Un modèle murin d’exposition foetale à l’inflammation maternelle pour étudier les effets de la chorioamnionite aiguë sur le développement intestinal nouveau-né

Les membranes chorioniques jouent un rôle essentiel dans la grossesse chez les mammifères. Ils comprennent le chorion et l’amnion, qui servent de multiples fonctions. Ils entourent et protègent le foetus, facilitent la signalisation paracrine entre les compartiments maternel et fœtal^1,et créent des boucles de rétroaction locales dans les membranes chorioniques, qui peuvent être impliquées dans l’initiation de la parturition¹. La compréhension actuelle des membranes indique que l’amnion fournit la fonction structurale de barrière, et le chorion fournit un tampon immunologique principalement pour protéger le foetus en développement du système immunitaire maternel^2. L’inflammation de ces membranes est connue sous le nom de chorioamnionite. Historiquement, le diagnostic de chorioamnionitis clinique a été fait suivant la présence de la fièvre maternelle plus un ou plusieurs résultats cliniques foetaux ou^{maternels 3,4.} Cependant, bien que cette définition soit cliniquement utile, son manque de précision a rendu la recherche sur la chorioamnionite difficile. En 2015, dans le but de clarifier le diagnostic, un atelier d’experts de l’Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Human Development a défini la chorioamnionite comme une inflammation intra-utérine, ou une infection, ou les deux (triple I)³. Cette clarification est importante parce que tandis que l’infection induite microbienne est une cause importante de l’inflammation utérine/amniotique, elle se produit moins généralement que l’inflammation utérine/amniotique^{stérile 5,6,7.} Dans l’ensemble, la chorioamnionite reste un problème de santé publique important, comme on le voit dans 2\u20124% des accouchements à terme et 25\u201230% des accouchements prématurés^8,9.

Chorioamnionitis peut avoir des effets significatifs sur le foetus et le nouveau-né. Il a été bien documenté dans la littérature que chorioamnionitis est associé au risque accru de beaucoup des morbidités de la prématurité, y compris la dysplasie bronchopulmonaire^10,dommages cérébraux de matière blanche^11,hémorragie intraventriculaire^12,rétinopathie de la prématurité¹³, et à la fois suspecté et confirmé sepsis néonatal de début^{tôt 14,15}. Comme nous nous intéressons aux mécanismes de blessure et de réparation du tractus intestinal immature, il est important de noter que la chorioamnionite est également associée au développement ultérieur de l’entérocolite nécrosante (NEC)^15,16. Nec est une maladie gastro-intestinale dévastatrice des enfants en bas âge prématurés qui a comme conséquence une réponse dysregulated d’hôte à l’inflammation et à la nécrose intestinale^{suivante 17.} Chaque année, nec affecte plus de 4000 nourrissons aux États-Unis, et jusqu’à un tiers de ces nourrissons meurent de la maladie¹⁸. La pathogénie de NEC implique probablement une combinaison de l’immaturité intestinale, de la dysrégulation du système immunitaire immature, de l’inflammation intestinale, et de la translocation^{bactérienne 19,}culminant dans une voie commune finale de nécrose intestinale. Fait important, le début du NEC se produit souvent des semaines après la naissance et l’exposition potentielle à la chorioamnionitis, rendant le lien mécaniste entre chorioamnionitis et développement suivant de NEC^{peu clair 20.} Un mécanisme potentiel par lequel la chorioamnionite peut contribuer à la pathophysiologie de NEC est par la déréglementation du système immunitaire maternel, produisant plus tard une réponse inflammatoire foetale forte qui peut perturber les modèles développementaux foetaux^{normaux 21,22,23.}

