence d’un échafaudage/matrice, dans une goutte, dans l’agitation, dans les dispositifs microfluidiques, ou flottant1. L’utilisation de méthodes de culture 3D a prouvé ses avantages par rapport aux cultures bidimensionnelles (2D), en particulier pour les cellules épithéliales, qui se sont auto-organiser dans des structures 3D, appelées kystes ou acini. Dans ce cas, les cellules forment un monomouche encerclant un lumen, où les cellules acquièrent leur phénotype épithélial complet avec des fonctions physiologiques spécifiquesaméliorées 2.

De nombreuses études ont contribué au développement de méthodes de formation de ces organoïdes épithéliales chez les matrices naturelles. Cela a permis de récapituler les interactions cellules-cellules in vivo et microenvironnement cellulaire, pour obtenir l’établissement et la stabilité du phénotype épithélial3,4,5,6,7. Récemment, et en particulier dans le but de développer des organoïdes transplantables et de déchiffrer l’exigence du microenvironnement pour orchestrer le programme épithélial, des hydrogels synthétiques ont été développés pour améliorer la formation d’acini épithéliales8,9,10. Malheureusement, ces études font état de données qualitatives, ou présentent des méthodes de calcul utilisant des références internes telles que le rapport des kystes sur les non-kystes dans un plan 2D8,9,10. Cela exclut toute comparaison entre différentes études en termes d’efficacité, de stabilité ou de caractérisation morphologique et physiologique des organoïdes épithéliales.

La microencapsulation des cellules épithéliales dans les perles à l’aide de dispositifs microfluidiques a permis des résultats quantitatifs et comparatifs plus réalistes. En utilisant cette technologie, des organoïdes de divers types de cellules ont été formés et différenciés en fonction de la morphologie entre les différentes structures cellulaires 3D11,12. Cependant, cette technologie n’est pas facile à utiliser et nécessite l’utilisation de salles propres pour produire les appareils microfluidiques. Cette technologie a été établie pour quelques types d’hydrogels, mais nécessite une adaptation technique pour être appliquée à d’autres hydrogels, limitant sa polyvalence. Par conséquent, la plupart des études destinées à développer des organoïdes épithéliales reposent sur l’intégration de cellules épithéliales dans un bloc hydrogel. Dans ces méthodes, l’hétérogénéité élevée de la structuration du gel et de la distribution cellulaire à l’intérieur de toute la culture 3D est souvent négligée. Par conséquent, la plupart des analyses se rapportent à des images 2D uniques, qui ne représentent que très grossièrement la distribution des différents objets cellulaires dans l’ensemble du volume 3D.

Les maladies qui affectent les canaux biliaires, tels que le cholangiocarcinome, l’atrésie biliaire, la cholangite sclérosante primaire, entre autres, sont une cause majeure de mortalité et de morbidité. Excepté la transplantation de foie, il n’y a aucun traitement efficace pour ces conditions13. Les efforts pour étudier la formation de canaux biliaires, les causes de la maladie et la progression permettront le développement de nouvellesthérapies 14.

