Obtention de microglies humaines à partir de tissus cérébraux humains adultes

Résumé

Ce protocole est une méthode efficace, rentable et robuste d’isoler les microglies primaires des tissus cérébraux vivants, adultes et humains. Les microglies humains primaires isolés peuvent servir d’outil pour étudier les processus cellulaires dans l’homéostasie et la maladie.

Résumé

Les microglies résident les cellules immunitaires innées du système nerveux central (SNC). Les microglies jouent un rôle essentiel pendant le développement, dans le maintien de l’homéostasie, et pendant l’infection ou les blessures. Plusieurs groupes de recherche indépendants ont mis en évidence le rôle central que jouent les microglies dans les maladies auto-immunes, les syndromes autoinflammatoires et les cancers. L’activation de la microglie dans certaines maladies neurologiques peut participer directement aux processus pathogènes. Les microglies primaires sont un outil puissant pour comprendre les réponses immunitaires dans le cerveau, les interactions cellule-cellule et les phénotypes dysrégulés de microglie dans la maladie. Les microglies primaires imitent mieux les propriétés microgliales in vivo que les lignées cellulaires microgliales immortalisées. Les microglies adultes humains présentent des propriétés distinctes par rapport aux microglies foetales et rongeurs humaines. Ce protocole fournit une méthode efficace pour l’isolement des microglies primaires du cerveau humain adulte. L’étude de ces microglies peut fournir des informations critiques sur les interactions cellule-cellule entre les microglies et d’autres populations cellulaires résidentes dans le SNC, y compris les oligodendrocytes, les neurones et les astrocytes. En outre, les microglies de différents cerveaux humains peuvent être cultivées pour la caractérisation des réponses immunitaires uniques pour la médecine personnalisée et une myriade d’applications thérapeutiques.

Introduction

Le système nerveux central (SNC) est construit à partir d’un réseau complexe de neurones et de cellules gliales¹. Parmi les cellules gliales, les microglies fonctionnent comme les cellules immunitaires innées du SNC^2,3. Les microglies sont responsables du maintien de l’homéostasie dans le SNC⁴en bonne santé . Les microglies jouent également un rôle important dans le neurodéveloppement, en élaguant les synapses². Les microglies sont au cœur de la pathophysiologie de plusieurs maladies neurologiques, y compris, mais pas limitée à; Maladie d’Alzheimer⁵, maladie de Parkinson⁶, ACCIDENT VASCULAIRE CÉRÉBRAL⁷, Sclérose en plaques⁸, lésion cérébrale traumatique⁹, douleur neuropathique¹⁰, lésions de la moelle épinière¹¹ et tumeurs cérébrales telles que les gliomes¹².

Les études liées à l’homéostasie et aux maladies du SNC utilisent des microglies de rongeurs en raison d’une pénurie de protocoles d’isolement des microglies primaires humaines efficaces et rentables¹³. Les microglies de rongeurs ressemblent à des microglies humaines primaires dans l’expression de gènes tels que Iba-1, PU.1, DAP12 et M-CSF récepteur et ont été efficaces dans la compréhension normale ainsi que le cerveau malade¹³. Fait intéressant, l’expression de plusieurs gènes immunitaires connexes tels que TLR4, MHC II, Siglec-11 et Siglec-3 varie entre les microglies humaines et les rongeurs¹³. L’expression de plusieurs gènes varie également dans l’expression temporelle et dans les maladies neurodégénératives chez les deux espèces^14,15. Ces différences significatives font de la microglie humaine un modèle essentiel pour étudier la fonction de microglie dans l’homéostasie et la maladie. La microglie humaine primaire peut également être un outil efficace pour le dépistage préclinique des candidats potentiels¹⁶. Les raisons mentionnées ci-dessus soulignent le besoin croissant de protocoles rentables pour l’isolement des microglies humaines primaires.

Nous avons développé un protocole pour l’isolement de la microglie humaine primaire du tissu humain adulte de cerveau recueilli à la suite de la fenêtre chirurgicale créée pour les résections de tumeur ou d’autres résections chirurgicales. La méthode ici est considérablement différente des méthodes existantes. Nous avons pu isoler et culturer des microglies après un temps de transit d’environ 75 minutes entre le site de collecte des tissus et le début du protocole d’isolement en laboratoire. Nous avons utilisé le supernatant des cellules fibroblastiques L929 pour favoriser la croissance de microglies isolées. Cette méthode se concentre spécifiquement sur la culture et le développement de microglies primaires seulement. La culture qui en résulte est d’environ 80% de microglies. Alors que d’autres protocoles fournissent une culture enrichie de microglies par centrifugation gradient de densité, cytométrie de flux et perles magnétiques, le protocole est un moyen rapide, simple, robuste et rentable à la culture primaire microglie humaine^17,18,19,20. La capacité d’utiliser le tissu cérébral adulte vivant enlevé chirurgicalement au lieu des tissus fixes du cerveau des cadavres prouve un avantage supplémentaire de cette méthode contrairement aux procédures existantes^18,21.