Plusieurs modèles mammifères de chorioamnionite existent chez les rongeurs et les moutons^{24,25,26,27,28,29,30,31,32}. Cependant, peu de données existent concernant le développement du tractus intestinal au-delà de la période initiale du nouveau-né suivant l’exposition foetale induite par chorioamnionitis à l’inflammation maternelle (FEMI). Afin d’explorer la relation entre FEMI et le développement ultérieur des dommages du tractus intestinal immature, nous avons adapté le modèle fEMI lipopolysaccharide (LPS) induit. Les lipopolysaccharides sont un composant majeur de la surface extracellulaire sur les bactéries gram négatives et sont un puissant stimulant du système immunitaire inné de multiples espèces eucaryotes, y compris les^{humains 33}. L’injection maternelle de LPS a comme conséquence une cascade inflammatoire stérile sans les effets confusionnels des bactéries vivantes, et c’est un modèle bien établi pour l’induction de la naissance prématurée^34,aussi bien qu’un modèle de chorioamnionitis aiguë et du syndrome foetal de réponse inflammatoire (FIRS), qui est la forme la plus grave de chorioamnionitis^24,35. Il a également été démontré qu’il induit à la fois des lésions cérébrales de matière blanche et grise dans un modèle^{de mouton 36} et un modèle murin^37,38,39,40. Cependant, à notre connaissance, nous sommes les premiers à utiliser ce modèle de chorioamnionitis et FEMI pour étudier ses effets sur le développement du tractus gastro-intestinal après la naissance, ainsi que pour étudier un lien mécaniste possible entre chorioamnionitis et développement ultérieur de NEC^41,42.

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de l’Iowa (Protocole #8041401). Tous les animaux étaient logés dans un vivarium approuvé par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) à l’Université de l’Iowa. Toutes les souris étaient souches sauvages C57Bl/6J.

1. Établissement de femi chez les souris enceintes

1. Préparation LPS
   1. Utilisez le LPS dérivé d’Escherichia coli O55:B5 (concentration de stock 2 mg/mL).
   2. Diluer la concentration de stock de LPS 1:100 avec la solution saline stérile pour une concentration de travail de 20 μg/mL.
2. Injection maternelle de LPS
   1. Injecter des mères enceintes au jour de gestation e15. Ce point de temps est d’environ 75% par la grossesse murine, ce qui rend ce modèle développementairement similaire au début du troisième trimestre des grossesses humaines, qui est quand la majorité des naissances prématurées dues à la chorioamnionite se produisent.
   2. Pesez les souris enceintes immédiatement avant l’injection pour déterminer le dosage approprié du SLSP.
   3. Calculez la dose de concentration de travail en utilisant la formule suivante : 5 μL x gramme de poids corporel (gbw), pour une dose totale de LPS de 100 μg/kg. Pour les animaux de contrôle, utilisez un volume équivalent de solution saline normale pour l’injection.
   4. Vortex LPS solution trois fois pendant 15 secondes sur le haut avant chaque injection.
   5. Dessinez le volume LPS dans une seringue de 1 mL.
   6. Retenir la souris enceinte avec la technique de scruffing. Maintenez la position dorsale de la couchée et effectuez l’injection.
      1. Insérez une aiguille de calibre 30 de 8 mm qui se dénabère au-dessus du quadrant inférieur droit de l’abdomen (pour éviter les vaisseaux vésicaux et abdominaux) à un angle de 30\u201240°. Insérer environ 1/4 à 1/2 de la longueur de l’aiguille.
      2. Reculez sur le piston de seringue pour assurer une pression négative avant l’injection. Procéder à l’injection si une pression négative est présente.
      3. Après l’injection, surveiller les souris pendant environ 30 minutes, puis retourner dans des cages pour le reste de la grossesse.

2. Livraison et soin de la progéniture, et récolte intestinale

1. Livrer les chiots normalement par voie vaginale à e20.
   REMARQUE : Ce modèle a un taux de perte fœtale dépendant de la dose qui peut être vu à la figure 1 et qui est discuté dans les résultats ci-dessous.
2. Permettre aux chiots de rester avec les mères et de recevoir des aliments ad libitum.
3. Le jour de la récolte, généralement après le jour 14 (P14), euthanasier les petits par dislocation cervicale conformément aux protocoles du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.
4. À l’aide de ciseaux et de forceps, faire une incision verticale sur la ligne médiane de l’abdomen, à travers la peau et le péritoine, sur toute la longueur de l’abdomen. Exciser l’intestin grêle de l’estomac au cécu avec des ciseaux et enlever la mesenterie avec des forceps.
5. Isoler et garder le distal 1/3 de l’intestin grêle (section représentative de l’iléum humain), en jetant l’intestin grêle proximal, le cécu, et le côlon.
6. Diviser la portion d’iléum en deux à l’aide de ciseaux.
7. Placez la moitié proximale dans une solution de stabilisation de l’ARN pour une quantification ultérieure de l’ARN.
8. Placer la moitié distale dans une formaline tamponnée neutre à 10 % pour la préparation des diapositives.