Des modèles organotypiques biliaires de kystes, de sphéroïdes ou de structures tubulaires utilisant des lignées cellulaires cholangiocytes normales ou dérivées du patient, différenciées ou dérivées d’un ancêtre ontété développées 15,16,17,18,19,20. Diverses études ont récapitulé la polarité cholangiocyte, l’expression des marqueurs cholangiocytes, la présence de cils, la sécrétion cholangiocyte et la capacité réabsorptive, et la formation et l’obstruction de lumen ; qui représentent tous des caractéristiques importantes du phénotype cholangiocyte, de la morphologie et de lafonction 15,17,19. D’autres ont rapporté le maintien des organoïdes biliaires patients-dérivés pendant de longues périodesde temps 20. Récemment, nous avons étudié le rôle des indices biochimiques et biophysiques sur les kystes biliaires organogenèse21. Fait important, la pathogénie de l’atrésie biliaire a été étudiée dans les sphéroïdes biliaires et les tubes7,22. En outre, les dispositifs principaux de cholangitis sclérosé primaire tels que la sénescence de cholangiocyte, la sécrétion des cytokines pro-inflammatoires, aussi bien que le recrutement de macrophage ont été avec succès étudiés utilisant des sphéroïdes biliaires15,20. Cependant, des modèles quantitatifs 3D in vitro reproductibles qui modulent physiologiquement le phénotype, la physiologie et le microenvironnement cholangiocytes où ces questions peuvent être abordées sont encore nécessaires. En outre, seulement peu de publications ont rapporté l’efficacité de formationde kyste 21,23. C’est un point important à établir, particulièrement en étudiant l’organogenèse, la cause de la maladie, et la corrélation des réponses de drogue avec la fonction et la polarisation de cholangiocyte. En outre, avec les différences dans l’échafaudage / matrice utilisée d’un protocole à l’autre, il est difficile de comparer entre les systèmes. Pour résoudre ces issues, nous proposons une méthode quantitative, fiable, et universelle pour produire des kystes biliaires imitant la formation de lumen, la polarisation de cholangiocyte, et la fonction sécréoire de cholangiocyte. Fait important, nous présentons une analyse systématique effectuée le long de l’axe Z à travers le gel 3D lors de l’évaluation au fil du temps, l’efficacité de la formation de kystes, la taille, la viabilité, la polarisation et la fonctionnalité. De plus, nous avons utilisé un hydrogel naturel et des cholangiocytes normaux de rat (CNRC), comme exemple pour le protocole, mais d’autres hydrogels naturels ou synthétiques, ainsi que des cellules épithéliales pourraient être utilisés pour la formation de structures cystiques 3D.

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Protocol

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1. Génération de kystes

REMARQUE : Ce protocole peut être effectué avec n’importe quel type d’hydrogel, si la gelation permet l’intégration des cellules.

  1. Revêtement Hydrogel
    REMARQUE : Le revêtement hydrogel approprié de la glissière de chambre est une étape critique pour éviter la formation des couches de cellules 2D sur le fond du puits, qui pourraient interférer avec la formation image suivante de kyste et altérer le calcul de l’efficacité de formation de kyste.
    1. Pour assurer l’homogénéité de la solution gel, décongeler l’hydrogel à 4 °C pendant la nuit (O/N).
    2. Pointes de pipette précool sur glace ou O/N à -20 °C et une glissade de chambre de 8 puits à -20 °C O/N.
    3. Placez l’hydrogel et la glissière de chambre de 8 puits sur un seau à glace rempli de glace.
    4. Dans un tube conique de 15 mL, préparer une solution contenant 40 % d’hydrogel (V/V) dans un milieu complet froid du CNRC (voir tableau des matériaux)et placer le tube sur la glace.
    5. Pour enrober une glissière de chambre, à l’aide de pointes de pipette froides, ajouter 50 μL de solution hydrogel au centre de chaque puits et répartir sur toute la surface à l’aide d’une pointe de pipette, tout en tenant la chambre glisser sur la glace (figure 1A).
      REMARQUE : Étendre la solution hydrogel aussi uniformément que possible en évitant les bulles.
    6. Pour polymériser l’hydrogel, incuber la glissière de chambre pendant au moins 15 min à 37 °C, 5 % de CO2.
  2. Préparation cellulaire
    1. Réchauffer le milieu complet du CNRC, la solution saline tamponnée de phosphate (PBS) et l’acide tétracétique trypsine-éthylènediamine (trypsine-EDTA) dans un bain d’eau préchauffé à 37 °C.
    2. Pendant que l’hydrogel polymérise, assurez-vous que les CRN sont cultivés à 70 % de confluence dans un flacon recouvert de collagèneT-25 cm 221. Lavez les cellules une fois avec 1x PBS préchauffé.
    3. Incuber les CRN avec 5 mL de 1x PBS préchauffé (pour un flacon T-25 cm2) pendant 20 min à 37 °C, 5 % de CO2.
      REMARQUE : Cette étape, qui raccourcit le temps d’incubation avec la trypsine-EDTA, joue un rôle déterminant dans le maintien des propriétés auto-organisatrices des cellules.
    4. Jeter le PBS, ajouter 1 mL de trypsine-EDTA, et incuber pendant 5-10 min à 37 °C, 5% DE CO2.
    5. Neutraliser avec 4 mL de milieu complet préchauffé du CNRC. Recueillir et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL, et tourner à 150 x g pendant 4 min.
    6. Jeter le milieu et résuser la pastille cellulaire dans 5 mL de milieu préchauffé.
    7. À l’aide d’une passoire cellulaire de 40 μm, filtrez la solution cellulaire dans un tube conique de 50 mL et comptez les cellules.
      REMARQUE : Le passage des cellules à travers une passoire est une étape cruciale pour que les résultats quantitatifs soient reproductibles, c’est-à-dire qu’ils obtiennent une taille presque similaire d’agrégats cellulaires à intégrer.
  3. Intégration de la suspension cellulaire dans la solution hydrogel
    1. Préparer une solution de 1 600 μL d’hydrogel à 80 % (V/V) dans un milieu complet à froid du CNRC (tube 1); garder dans la glace. Diluer 5 x 105 cellules/mL dans 1 600 μL de milieu complet froid du CNRC (tube 2) et conserver dans la glace.
      REMARQUE : Cette étape doit être effectuée rapidement pour éviter la polymérisation de l’hydrogel tout en le mélangeant avec la suspension cellulaire et pour maintenir la viabilité cellulaire.
    2. Pour préparer une solution d’ensemencement cellulaire de 2,5 x10 5 cellules/mL en hydrogel à 40 % (V/V), mélanger le tube 1 et le tube 2. Ajouter 400 μL de la solution cellulaire dans chaque puits de la glissière de chambre recouverte d’hydrogel en évitant les bulles (figure 1B).
    3. Gardez la chambre glisser dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO2 jusqu’à ce que les médias changent.
    4. Après 2 jours de culture, retirer 250 μL du milieu d’un coin de chaque puits, faire attention à ne pas pipette sur l’hydrogel. Ensuite, ajouter lentement 250 μL du milieu de culture. Changez le milieu tous les 2 jours.
      REMARQUE : Réduisez au minimum le mouvement de la glissière de chambre, particulièrement pendant l’initiation de kyste.