Protocole

Tous les tissus ont été acquis après l’autorisation éthique des comités d’éthique de l’Institut indien de technologie Jodhpur et de l’Institut indien des sciences médicales (AIIMS) Jodhpur.

1.Acquisition et traitement de tissus (Jour 0)

1. Recueillir le tissu dans un tube de 50 ml contenant 10 ml de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) (2 mM CaCl₂•2H₂O, 10 mM glucose, 3 mM KCl, 26 mM NaHCO₃, 2,5 mM NaH₂PO₄, 1 mM MgCl₂•6H₂O, 202 mM saccharose)²⁰. Assurez-vous que le tube est conservé sur la glace si le tissu doit être transféré à un autre endroit.
   REMARQUE : Préparer l’ACSF dans de l’eau distillée autoclavée. Filtrez-le avec un filtre à seringues de 0,22 μm dans le capot laminaire. Ceci peut être stocké pendant 1 mois à 4 °C.
2. Essuyez soigneusement le tube de collecte avec 70 % d’alcool et transférez-le dans une chambre à écoulement d’air laminaire aseptique.
3. Jetez soigneusement l’aCSF et pesez les tissus dans un état aseptique. Le poids des tissus est essentiel pour calculer le volume de trypsin-EDTA nécessaire pour les étapes suivantes.
4. Gardez le tissu dans l’aCSF frais chaud à 37 °C pendant 5 minutes. Cette étape est essentielle pour éviter la mort cellulaire.
5. Jeter l’aCSF et laver les tissus une fois avec 1x PBS (saline tamponnée de phosphate) à 37 °C. Assurez-vous que tout le sang est lavé avec des lavages répétés PBS (au besoin).
6. Incuber le tissu dans un PBS chaud, à 37 °C, pendant 5 min.
7. Jeter pbs soigneusement et transférer le tissu dans une boîte de Pétri stérilisée. PBS peut être enlevé avec une pipette. Cela permettra d’éviter toute perte de tissu.
8. Couper le tissu en petits morceaux (au moins 1 mm³⁾à l’aide d’un scalpel stérile. Les tissus finement coupés en dés fournissent une surface supérieure des tissus pour la dissociation des tissus par la trypsin-EDTA assurant un rendement plus élevé.
9. Transférer le tissu en dés dans un tube de 50 ml contenant 10 ml/g de tissu de 0,25 % de trypsin-EDTA et mélanger en pipeting à travers une pipette sérologique de 10 mL. Ajouter 2 mL de trypsin/EDTA dans une boîte de Pétri et laver soigneusement la plaque à l’aide de la pipette. Ajoutez cette trypsin au tube de faucon. Cela minimise la perte de tissus et de cellules pendant le dés.
10. Incuber le tube sur un shaker pendant 30 minutes à 37 °C à 250 tr/min. Cette étape augmente la dissociation des cellules des tissus.
11. À la fin de l’incubation, ajouter 10 mL de milieu neutralisant (50% DMEM/50% F12 avec de la glutamine, 1% de pénicilline-streptomycine, 10% FBS) pour neutraliser la trypsine. Mélanger avec une pipette sérologique de 10 mL. La quantité de supports neutralisants ajoutées doit être égale à la quantité de trypsine utilisée.
12. Centrifuger le tube à 2 000 x g à 4 °C pendant 10 minutes.
13. Jeter le supernatant et re-suspendre le granulé dans 1 mL de milieu de culture (50% DMEM/50% F12 avec de la glutamine, 1% de pénicilline-streptomycine, 20% L929 supernatant, 10% FBS).
    NOTE : Les cellules L929 sont de culture dans DMEM (DMEM avec glutamine, 1% pénicilline-streptomycine, 10% FBS). La méthode de culture recommandée par l’ATCC doit être suivie pour la culture cellulaire. Le superflu doit être prélevé dans la fiole de culture qui est d’au moins 75% confluent. Il peut être collecté en vrac et stocké à -80 °C pour prévenir la dégradation des facteurs de croissance. Il est recommandé d’ajouter le supernatant L929 séparément dans des flacons au lieu d’ajouter au milieu de culture de stock.
14. Plaquez les cellules dans une fiole T-25, adaptée aux cellules adhérentes, et ajoutez 4 ml de milieu de culture supplémentaire. Incuber la fiole à 37 °C avec 5% de CO₂. Secouez soigneusement la fiole pour disperser homogènement le tissu. Évitez d’amener le milieu au cou de la fiole, tout en secouant, car cela peut augmenter les risques de contamination.