3. Notation intestinale de blessure

1. Sectionz le tissu incorporé paraffine en tranches de 5 μm d’épaisseur et montez sur des glissières en verre.
   
   REMARQUE : Nous envoyons les spécimens à un noyau d’histologie pour l’intégration, la sectionne et le montage de paraffine sur des toboggans.
2. Déparaffiniser les diapositives selon les procédures standard.
3. Sections de tache avec l’hématoxyline et l’éosine selon les procédures standard.
4. Marquer des sections sur une échelle de 3 points pour les blessures intestinales comme décrit^{précédemment 42,43}.
   1. À l’aide d’une microscopie légère, évaluer les lésions intestinales généralisées par deux chercheurs aveugles distincts sur une échelle de 3 points évaluant l’intégrité et la séparation villus de la membrane^{du sous-sol 43} (Figure supplémentaire 1). Les dommages intestinaux sont mieux évalués au grossissement de 20x et à l’ouverture numérique 0.50.
   2. Attribuez un score de 0 pour décrire la muqueuse normale.
   3. Assignez une note de 1 décrire les blessures légères qui englobent le développement de l’espace subepithelial Gruenhagen, la vacuolisation ou le levage subepithelial limité à la propria lamina ou des pointes de villi.
   4. Attribuez une note de 2 pour décrire les blessures graves, indiquées par le levage épithélial et la vacuolisation supérieures à la moitié des villosités, la distorsion des villosités ou l’ulcération muqueuse et la désintégration des propria lamina.

4. Quantification des cellules de Paneth et de gobelet

1. Après la déparaffinisation, les glissements de tache des sections de tissu de l’étape 2.8 avec la tache bleue/périodique d’acide d’Alcian pour indiquer les cellules de gobelet et de Paneth comme^{précédemment décrit 44,45} selon les étapes suivantes.
   REMARQUE : Tandis que la tache bleue/périodique de Schiff d’acide d’Alcian n’est pas spécifique aux cellules de Paneth ou de gobelet, dans notre expérience, les investigateurs expérimentés aveuglés ont la quantification cellulaire équivalente utilisant cette tache comparée aux anticorps ciblés cellulaires, avec sensiblement moins de taches de fond^46.
2. Déparaffiner, tacher et déshydrater les diapositives comme suit.
   1. Submerger les toboggans en xylène pendant 10 min deux fois.
      AVERTISSEMENT : Xylene doit être employé dans un capot de fumée.
   2. Rincer à 100% EtOH.
   3. Submergez les glissières en 100 % EtOH pendant 3 min, puis en 90% EtOH pendant 3 min, suivies de 70% d’EtOH pendant 3 min, et enfin submergez les diapositives dans 50% EtOH pendant 3 min.
   4. Laver sous l’eau courante du robinet pendant 5 min.
      MISE EN GARDE : Éloignez la section de l’eau courante pour éviter la perte d’échantillon de tissu.
   5. Filtrez la solution de tache bleue alcienne avec un filtre à café standard.
   6. Taches glissées dans la tache bleue alcienne pendant 15 min, puis laver sous l’eau courante du robinet pendant 2 min.
   7. Diluer 1 mg d’acide périodique dans 200 mL d’eau distillée double. Submergez les glissières dans cette solution pendant 5 min. Ensuite, laver sous l’eau courante du robinet pendant 1 min.
   8. Tache avec le réaménagement de Schiff pendant 10 min. Laver sous l’eau courante du robinet pendant 5 min.
   9. Tacher les toboggans avec de l’hématoxyline pendant 1 min, puis laver sous l’eau courante du robinet pendant 2 min.
   10. Submergez-les dans de l’alcool acide (1 mL d’acide chlorhydrique mélangé à 99 mL de 70% d’EtOH) pendant 1 min.
   11. Submerger dans l’eau du robinet de Scott (concentration de 0,1 % de NaHCO_{3 dans} l’eau du robinet) pendant 1 min, puis laver sous l’eau courante du robinet pendant 1 min.
   12. Déshydratez les diapositives.
       1. Plongez chaque diapositive 10 fois dans 70% EtOH, puis plongez 10 fois dans 90% EtOH, et 10 fois dans 100% EtOH.
       2. Submergez les glissières dans 100% EtOH pendant 10 min, puis submergez deux fois en xylène frais pendant 3 min chacune.
   13. Placez une goutte de supports de montage sur le spécimen et placez un coverslip sur elle.
3. Comptage des cellules de gobelet
   1. À l’aide d’une microscopie légère, compter les cellules de gobelet(figure supplémentaire 2). Pour chaque morceau de tissu intestinal, comptez le nombre de cellules gobelet et 500 cellules épithéliales et le rapport express de cellules de gobelet comme rapport par 100 cellules épithéliales. Les cellules de gobelet sont mieux comptées au grossissement de 20x et à l’ouverture numérique 0.5.
4. Comptage des cellules de Paneth
   1. À l’aide d’une microscopie légère, compter les cellules de Paneth(figure supplémentaire 2). Pour chaque morceau de tissu intestinal, exprimer comme un rapport de cellules Paneth par crypte intestinale. Comptez 100 cryptes intestinales par morceau de tissu intestinal. Les cellules de paneth sont mieux comptées au grossissement de 20x-60x et à l’ouverture numérique 0.50-1.30.