2. Quantification de kyste

  1. Imagerie kyste
    REMARQUE : Cette section doit être effectuée rapidement pour ne pas compromettre la viabilité de la cellule si le microscope n’est pas équipé d’une chambre chauffante pour contrôler le CO2 et la température. Afin d’assurer une quantification cohérente, représentative de la distribution du kyste dans le volume hydrogel complet, les kystes sont photographiés par microscopie à contraste de phase et imagerie sérielle (piles Z), avec des paramètres prédéfinis à travers différents points de temps.
    1. Prenez une pile Z le long de la profondeur de l’hydrogel pour chaque point de temps( Figure 1C, D). Dans cet exemple, les piles Z sont prises aux jours 1, 2, 4, 7 et 10.
      REMARQUE : Vérifiez que la distribution initiale des cellules est uniforme dans l’hydrogel pour assurer l’applicabilité de cette méthode.
      1. À l’aide d’un microscope à contraste de phase équipé d’un logiciel d’acquisition d’images, sélectionnez le grossissement objectif 10x de la fenêtre manuelle du bloc-nez(figure 2B(1).
      2. Allumez la lampe blanche et sélectionnez l’option d’imagerie brightfield.
      3. Allumez la caméra en sélectionnant le bouton "Lire" dans le sous-menu de la barre. Concentrez-vous sur un champ de kystes et définissez le tempsd’exposition ( Figure 2B (2)). Ouvrez la fenêtre Dossier de capture automatique pour une sauvegarde automatique d’images ( Figure2B (3)).
      4. Ouvrez la fenêtre de capture série Z et définissez avec la vis Z les plans supérieur et inférieur de la pile Z (mêmes coordonnées XY mais z différents filtrés). Ajustez l’étape Z en fonction de l’objectif, du niveau de résolution et appuyez sur le bouton "Exécuter maintenant" pour lancer l’acquisition (Figure 2B(4)).
        REMARQUE : Dans cet exemple, les kystes sont répartis sur une épaisseur d’hydrogel de 520 μm. 26 images sont acquises le long de la profondeur d’hydrogel avec un intervalle de 20 μm Z-step. Selon l’objectif, l’étape Z doit être ajustée pour ne manquer aucun kyste et pour assurer la détection de cellules et d’agrégats simples.
      5. Prenez au moins 3 piles Z qui ne se chevauchent pas par puits.
        REMARQUE : Cet échantillonnage est nécessaire lorsque, comme dans cet exemple, les kystes sont plus nombreux dans la profondeur du gel que sur les bords en raison des hétérogénéités de la polymérisation hydrogel.
      6. Afin d’avoir un ensemble de données représentatif répéter l’étape 2.1.1.5. pour 3 puits au total.
        NOTE : La distribution hétérogène des kystes dépend du type d’hydrogel, de sa polymérisation, et de la ligne cellulaire. Considérant trois Z-stacks par puits et trois puits par expérience, un minimum de 200 kystes sont imaged au-dessus de neuf Z-piles pour caractériser la formation de kyste et la croissance de kyste à chaque point de temps.
  2. Traitement d’image
    REMARQUE : Dans un hydrogel, les CRN peuvent être trouvés sous forme de cellules individuelles, de kystes ou d’agrégats. Les kystes sont identifiés par la présence d’une coquille cellulaire contrastée ronde et mince enfermant un lumen, tandis que les agrégats cellulaires présentent une forme irrégulière et n’ont pas de lumen. Les agrégats et les cellules individuelles ont un aspect dense et contrasté( figure 3B(4)).
    1. Ouvrez le logiciel Fidji, ouvrez la pile Z et allez au menu Fidji et cliquez sur Fichier | Ouvert (Figuresupplémentaire 1). Sélectionnez la pile Z à analyser. Si nécessaire, sélectionnezl’option" Virtual Stack " et cliquez sur "Oui" pour l’ouverture (Figure 3A (1)).
    2. Dupliquer la pile via l’image | Dupliquer. Cliquez sur la case "Duplicate stack" et cliquez sur "OK"(Figure supplémentaire 2).