2.Culture cellulaire (Jour 2)

1. Recueillir les supports de la fiole de culture T-25 préparée le jour 0 dans trois tubes de centrifugeuse de 1,5 mL en recueillant un volume égal de supports dans chaque tube. Laver la fiole une fois avec 1 x PBS. Agiter doucement la fiole pour enlever les fragments de tissu restants laissés. Évitez les secousses sévères de la fiole car les fragments de reste n’affecteront pas négativement la culture. Ajoutez 5 mL de supports de culture fraîche à la fiole.
2. Centrifuger le support collecté à 1 466 x g (4000 tr/min) à 4 °C pendant 4 minutes.
3. Jeter le supernatant de chaque tube et ajouter 1 ml de milieu de culture à l’un des tubes. Bien mélanger avec la pipette. Ajoutez en série les supports mixtes avec des cellules à d’autres tubes. Mélanger soigneusement avec la pipette et mettre les cellules en commun dans un tube.
4. Plaquez les cellules dans une fiole T-25 séparée, adaptée aux cellules adhérentes. Ajouter 4 ml de milieu de culture et incuber la fiole à 37 °C avec 5% de CO₂.

3.Culture cellulaire (Jour 4)

1. Jetez les supports des deux flacons et ajoutez 5 ml de supports culturels frais à la fiole.
2. Incuber la fiole à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 2 jours.

4. Culture cellulaire (Jour 6)

1. Les cellules seront prêtes pour d’autres expériences.

Résultats

En utilisant le protocole mentionné ci-dessus (Figure 1), nous avons été en mesure d’isoler les microglies humaines primaires des tissus cérébraux vivants réséqués chirurgicalement. Les cellules cultivées ont été tachées de ricinus communis agglutinine-1 (RCA-1) lectine pour microglie (vert) et avec des protéines acides fibrillaires gliales (GFAP) pour les astrocytes (rouge) (Figure 2) comme décrit précédemment

Discussion

Microglie assurer l’homéostasie dans le cerveau normal et jouer un rôle central dans la pathophysiologie de diverses maladies neurologiques⁴. Les microglies sont au cœur du neurodéveloppement et de la formation des synapses². Les études microgliale se sont avérées essentielles dans la compréhension du développement et de la progression de diverses maladies neurologiques⁴. Les microglies de rongeurs sont le modèle de choix prédominant pour les études ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution antibiotique-antimycosique	Himedia	A002
Chlorure de calcium	Sigma	223506
Centrifugeuse (4 ° ; C)	Sigma	146532
Tubes à centrifuger	Abdos	P10203
CO2 incubateur	New Brunswik	Galaxy 170 S
D-Glucose		Himedia GRM077
DMEM milieu avec glutamine	Himedia	AL007S
Sérum fœtal bovin	Himedia	RM9955
Flacon tube (50 ml)	Thermo Fsiher Scientific  ;	50CD1058
Fluorescéine Ricinus communis agglutinin-1	Vecteur	FL-1081
Microscope fluorescent	Leica	DM2000LED
Fluoroshield avec DAPI	Sigma	F6057
Anticorps GFAP	GA5	3670S
Agitateur d’incubateur	New Brunswik Scientific	Innova 42
L929 lignée cellulaire	ATCC	NCTC clone 929 [cellule L, L-929, dérivé de la souche L] (ATCC  ; CCL-1)
Flux d’air laminaire	Thermo Fsiher Scientific  ;	1386
Chlorure de magnésium	Himedia	MB040
Phosphate monosodique	Merck	567545
Mélange de nutriments F-12 Jambon Moyen	Himedia	Al106S
Boîte de Pétri	Duran Groupe	237554805
Saline tamponnée	au phosphate Himedia	ML023
Chlorure	de potassiumHimedia	MB043
Pipette sérologique	Matériel de laboratoire	LW-SP1010
Bicarbonate de sodium	Himedia	MB045
Saccharose	Himedia	MB025
Filtre à seringue (0,2&mu ;, 25 mm de diamètre)	Axiva	SFPV25R
T-25 Fioles de culture tissulaire adaptées à la culture cellulaire adhérente.	Himedia	TCG4-20X10NO
Trypsine-EDTA (0,25 %)	Gibco  ;	Référence 25200-056