L’exposition à l’IGF le jour embryonnaire 15 entraîne une perte de grossesse dépendante de la dose et un taux dépendant de la dose de travail prématuré (figure 1)42. Pour les expériences, nous avons choisi d’utiliser une dose de LPS de 100 μg/kg pour minimiser la perte de grossesse et la prématurité (perte de 50% entre la prématurité et la mort fœtale intra-utérine) tout en exposant les fœtus à une insulte inflammatoire significative.

En utilisant cette approche, nous avons ensuite examiné les effets de femi sur les dommages ultérieurs de la progéniture. En utilisant une échelle histologique en 3 points pour mesurer les lésions intestinales généralisées, nous avons constaté des blessures importantes à la naissance (P0) et à l’âge adulte (P56 ou 8 semaines de vie) (figure 2). Il est important de noter que cette blessure s’est produite en l’absence de tout stimulus supplémentaire pour les animaux autres que FEMI, suggérant que FEMI seul perturbe l’homéostasie normale du tractus intestinal murin nouveau-né. Comme la souris est née avec un intestin relativement immature qui continue de se développer au cours des 4 premières semaines devie 47,48, cela est pertinent pour les nourrissons prématurés qui ont également des voies intestinales immatures.

Pour mieux comprendre l’effet de l’IGF sur le développement normal de l’épithélium intestinal et sur les mécanismes de défense du tractus intestinal immature, nous avons quantifié le nombre de cellules gobelet productrices de mucine et de cellules paneth productrices de peptides antimicrobiens dans le tiers distal du petit tractus intestinal qui est semblable à l’iléum humain. Nous avons constaté que FEMI a perturbé la composition normale de l’épithélium intestinal en induisant la perte des cellules de gobelet et des cellules de Paneth comparées aux animaux sans FEMI (figure 3).

Pour étudier les effets de femi sur la réponse inflammatoire néonatale, utilisant ELISA avec l’électrochemiluminescence, nous avons quantifié une série de marqueurs inflammatoires de sérum, qui ont inclus IL-1β, IL-10, KC-GRO (l’équivalent murine d’IL-8), et IL-6, du sérum des chiots avec et sans FEMI (figure 4). Nous avons constaté que FEMI a augmenté de manière significative la cascade inflammatoire pour toutes les cytokines à P0. La cascade inflammatoire aux âges plus tard (P7\u2012P56) différait selon le point de temps et la cytokine. Plus intéressant encore, pour IL-6, il y avait des niveaux similaires à P7\u2012P28 dans le FEMI et les groupes factices, mais en dépit de l’aucune intervention secondaire, il y avait des niveaux sensiblement plus élevés dans le groupe FEMI à P56. Ceci est particulièrement important car nous avons démontré qu’IL-6 est une cytokine critique pour le développement des dommages intestinaux postnatals dans le modèle de FEMI.