      REMARQUE : Dans cet exemple, les piles Z sont en format de fichier .nd2 codés en 16 bits.
    3. Créez une projection d’intensité minimale à partir de la pile dupliquée. Aller au menu Image | Piles | Projet Z. Sélectionnez le typede projection" Min Intensity " et cliquez sur "OK" (Figure 3A (2)) (Figure supplémentaire 3).
    4. Soustrayez l’arrière-plan de la projection. Allez au menu Process | Soustrayez l’arrière-plan. Tapez 500,0 pixels de rayon de boule roulante et cliquez sur "fond lumineux" pour rendre les kystes plus contrastés que l’arrière-plan (Figure 3A(3)) (Figure supplémentaire 4).
      REMARQUE : Le rayon de roulement définit la taille de la région sur laquelle la soustraction de fond est exploitée. Ce paramètre doit être défini en taille du plus grand objet à identifier.
    5. Si une amélioration du contraste est nécessaire, rendez-vous au menu Image | Ajuster | Luminosité/Contraste | Auto | Appliquer. Fidji optimisera automatiquement la luminosité et le contraste. Dans (Figure 3A(3)), les valeurs grises inférieures et supérieures ont été fixées à 49702 et 65452, respectivement (Figure supplémentaire 5).
      REMARQUE : Si la projection n’est pas calibrée, rendez-vous au menu Analyser | Définissez l’échelle et tapez le rapport d’étalonnage correspondant μm/pixel(figure supplémentaire 6).
  3. Comptage des kystes et mesures de la taille des kystes
    1. Pour mesurer le diamètre approximatif du kyste, sélectionnez l’outil straight-line dans le menu Fidji et tracez une ligne sur le diamètre de chaque kyste sur la projection finale (Figure 3B(4)). Ajoutez la nouvelle région d’intérêt (ROI) créée pour chaque kyste au gestionnaire de roi : appuyez sur le raccourci «t» sur le clavier pour un comptage et une ouverture plus rapides du gestionnaire roi. Cliquez sur "Afficher tous" pour voir les kystes comptés ( Figuresupplémentaire 7)
    2. Vérifiez qu’aucun kyste n’a été laissé sans compter en superposant l’ensemble rom de la projection sur la pile Z. Pour ce faire, cliquez sur la fenêtre Z-stack pour la sélectionner. Dans le gestionnaire roi, cliquez sur "Afficher tous" et déplacer le curseur le long de la pile Z pour vérifier que l’image par image, tous les kystes ont été comptés (Figure supplémentaire 8).
    3. Une fois que de nouveaux kystes ont été comptés et que les IA ont été ajoutés à l’étape 2.3.1., sélectionnez l’ensemble roi et enregistrez-le via la fenêtre Roi Manager en cliquant sur Plus | Enregistrer (Figure supplémentaire 9).
    4. Sélectionnez toutes les IA dans le gestionnaire de retour sur investissement etcliquez sur" Mesurer " dans le gestionnaire de retour sur investissement pour obtenir la taille de chaque kyste. Cela ouvrira une nouvelle fenêtre de mesures nommées " Résultats "numérotantchaque kyste et sa taille estimée. Puis enregistrez en .csv format en cliquant sur la fenêtre "Résultats" et via le menu: Fichier | Enregistrer comme (Figure supplémentaire 10).
      REMARQUE : Une macro peut être créée pour traiter semi-automatiquement les piles, estimer le nombre/taille des kystes à partir des projections et stocker les données pour une procédure de comptage plus rapide. Pour ce faire, sélectionnez l’outil "Enregistrer" dans le menu du bar, en cliquant sur Plugins | Macros - France | Enregistrement.
  4. Quantification de l’efficacité de la formation de kystes
    1. Comptez le nombre de kystes au jour Y, figure-protocol-1 sur une projection (Y=1, 2, 4, 7 ou 10).
    2. Pour calculer l’efficacité de formation de kyste pour 1000 cellules au jour Y, divisez le nombre de kystes comptés à ce moment-là par le nombre de cellules ensemencées au jour 0 déduites du volume d’hydrogel et multiplient par 1000 (figure 3C, figure 4).
      figure-protocol-2

3. Viabilité cellulaire

  1. Préparer une solution de stock de diacétate de fluorescéine (FDA) à 5 mg/mL en dissolvant 5 mg de FDA en acétone de 1 mL et conserver à -20 °C.
  2. Préparer une solution de stock d’iodure de propidium (IP) à une concentration de 2 mg/mL dans de l’eau déionisée (dH2O) et conserver à 4 °C.
  3. Préparer le milieu du CNRC sans sérum fœtal de veau (SFC).
  4. Pour préparer la solution de coloration FDA/PI, ajouter 4 μL de solution de stock fda (concentration finale de 8 μg/mL) et 25 μL de solution de stock PI (concentration finale de 20 μg/mL) en 2,5 mL de milieu du CNRC sans SFC.
  5. Retirer le milieu de la glissière de chambre, ajouter 250 μL de solution de coloration dans chaque puits et incuber 4-5 min dans l’obscurité à 37 °C, 5 % de CO2. Pipette la solution de coloration soigneusement et laver une fois avec 250 μL de 1x PBS.
  6. Ajouter soigneusement 250 μL de milieu complet du CNRC à chaque puits et prendre des photos à l’aide d’un microscope à fluorescence inversé avec des filtres à isothiocyanate rouge et fluorescéine du Texas (FITC). Les cellules vivantes seront vertes et les cellules mortes seront rouges (figure 5A).
    REMARQUE : Afin de quantifier les cellules vivantes/mortes, prenez des piles Z à travers le volume d’hydrogel suivant l’étape 2 et adaptez la méthode de traitement de l’image pour la fluorescence.

4. Activité de sécrétion

NOTE : L’activité de sécrétion par la membrane apical des cholangiocytes est évaluée par la sécrétion de fluorescéine dans le lumen. Sa spécificité peut être évaluée en faisant le même test avec Verapamil, un inhibiteur multirésistant (MDR) transporteur24.