Figure 1 : Effet de la dose femi sur les résultats de la grossesse. La survie des portées de grossesse dépend de la dose avec des doses plus élevées causant des taux plus élevés de perte de grossesse (A) et des taux plus élevés de naissance prématurée (B). Figure est adaptée avec la permission de Fricke et al42. FEMI utilisant une dose de LPS de 100 μg/kg crée une survie de 50% pour les chiots par une semaine de vie. Chaque point de données est représentatif d’un n > 8 grossesses et d’au moins trois expériences individuelles. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Effet de l’IGF sur les petits modèles de blessures intestinales distales au fil du temps. Des échantillons intestinaux ont été prélevés à la naissance, 1 semaine de vie, 2 semaines de vie et 8 semaines de vie chez des souris exposées à l’IGF (100 μg/kg de LPS) ou à un faux contrôle. Des échantillons ont été notés à l’aide d’une échelle de blessures de 3 points par desenquêteurs aveugles 42,43. FEMI seul sans autre insulte induit quantité significative de blessures à la naissance, 1 semaine de vie, et à 8 semaines de vie. Figure a été adaptée avec la permission de Fricke et coll.42. Chaque point de données est représentatif d’un n > 10 petits et d’au moins trois expériences individuelles d’au moins 3 mères enceintes. Les tests T non paramétriques Mann-Whitney ont été utilisés pour comparer les scores des blessures intestinales à chaque point de temps. L’astérisque indique p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : L’IGF induit des altérations des quantités normales de gobelet et de cellules paneth dans l’intestin grêle pendant le développement. Des échantillons intestinaux ont été prélevés à la naissance, 1, 2, 4 et 8 semaines de vie chez des souris exposées à femi (100 μg/kg LPS) ou à un faux contrôle. Des échantillons ont été tachés avec la tache bleue/périodique de Schiff d’acide d’Alcian pour détecter les cellules de gobelet et de Paneth et ceux-ci ont été quantifiés par un investigateur aveuglé. Les cellules de gobelet et les cellules de Paneth des animaux avec FEMI ont montré une tendance ou une diminution significative comparée aux contrôles simulés à tous les âges. Figure adaptée avec la permission d’Elgin et coll.41. Chaque point de données est représentatif d’un n > 10 chiots et d’au moins trois expériences individuelles. Les barres d’erreur représentent l’erreur standard de la moyenne. Les tests T des élèves ont été utilisés pour comparer les quantités de gobelet et de cellules Paneth à chaque point de temps. L’astérisque indique p < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : FEMI induit une poussée inflammatoire néonatale globale pour toutes les cytokines immédiatement après naissance à P0, avec une poussée tardive d’IL-6 à P56. Les cytokines sériques ont été quantifiées à P0, P7, P14 et P28 à l’aide d’ELISA avec électrochimiluminescence selon les instructions du fabricant, et les plaques ont été lues à 620 nm. Les valeurs de cytokine sont représentées ici dans une parcelle radar, et toutes les cytokines sont tracées comme pourcentage de valeur maximale. Il y a eu des augmentations significatives de toutes les cytokines (IL-1β, IL-10, KC-GRO et IL-6) à P0 dans le groupe FEMI par rapport au groupe témoin (tous p < 0,05). Il y a également eu une augmentation résurgence des niveaux d’IL-6 chez P56 chez les chiots avec FEMI par rapport à aucun FEMI (p < 0,05 par les essais non paramétriques kruskal-wallis), qui était la seule cytokine qui a été significativement élevée dans le groupe FEMI par rapport au contrôle à ce moment tardif. Figure adaptée avec la permission d’Elgin et coll.41. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 1 : Notation intestinale de dommages du tissu iléal souillé de H&E. Les scores de blessure sont déterminés par une échelle de notation intestinale de dommages de trois points (0=normal, 1=blessure douce, 2=blessure grave) basée sur le degré de vacuolization de villi, ulcération muqueuse, dommages de propria de lamina, et présence de l’hémorragie dans les villosités commeprécédemment décrit 43. Figure adaptée avec la permission d’Elgin et coll.41. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Figure supplémentaire 2 : Apparition représentative de la coloration Alcian Blue/PAS des cellules de gobelet et de Paneth. La coloration Alcian Blue/PAS des tissus intestinaux permet une visualisation claire des cellules de gobelets, présentes dans les villosités intestinales (panneau supérieur marqué de flèches blanches, image prise au grossissement 20x), et des cellules de Paneth, présentes dans les cryptes de Lieberkuhn, situées sous les villosités intestinales dans la propria lamina (panneau inférieur marqué de flèches jaunes, image prise à 60x grossissement). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.