  1. Pour préparer une solution de coloration de Hoechst 33258 à 5 μg/mL, ajouter 0,83 μL de solution de stock Hoechst (concentration de 15 mg/mL en dH2O) dans 2,5 mL de milieu du CNRC sans SFC.
  2. Ajouter 250 μL de solution Hoechst dans chaque puits et incuber à 37 °C, 5 % de CO2 pendant 15 min.
  3. Retirez la solution Hoechst et ajoutez 250 μL de solution FDA (concentration finale de 8 μg/mL) dans chaque puits. Incuber 4-5 min à 37 °C, 5 % de CO2.
    REMARQUE : Dès que les cellules sont exposées à la solution de coloration de FDA, le suivi de la cinétique de sécrétion de fluorescéine pourrait être utile pour calibrer le temps nécessaire pour que les kystes sécrètent. Pour ce faire, prenez des photos toutes les minutes pendant 1 h par imagerie time-lapse. Dans cet exemple, le temps nécessaire pour observer le CNRC sécrétant des kystes dans l’hydrogel est d’environ 15-20 min.
  4. Prenez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence inversé 5 min après le rinçage avec un milieu sans FCS. Utilisez des filtres 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) et FITC pour révéler l’étiquetage des noyaux et l’accumulation de fluorescéine dans le lumen (Figure 6A). Pour quantifier le nombre de kystes sécrétants, prenez z-stacks comme dans l’étape 2 et adapter les étapes de traitement d’image aux images fluorescentes.
    REMARQUE : Pour le test de Verapamil, précèdez le processus précédent (étapes 4.3. à 4.4.) par une incubation avec Verapamil, selon les conditions suivantes :
  5. Préparer une solution de stock de 10 mM verapamil en sulfure de diméthyle (DMSO). Pour préparer une solution de travail de 10 μM, mélangez 2,5 μL de solution de stock Verapamil avec un support de culture de 2,5 mL sans FCS.
  6. Pour évaluer que la fluorescence du lumen résulte de la sécrétion de MDR, prenez une autre diapositive et ajoutez 250 μL de solution de travail Verapamil dans chaque puits et incuber 20 min à 37° C, 5% de CO2
  7. Retirez la solution et ajoutez 250 μL de solution FDA (concentration finale de 8 μg/mL) dans chaque puits. Incuber 4-5 min dans l’obscurité à 37 °C, 5% de CO2. Ensuite, lavez-le avec 250 μL de 1x PBS, avant l’imagerie (Figure 6B, C).

5. Évaluation de la polarité épithéliale par immunofluorescence

  1. Pour préparer la solution de fixation, mélanger 4% de formaldéhyde avec 5% de saccharose, en 1x PBS, pH 7,4 et incuber dans un bain d’eau préchauffé à 37 °C.
  2. Pour fixer les cellules, pipette doucement le milieu de culture du puits sans endommager la matrice. Ajouter lentement 400 μL de la solution de fixation sur le côté des puits. Incuber pendant 20 min à température ambiante (RT).
    REMARQUE : Laissez toujours 25 μL du liquide au-dessus de la matrice pour éviter ses dommages.
  3. Retirez délicatement la solution de fixation et lavez-la 3x avec 400 μL de 1x PBS à (RT).
  4. Pipette sur le PBS, ajouter 400 μL de solution de perméabilisation (0,5% Triton X-100 en 1x PBS) et incuber 10 min à RT.
  5. Retirez doucement la solution de perméabilisation, suivie de 3 lavages rapides avec 400 μL de 1x PBS et d’une longue étape de lavage de 30 min à RT.
    REMARQUE : À cette étape, la diapositive peut être stockée à 4 °C pendant 2 jours. Dans ce cas, sceller la diapositive avec un film de paraffine pour éviter l’évaporation et le séchage matricielle.
  6. Retirer le PBS, ajouter 400 μL de solution de blocage contenant 0,1% d’albumine de sérum bovin (BSA) et 10% de sérum de chèvre en 1x PBS et incuber pendant 60 min à RT.
    MISE EN GARDE : Les concentrations de BSA supérieures à 0,1 % entraîneront la rétractation du lumen et l’effondrement d’un kyste supplémentaire (voir la section Résultats représentatifs) (Figure 7A).
  7. Pipette la solution de blocage et laver une fois avec 400 μL de PBS/0,05% Tween 20 et jeter.
  8. Ajouter 150 μL de la solution anticorps, par exemple, l’anticorps e-cadhérine dilué 1:400 et la Phalloidine 568 (concentration finale de 16,2 nM) en 1x PBS et incuber pendant 90 min à RT.
    REMARQUE : Cette dilution de l’E-cadhérine est la même que dans un protocole standard d’immunofluorescence 2D.
  9. Laver l’échantillon avec 400 μL de PBS/0,05% Tween 20, 3x; chaque fois l’incubation de l’échantillon pendant 10 min à RT.
  10. Ajouter 150 μL de l’anticorps secondaire (chèvre anti-lapin IgG Alexa Fluor Plus 647), dilué 1:500 en 1x PBS et incuber 60 min à RT.
  11. Laver 3x avec 400 μL de PBS/0,05% de tween 20, chaque fois qu’il incube l’échantillon pendant 10 min à RT.
  12. Laver 3x avec 400 μL de 1x PBS, chaque fois l’incubation de l’échantillon pendant 10 min à RT.
  13. Jetez le PBS du dernier lavage et préparez la diapositive de chambre pour la visualisation par microscopie confoccale suivant l’une des deux options ci-dessous.
    1. Ajouter 400 μL de 1 x PBS et 50 μL de DAPI par puits. Les échantillons peuvent être examinés par le fond du puits sans avoir besoin de monter avec un coverslip (Figure 7B).
    2. Ajouter 100 μL par puits de réageni d’antifade contenant du DAPI et laisser sécher la glissière O/N à RT.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formation et caractérisation des kystes
Les systèmes de culture cellulaire 3D sont un outil important pour étudier l’organogenèse et la modélisation des maladies25. Malheureusement, la plupart de ces méthodes sont qualitatives ou utilisent la quantification interne effectuée sur un seul plan en comparant le nombre de kystes par rapport aux non-kystes, en volumes variables et souvent non spécifiés, empêchant toute comparaison en termes d’efficacité de formation de kyste entre le...

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Discussion

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Afin d’étudier l’organogenèse et l’entretien des structures cellulaires 3D, divers tissus ont été modélisés, en utilisant différentes origines cellulaires, mais aussi différents types de matrices extracellulaires, y compris les hydrogelssynthétiques 8,9,10,21. Toutefois, en raison de l’absence d’analyse quantitative 3D qui permet des comparaisons entre les méthodes en termes de formation ou de ...

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

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Nous remercions Nicholas LaRusso (Mayo Clinic, Rochester, Minnesota, États-Unis), qui a gentiment fourni la ligne cellulaire du CNRC.

Ces travaux ont reçu le soutien financier du programme iLite RHU (subvention ANR-16-RHUS-0005) et du DHU Hepatinov.

Nous remercions Isabelle Garcin et le Réseau d’Imagerie Cellulaire Paris Saclay pour leur soutien à l’imagerie.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 et micro ; l- Pipette Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000020
100 µ ; l - Pipette Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000046
1000 & micro ; l - Pipette Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000062
1X PBSThermo Fisher Scientific14190-094
200 & micro ; l - Pipette Eppendorf Research PlusThermo Fisher Scientific3120000054
3,3&prime ;,5-Triiodo-L-thyronine sel sodiqueSigma-AldrichT5516NRC full medium concentration finale = 3,4 µ ; g/mL
Acide acétiqueVWR20104-2980.02N final
Barrière aux aérosols pipettes pointes 10 µ ; l (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific2707439
Pointes de pipettes barrière d’aérosol 1000 µ ; l (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific2707404
Pointes de pipettes barrière aux aérosols 200 µ ; l (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific2707430
Solution antibiotique antimicotique (100X)Sigma-AldrichA5955NRC milieu complet concentration finale = dilution 1:100
Extrait hypophysaire bovinThermo Fisher Scientific13028-014NRC milieu complet concentration finale = 30 µ ; g/mL
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA2153Dilution 1:1000
Concentré lipidique chimiquement défini (100X)Thermo Fisher Scientific11905-031NRC full medium concentration finale = dilution 1:100
Collagen haute concentration, queue de ratThermo Fisher Scientific35424950 µ ; g/mL concentration finale
DexaméthasoneSigma-AldrichD4902NRC concentration finale moyenne complète = 0,393 & micro ; g/mL
DMEM F12Thermo Fisher Scientific21331-020NRC full medium concentration finale = 1X
E-cadhérine Rabbit anti-Human, Rat, PolyclonalThermo Fisher ScientificPA5-32178Dilution 1:400
TE300 microscope inverséNikon imaging
EthanolamineSigma-AldrichE9508NRC complete medium final concentration = 0,32 mM
Sérum de veau fœtalThermo Fisher Scientific10270-106Milieu complet NRC Concentration finale = dilution 5:100
Fluoroshield avec DAPI (milieu de montage)Sigma-AldrichF6057
Formaldéhyde 16 % (P/V)Thermo Fisher Scientific289064 % (P/V)
Sérum de chèvreThermo Fisher Scientific16210-0641:10 dilution
Caméra Hamamatsu (Appareil photo numérique C11440 ORCA - flash 4.OLT)Imagerie Hamamatsu
Hoechst 33258Sigma-AldrichB11555 µ ; g/mL concentration finale
IgG (H+L) Chèvre hautement adsorbée croisée anti-lapin, Alexa Fluor Plus 647Thermo Fisher ScientificA32733dilution 1:500
ImageJ version 2.0.0-rc-69/1.52nLogiciel de traitement d’images open source
Insulin-Transferrin-Selenium (100X)Thermo Fisher Scientific51300-044NRC full medium concentration finale = dilution
1:100L-Glutamine (100X)Thermo Fisher Scientific25030-024Concentration finale du milieu complet NRC = dilution 1:100
Matrigel GFR (concentration de base 9,7 mg/mL)Thermo Fisher Scientific356231dilution 4:10
Logiciel NIS Elements version 4.50.00Acquisition et affichage d’imagesNikon
Solution d’acides aminés non essentiels (100X)Thermo Fisher Scientific11140-035NRC full medium concentration finale = dilution 1:100
Plan objectif Fluor 10X/0.30 Ph1 DL (&infin ;/1.2 WD 15.2)Réactif
Prolong GoldThermo Fisher ScientificP36931
Iodure de propidium (PI)Sigma-AldrichP417020 µ ; g/mL concentration finale
Rhodamine PhalloïdineThermo Fisher ScientificR41516,2 nM concentration finale
Sir-Actin / Verapamil kitSpirochromeSC00110 µ ; M concentration finale
Inhibiteur de la trypsine de sojaThermo Fisher Scientific17075-029NRC complet moyenne concentration finale = 50 & micro ; g/mL
Passoire à cellules stériles 40 & micro ; m (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific22363547
Pipettes stériles 10 mL (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific1367811E
Pipettes stériles 5 mL (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific1367811D
Tubes stériles 1,5 mL (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific11926955
Tubes stériles 15 mL (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific7200886
Tubes stériles 50 mL (Fisherbrand)Thermo Fisher Scientific553913
SaccharoseSigma-AldrichS0389Dilution 5:100
Fiole traitée pour culture tissulaire 25cm2 (Falcon)Thermo Fisher Scientific353108
Triton X-100Sigma-AldrichT87875:1000 dilution
Trypsine-EDTA (0,05 %) rouge de phénolThermo Fisher Scientific25300-0541X
Tween-20Sigma-AldrichP1379dilution 5:10000
Vitamine (100X)Thermo Fisher Scientific11120-037NRC full medium concentration finale = dilution 1:100
&mu ;-Slide 8 Well ibiTreat, IbidiClinisciences80826
Eclipse anti-décoloration Nikon

References

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